一種控釋型酵母細(xì)胞微膠囊產(chǎn)品及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種制備控釋型酵母細(xì)胞微膠囊的方法，涉及到酵母細(xì)胞的培養(yǎng)、處理、微膠囊制備及封孔修飾的方法，更進(jìn)一步涉及通過該方法所制備的微膠囊壁材和微膠囊產(chǎn)品。
【背景技術(shù)】
[0002]微膠囊技術(shù)將固體、液體或氣體(芯物質(zhì))包裹在另一種材料(壁材)中，能夠保護(hù)芯物質(zhì)免受環(huán)境影響并控制芯物質(zhì)釋放，是食品、香料、醫(yī)藥、農(nóng)藥等工業(yè)領(lǐng)域重點(diǎn)開發(fā)的高新技術(shù)之一。包封率和突釋率是評價微膠囊制劑的兩個最重要的指標(biāo)，也是限制其廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)問題。壁材的選擇決定著所制備微膠囊產(chǎn)品的優(yōu)劣，解決制備成本過高和壁材及輔助料的安全性問題是微膠囊研宄中急需解決的問題。乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)以其優(yōu)良的安全性、生物相容性和生物降解性在近年來的微膠囊研宄中備受關(guān)注，但影響此類微膠囊質(zhì)量的因素較多，除受芯物質(zhì)、壁材本身理化性質(zhì)的影響外，制備方法對微膠囊的外觀、粒徑、包埋度、包封率和釋放性能等方面也有重要影響。此外，其親脂性強(qiáng)，對水溶性物質(zhì)的親和力不高。
[0003]酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜構(gòu)成的雙層囊腔結(jié)構(gòu)是包埋物質(zhì)的良好材料，酵母細(xì)胞微膠囊具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):(I)酵母細(xì)胞微膠囊顆粒大小均勻，芯物質(zhì)包埋到酵母細(xì)胞中后，能夠受到酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的雙重保護(hù)；(2)微膠囊化過程簡單，不涉及任何有毒的試劑；(3)只要遇到潮濕的黏膜，芯物質(zhì)便能持續(xù)地釋放出來而不需破壁。
[0004]突釋是指微膠囊制劑在24小時內(nèi)大量釋放芯物質(zhì)的現(xiàn)象。微粒表面的孔隙率和內(nèi)部的致密度與突釋效應(yīng)直接相關(guān)。酵母細(xì)胞微膠囊具有原料易得、價廉、對人類和生態(tài)環(huán)境安全等特點(diǎn)，通過對酵母細(xì)胞進(jìn)行透性改造后，其對小分子物質(zhì)的包埋性能得到了顯著提高。由于芯物質(zhì)進(jìn)入酵母細(xì)胞內(nèi)主要是通過擴(kuò)散進(jìn)行的，孔徑越大，芯物質(zhì)越容易進(jìn)入到酵母細(xì)胞內(nèi)部，但同時也越容易從酵母細(xì)胞中逸出。為此，需要一種對酵母細(xì)胞微膠囊進(jìn)行封孔修飾，控制芯物質(zhì)釋放的方法。
[0005]酵母細(xì)胞表面帶有負(fù)電荷，可以與帶正電荷的陽離子聚合物之間通過靜電作用、氫鍵及疏水作用等形成多聚電解質(zhì)，從而在酵母細(xì)胞微膠囊表面復(fù)合一層陽離子聚合物膜，進(jìn)而調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞的孔隙結(jié)構(gòu)，控制酵母細(xì)胞微膠囊的釋放性能，減少芯物質(zhì)的突釋現(xiàn)象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的技術(shù)原理是利用酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜對芯物質(zhì)進(jìn)行包埋后，再利用其表面帶有的負(fù)電荷與帶正電荷的陽離子聚合物之間通過靜電作用、氫鍵及疏水作用等形成多聚電解質(zhì)，實(shí)現(xiàn)酵母細(xì)胞微膠囊的封孔修飾，通過控制膜厚度達(dá)到控制酵母細(xì)胞微膠囊釋放的目的。
[0007]因此，本發(fā)明第一個目的是提供一種制備酵母細(xì)胞微膠囊壁材的方法，既能用于脂溶性物質(zhì)包埋又能用于水溶性芯物質(zhì)的微膠囊化，包括:
[0008](I)采用酵母細(xì)胞為出發(fā)菌株，經(jīng)斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)；
[0009](2)將所得的酵母細(xì)胞離心，洗滌后，冷凍干燥或重新懸浮在具有促進(jìn)酵母細(xì)胞自溶的化學(xué)試劑中，在40?60°C的溫度下進(jìn)行振蕩處理24?48小時。離心、洗滌后，再在20?40°C的溫度下以氫氧化鈉溶液處理24?48小時，離心、洗滌后，冷凍干燥即得到所述的微膠囊壁材。其中所述的化學(xué)試劑任一選自吐溫-80或TritonX-100、溴化十六烷基三甲基銨、十二烷基硫酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、乙二胺四乙酸鈉(EDTA)、二硫蘇糖醇(DTT)、氯化鉀及氯化鈉。
[0010]應(yīng)當(dāng)指出:加入化學(xué)試劑的作用在于促進(jìn)酵母細(xì)胞自溶，如果加入高濃度的化學(xué)試劑則反應(yīng)時間更短，如果加入低濃度的化學(xué)試劑則反應(yīng)時間更長。因此在合適的濃度范圍內(nèi)，加入不同濃度的化學(xué)試劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以通過控制時間長短來達(dá)到預(yù)期效果。
[0011]在一個具體實(shí)施方案中，所述的吐溫-80的加入重量為0.1?5% ;或
[0012]所述的TritonX-1OO的加入重量為0.1?5% ;或
[0013]所述的溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)的加入重量為0.1?5% ;或
[0014]所述的十二烷基硫酸鈉的加入重量為0.1?5% ;
[0015]所述的鹽酸的加入重量為0.5?10% ;或
[0016]所述的氫氧化鈉的加入重量為0.5?10% ;或
[0017]所述的乙醇的加入重量為I?20% ;或
[0018]所述的EDTA的加入重量為I?10% ;或
[0019]所述的DTT的加入重量為0.05?0.5% ;
[0020]所述的氯化鈉的加入重量為I?20% ;或
[0021]所述的氯化鉀的加入重量為I?20%。
[0022]在另一個具體實(shí)施方案中，搖瓶培養(yǎng)的步驟如下:斜面種子活化4小時后接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時后再按10%的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵時間24小時，發(fā)酵溫度28-32°C，轉(zhuǎn)速180r/min。
[0023]在一個具體實(shí)施方案中，所述的菌株為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeHan.)，斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基為高糖培養(yǎng)基，組成為:蔗糖、酵母浸出物、無機(jī)氮源采用中心組合設(shè)計優(yōu)化，再補(bǔ)充必要的礦物質(zhì)。
[0024]在另一個具體實(shí)施方案中，所述的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為YPD培養(yǎng)基，組成如下:蛋白胨20.0g、酵母提取物10.0g、葡萄糖10.0g、添水至lOOOmL，pH4_5。
[0025]在另一個具體實(shí)施方案中，所述的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為產(chǎn)脂培養(yǎng)基，組成如下:蛋白胨3.0g、酵母提取物8.0g、鹿糖170.0g、添水至1000mL。
[0026]還在另一個具體實(shí)施方案中，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基都為豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基，配制如下:取黃豆芽200.0g，洗凈，放入水中煮沸30min，用紗布過濾，取豆芽汁加蔗糖30.0g,添水至 100mL,調(diào)節(jié) pH = 7.2。
[0027]在另一個具體實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞處理的步驟如下:培養(yǎng)的酵母細(xì)胞離心、洗滌后，冷凍干燥。
[0028]還在另一個具體實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞處理的步驟如下:培養(yǎng)的酵母細(xì)胞離心、洗滌后，重新懸浮于0.05?20%的化學(xué)試劑中，在40?60°C下處理24?48小時。離心、洗滌后，再在20?40°C的溫度下以0.1?10%的氫氧化鈉處理24?48小時，離心、洗滌后，冷凍干燥。
[0029]本發(fā)明的第二個目的是提供利用所制備的微膠囊壁材制備微膠囊的方法，包括:
[0030]步驟(1)-(2)，與前述相同；
[0031](3)將凍干后的酵母細(xì)胞微膠囊壁材與待包埋的芯物質(zhì)如抗氧化劑、殺蟲劑或除草劑溶液在20?40°C的溫度下高頻度接觸24?48小時進(jìn)行微膠囊化處理；
[0032](4)如果需要，采用高效液相色譜法測定微膠囊中芯物質(zhì)的含量。
[0033]其中，包埋度定義(下同):包埋度(％)=實(shí)際包埋量/微膠囊重量X 100%
[0034]高頻度接觸定義(下同):以可以實(shí)現(xiàn)溶液組分充分混和的轉(zhuǎn)速進(jìn)行振蕩的頻度。本領(lǐng)域公知的轉(zhuǎn)速50rpm/min以上或加壓2MPa以上，例如50?75rpm/min、75?200rpm/min、或200rpm/min以上的振蕩頻度。
[0035]在一個具體實(shí)施方案中，利用所述的壁材制備微膠囊的步驟如下:將Ig酵母細(xì)胞與I?20mL I %的芯物質(zhì)溶液在20?40°C的溫度下高頻度接觸進(jìn)行包埋。24小時后取出，離心、洗滌除去表面未包埋的芯物質(zhì)，冷凍干燥。
[0036]在另一個具體實(shí)施方案中，所述的芯物質(zhì)為1%殺蟲劑阿維菌素，所述的溶液為乙醇溶液。
[0037]在另一個具體實(shí)施方案中，所述的芯物質(zhì)為1%的除草劑精喹禾靈，所述的溶液為乙醇溶液。
[0038]在另一個具體實(shí)施方案中，所述的芯物質(zhì)為0.2%的除草劑二氯喹啉酸，所述的溶液為乙醇溶液。
[0039]在另一個具體實(shí)施方案中，所述的芯物質(zhì)為I %的水溶性抗氧化劑綠原酸，所述的溶液為水溶液。
[0040]在另一個具體實(shí)施方案中，所述的芯物質(zhì)為I %的脂溶性抗氧化劑白藜蘆醇，所述的溶液為乙醇溶液。
[0041]本發(fā)明的第三個目的是提供對酵母細(xì)胞微膠囊進(jìn)行封孔修飾制備控釋型微膠囊的方法。包括:
[0042]步驟(1)_(3)，與前述相同；
[0043](4)將酵母微膠囊壁材與芯物質(zhì)溶液高頻度接觸所得微膠囊與陽離子聚合物溶液在20?40°C的溫度下高頻度接觸24?48小時進(jìn)行封孔修飾，離心、洗滌后，冷凍干燥即得控釋型酵母細(xì)胞微膠囊產(chǎn)品。
[0044](5)如果需要，采用高效液相色譜法測定微膠囊中芯物質(zhì)的含量。
[0045]在一個具體實(shí)施方案中，所述的陽離子聚合物為高分子量殼聚糖(CS，分子量為?
1.5X 105，脫乙酰度>90%，浙江玉環(huán)化工廠)，所述的溶液為1% HAc溶液。
[0046]在另一個具體實(shí)施方案中，微膠囊的封孔修飾步驟如下:在Ig酵母細(xì)胞與I?20mL I %的阿維菌素乙醇溶液在20?40°C的溫度下高頻度接觸24小時完成包埋后，加入高分子量殼聚糖(分子量為?1.5X105，脫乙酰度>90%，浙江玉環(huán)化工廠)溶液使其最終濃度為0.1?2%，繼續(xù)高頻度接觸24小時，離心，用水洗滌除去表面未包埋的阿維菌素和多余的殼聚糖后，冷凍干燥。
[0047]本發(fā)明的第四個目的