[0048] (2)向上述活化好的瓊脂糖微球中加入300mg重組蛋白A，于pH 9. 0-11. 0條件下 反應20h，依次用200mL IM NaCl溶液和大量水沖洗抽干，即得偶聯(lián)有SPA的材料；
[0049] (3)將偶聯(lián)有SPA的材料加入到50mL三角瓶中，加入IOmL lmol/L的乙醇胺溶液 (pH 9. 0)，37°C條件下反應6h。先后再用pH 4. 0的醋酸緩沖液、pH 8. 0的Tris緩沖液沖 洗、IM NaCl溶液沖洗，最后用大量去離子水沖洗，即得蛋白A免疫吸附劑。
[0050] 2、輔助吸附劑--IgG吸附劑的合成
[0051] (1)量取IOmL沉降體積的Sepharose 4FF凝膠微球，用20倍體積的去離子水沖 洗，抽干。將溶液轉移到50mL磨口三角瓶中，加入IOmL 0.1 M的NaIO4溶液，室溫反應2h。 用大量水沖洗抽干，即得活化的瓊脂糖微球載體；
[0052] (2)向上述活化好的瓊脂糖微球載體中加入30mg IgG，于pH 7. 0條件下反應12h， 依次用200mL IM NaCl溶液和大量水沖洗抽干，即得偶聯(lián)有IgG的材料；
[0053] (3)向偶聯(lián)有IgG的材料中加入少量NaBH4進行還原反應4h，再先后用pH 4. 0的 醋酸緩沖液、pH 8. 0的Tris緩沖液沖洗、IM NaCl溶液沖洗，最后用大量去離子水沖洗，BP 得IgG吸附劑。
[0054] 3、裝柱
[0055] (1)先取2mL IgG吸附劑裝入帶隔離網(wǎng)的層析柱中，然后再小心加入3mL蛋白A免 疫吸附劑，即得吸附柱1號；
[0056] (2)取2mL IgG吸附劑與3mL蛋白A免疫吸附劑，兩者混合均勻后裝入層析柱中， 即得吸附柱2號。
[0057] 4、配基脫落檢測試驗
[0058] 取上述吸附柱1號和2號，先用生理鹽水以3mL/min流速預沖lh，然后取IOOmL生 理鹽水以2mL/min流速循環(huán)過柱，120min后，取生理鹽水作為檢測液檢測脫落蛋白A的量， 檢測采用ELISA定量法，同時做空白對照（取3mL蛋白A免疫吸附劑裝柱，同法操作）。檢 測結果見表1。
[0059] 表1配基脫落情況
[0060]
[0061] 從表1中可以看出，空白對照組蛋白A脫落量為800pg/mL，而吸附柱1和吸附柱2 的脫落量分別為65pg/mL和120pg/mL，脫落量降低約一個數(shù)量級，說明本實施例所提供的 組合型蛋白A免疫吸附柱能夠顯著減少吸附劑的配基脫落，大大降低了由于配基脫落而帶 來的安全風險。
[0062] 5、血漿吸附試驗
[0063] 先用至少5倍柱體積的平衡液（I XPBS、pH 7. 4)平衡上述吸附柱，再用至少5倍 柱體積的洗脫液（〇. 1Μ、ρΗ 2. 5甘氨酸溶液）沖洗柱子，再用至少5倍柱體積的平衡液平衡 柱子。取20mL血漿過柱，流速I. 7mL/min，過完血漿后先用平衡液洗去未結合蛋白，再用洗 脫液洗脫結合蛋白，收集洗脫峰，用紫外分光光度法檢測洗脫峰的蛋白濃度，計算吸附蛋白 的總質量，再據(jù)此計算單位體積的主吸附劑的吸附性能。
[0064] 表2吸附性能比較
[0066] 從表2中數(shù)據(jù)可以看出，空白對照組與實驗組相比，主吸附劑的吸附性能基本相 同，可見上述組合型吸附柱中輔助吸附劑的存在對于主吸附劑的吸附性能不會產(chǎn)生明顯影 響。
[0067] 實施例2
[0068] 本實施例提供一種組合型LDL免疫吸附柱及減少LDL免疫吸附柱的配基一一 "抗 人LDL抗體"脫落的方法。
[0069] 1、主吸附劑--抗人LDL抗體免疫吸附劑的合成
[0070] (1)量取IOmL沉降體積的Sepharose 4FF凝膠微球，用20倍體積的去離子水沖 洗，抽干。將溶液轉移到50mL磨口三角瓶中，加入2M的Na2CO3溶液10mL，lg/mL的CNBr乙 腈溶液lmL，室溫反應2min。沖洗抽干，即得活化的瓊脂糖微球載體；
[0071] ⑵向上述活化好的瓊脂糖微球中加入60mg抗人LDL抗體，于pH 8. 0-9. 0條件下 反應4h，沖洗抽干；
[0072] (3)轉移步驟2的產(chǎn)物至20mL封閉緩沖液中（1M乙醇胺溶液，pH 9. 0)，室溫反應 2h ；
[0073] (4)反應結束后依次用50mL乙酸緩沖液（0. 5M NaCl溶液+0.1 M乙酸鈉溶液，pH 4. 0)和50mL Tris緩沖液（0. 5M NaCl溶液+0.1 M Tris溶液，pH 8. 0)沖洗步驟（3)所得 物，至少重復三次，最后用大量去離子水沖洗，即得抗人LDL抗體免疫吸附劑。
[0074] 2、輔助吸附劑--LDL吸附劑的合成
[0075] (1)量取IOmL沉降體積的Sepharose 4FF凝膠微球，依次用體積分數(shù)為30 %、 50%、70%的二惡烷水溶液沖洗，最后用無水二惡烷沖洗三次并抽干。將其轉移到50mL磨 口三角瓶中，加入IOmL含0.1 M NHS(N-羥基丁二酰亞胺）與0.1 M DCC(二環(huán)己基碳二亞 胺）的二惡烷溶液，室溫反應2h。反應結束后將反應液分別用無水二惡烷和無水異丙醇沖 洗并抽干，即得活化的瓊脂糖微球載體；
[0076] (2)向上述活化好的瓊脂糖微球中加入20mg LDL，于pH 8. 0條件下反應2h，沖洗 抽干；
[0077] (3)轉移步驟2的產(chǎn)物至20mL封閉緩沖液中（1M乙醇胺溶液，pH 9. 0)，室溫下反 應2h，再沖洗抽干，即得LDL吸附劑。
[0078] 3、裝柱
[0079] (1)先取2mL LDL吸附劑裝入帶隔離網(wǎng)的層析柱中，再小心加入3mL抗人LDL抗體 免疫吸附劑，即得吸附柱1號；
[0080] (2)取2mL LDL吸附劑與3mL抗人LDL抗體免疫吸附劑，兩者混合均勻后裝入層析 柱中，即得吸附柱2號。
[0081] 4、配基脫落檢測
[0082] 取上述吸附柱，先用生理鹽水以3mL/min流速預沖lh，再取IOOmL生理鹽水以 2mL/min流速循環(huán)過柱，120min后，取生理鹽水作為檢測液檢測抗人LDL抗體的脫落量，檢 測采用ELISA定量法，同時做空白對照（取3mL抗人LDL抗體免疫吸附劑裝柱，同法操作）， 檢測結果見表3。
[0083] 表3配基脫落情況
[0085] 從表3中可以看出，空白對照組抗人LDL抗體脫落量為16ng/mL，而吸附柱1號和 吸附柱2號的脫落量分別為I. 4ng/mL和2. 6ng/mL，脫落量降低約一個數(shù)量級，說明本實施 例所提供的組合型吸附柱能夠顯著減少吸附劑的配基脫落，大大降低了由于配基脫落而帶 來的安全風險。
[0086] 以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實 施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存 在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。
[0087] 以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來 說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護 范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1. 一種組合型吸附柱，其特征在于，包括柱體以及填充在所述柱體內的主吸附劑及輔 助吸附劑，所述主吸附劑用于吸附血液中的目標物質，所述輔助吸附劑用于吸附所述主吸 附劑掉落的配基，且所述輔助吸附劑的配基來源于所述目標物質或其局部。2. 根據(jù)權利要求1所述的組合型吸附柱，其特征在于，所述主吸附劑的配基為蛋白質、 多肽或核酸。3. 根據(jù)權利要求2所述的組合型吸附柱，其特征在于，所述蛋白為金黃色葡萄球菌蛋 白A，所述輔助吸附劑的配基為IgG。4. 根據(jù)權利要求2所述的組合型吸附柱，其特征在于，所述蛋白為抗人LDL抗體，所述 輔助吸附劑的配基為LDL。5. 根據(jù)權利要求2所述的組合型吸附柱，其特征在于，所述蛋白為羊抗人IgG，所述輔 助吸附劑的配基為人IgG。6. 根據(jù)權利要求2所述的組合型吸附柱，其特征在于，所述蛋白為乙肝病毒抗體，所述 輔助吸附劑的配基為乙肝抗原。7. 根據(jù)權利要求2所述的組合型吸附柱，其特征在于，所述蛋白為丙肝適配子，所述輔 助吸附劑的配基為丙肝抗原。8. 根據(jù)權利要求1-7任一項所述的組合型吸附柱，其特征在于，所述柱體包括主吸附 區(qū)和輔助吸附區(qū)，所述主吸附區(qū)與所述輔助吸附區(qū)之間設有隔離網(wǎng)，所述主吸附劑設在所 述主吸附區(qū)內，所述輔助吸附劑設在所述輔助吸附區(qū)內。9. 根據(jù)權利要求1-7任一項所述的組合型吸附柱，其特征在于，所述主吸附劑與所述 輔助吸附劑在所述柱體內混合均勻。10. -種組合型吸附柱的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 將活化后的載體與第一配基偶聯(lián)，制備主吸附劑，所述第一配基用于吸附血液中的目 標物質； 將活化后的載體與第二配基偶聯(lián)，制備用于吸附所述第一配基的輔助吸附劑，所述第 二配基來源于所述目標物質或其局部； 將所述主吸附劑和所述輔助吸附劑裝入柱體中，得組合型吸附柱。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種組合型吸附柱及其制備方法。該組合型吸附柱包括柱體以及填充在所述柱體內的主吸附劑及輔助吸附劑，所述主吸附劑用于吸附血液中的目標物質，所述輔助吸附劑用于吸附所述主吸附劑掉落的配基，且所述輔助吸附劑的配基來源于所述目標物質或其局部。采用該吸附柱進行免疫吸附治療時，在清除血液中致病物質的同時，可以有效減少脫落的配基進入血液的風險，同時不會引入其它風險因素。
【IPC分類】B01D15/22, A61M1/38, B01D15/36
【公開號】CN105214341
【申請?zhí)枴緾N201510595440
【發(fā)明人】陳校園, 張磊, 余波光, 張海珍, 李樂軍
【申請人】廣州康盛生物科技有限公司
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年9月17日