白A，4°C保存。
[0026] 實(shí)施例3在含有40.0 g多孔硅膠(粒徑40 μL?，孔徑100 nm)的無水甲苯溶液中加 入60.0 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)加熱反應(yīng)4h，索式洗滌后真空干燥得到氨基 改性的硅膠（即改性硅膠）。以體積比1:1的乙腈-異丙醇混合液為勻漿液、甲醇為頂替液，在 14 MPa壓力下將2.0 g改性硅膠裝填入不銹鋼柱管內(nèi)。然后，將裝填硅膠的不銹鋼柱連接到 液相栗上，先以乙腈沖柱10 min，接著以2.0 g 1，1'_羰基二咪唑的60 mL乙腈溶液循環(huán)沖 柱15 min，再以溶有20.0 mg蛋白A的10 mL PBS溶液(pH 7.0，10 mM)循環(huán)沖柱30 min，繼 續(xù)以10 mL PBS溶液(pH 7.0,50 mM)循環(huán)沖柱lOmin洗除未鍵合的蛋白A，4°C保存。
[0027] 實(shí)施例4在含有40.0 g多孔硅膠(粒徑40 μπι，孔徑100 nm)的無水甲苯溶液中加 入60.0 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)加熱反應(yīng)4h，索式洗滌后真空干燥得到氨基 改性的硅膠（即改性硅膠）。以體積比1:1的乙腈-異丙醇混合液為勻漿液、甲醇為頂替液，在 14 MPa壓力下將2.0 g改性硅膠裝填入不銹鋼柱管內(nèi)。然后，將裝填硅膠的不銹鋼柱連接到 液相栗上，先以乙腈沖柱10 min，接著以2.0 g 1，1'_羰基二咪唑的60 mL乙腈溶液循環(huán)沖 柱15 min，再以溶有60.0 mg蛋白A的10 mL PBS溶液(pH 7.0，10 mM)循環(huán)沖柱30 min，繼 續(xù)以10 mL PBS溶液(pH 7.0,50 mM)循環(huán)沖柱lOmin洗除未鍵合的蛋白A，4°C保存。。
[0028] 實(shí)施例5在含有40.0 g多孔硅膠(粒徑40 μL?，孔徑100 nm)的無水甲苯溶液中加 入60.0 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)加熱反應(yīng)4h，索式洗滌后真空干燥得到氨基 改性的硅膠（即改性硅膠）。以體積比1:1的乙腈-異丙醇混合液為勻漿液、甲醇為頂替液，在 14 MPa壓力下將2.0 g改性硅膠裝填入不銹鋼柱管內(nèi)。然后，將裝填硅膠的不銹鋼柱連接到 液相栗上，先以乙腈沖柱10 min，接著以2.0 g 1，1'_羰基二咪唑的60 mL乙腈溶液循環(huán)沖 柱15 min，再以溶有80.0 mg蛋白A的10 mL PBS溶液(pH 7.0，10 mM)循環(huán)沖柱30 min，繼 續(xù)以10 mL PBS溶液(pH 7.0,50 mM)循環(huán)沖柱lOmin洗除未鍵合的蛋白A，4°C保存。。
[0029] 實(shí)施例6在含有40.0 g多孔硅膠(粒徑40 μL?，孔徑100 nm)的無水甲苯溶液中加 入60.0 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)加熱反應(yīng)4h，索式洗滌后真空干燥得到氨基 改性的硅膠（即改性硅膠）。以體積比1:1的乙腈-異丙醇混合液為勻漿液、甲醇為頂替液，在 14 MPa壓力下將2.0 g改性硅膠裝填入不銹鋼柱管內(nèi)。然后，將裝填硅膠的不銹鋼柱連接到 液相栗上，先以乙腈沖柱10 min，接著以2.0 g 1，1'_羰基二咪唑的60 mL乙腈溶液循環(huán)沖 柱15 min，再以溶有100.0 mg蛋白A的10 mL PBS溶液(pH 7.0，10 mM)循環(huán)沖柱30 min， 繼續(xù)以1〇 mL PBS溶液(pH 7.0,50 mM)循環(huán)沖柱lOmin洗除未鍵合的蛋白A，4°C保存。。
[0030] 實(shí)施例7在含有40.0 g多孔硅膠(粒徑40 μπι，孔徑100 nm)的無水甲苯溶液中加 入60.0 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)加熱反應(yīng)4h，索式洗滌后真空干燥得到氨基 改性的硅膠（即改性硅膠）。以體積比1:1的乙腈-異丙醇混合液為勻漿液、甲醇為頂替液，在 14 MPa壓力下將2.0 g改性硅膠裝填入不銹鋼柱管內(nèi)。然后，將裝填硅膠的不銹鋼柱連接到 液相栗上，先以乙腈沖柱10 min，接著以2.0 g 1，1'_羰基二咪唑的60 mL乙腈溶液循環(huán)沖 柱15 min，再以溶有150.0 mg蛋白A的10 mL PBS溶液(pH 7.0，10 mM)循環(huán)沖柱30 min， 繼續(xù)以1〇 mL PBS溶液(pH 7.0,50 mM)循環(huán)沖柱lOmin洗除未鍵合的蛋白A，4°C保存。。
[0031] 實(shí)施例8本發(fā)明制備的蛋白A免疫親和柱中蛋白A偶聯(lián)量通過HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線法測 得。蛋白A的HPLC色譜圖如圖1所示，蛋白A濃度(c，mg/mL)和峰面積(A)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示。其標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程為:A=4.75X 106 c+128335 (R2=0.998);進(jìn)而通過下述計算蛋 白A在硅膠柱上的偶聯(lián)量， 蛋白A偶聯(lián)量計算公式如下：Ma=(ClVl-C2V2_ C3V3)/Mb 其中Ma :蛋白A偶聯(lián)量(mg/g-silica);ci和Vi:蛋白A上樣前濃度（mg/L)和體積(mL); c2和V2:蛋白A上樣后濃度(mg/L)和體積(mL) ;C3和V3:洗脫液濃度(mg/L)和體積(mL) ;Mb :硅 膠的質(zhì)量(g)。表面覆蓋率:C = (Ma/M)X106/Sg 其中，C:蛋白A表面覆蓋率(nmol/m2);Ma :蛋白A偶聯(lián)量(mg/g-Silica);M:蛋白A的相對 分子質(zhì)量（23 KDa);Sg:硅膠的比表面積(m2/g) 本發(fā)明制備的蛋白A免疫親和柱結(jié)合抗體IgG的評價:在連接有蛋白A免疫親和柱的液 相系統(tǒng)中，先以1.0 mL /min的流速沖pH 7.4 20 mM PBS緩沖液至基線平穩(wěn)；然后以10.0 mL/min的流速注入6 mL標(biāo)準(zhǔn)兔血清，上樣后再以pH 7. 4、20 mM PBS緩沖液沖至基線平 穩(wěn);再用pH 3.0 10 mM甘氨酸溶液以10.0 mL/min的流速洗脫與蛋白A結(jié)合的抗體IgG，收 集洗脫液;在洗脫液中滴加 pH 8.5 1 Μ的Tris溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值至中性。
[0032] IgG的含量測定:先測定一系列不同濃度的IgG溶液在280 nm處的吸光度，建立IgG 的濃度(cIgC)與吸光度(Abs)間的關(guān)系，即標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3)。其標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程為:Abs= 1.31c IgG-0.03 (R2=0.999)。然后，以相同的方法測得上述洗脫液在280 nm處的吸光度值， 代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即得到相應(yīng)的IgG濃度，進(jìn)而通過下式計算得到蛋白A親和柱結(jié)合的IgG量。 migG (mg) = cigG (mg/mL) X V (mL) 〇
[0033] 在本文中，當(dāng)硅膠孔徑由100 nm減小到10 nm時，硅膠比表面積顯著增大，而蛋白A 不易與硅膠結(jié)合，故表面覆蓋率從20.0 nmol/m2顯著降低到1.5 nmol/m2; 在采用粒徑為40 μπι孔徑為100 nm的硅膠基質(zhì)上，隨著蛋白A加入量的增加，蛋白A在娃 膠上的偶聯(lián)量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，在40 mg/g(按改性硅膠質(zhì)量計）時，蛋白A的 偶聯(lián)量最大，表面覆蓋率最高，同時在純化IgG時表現(xiàn)最佳，兔血清IgG的結(jié)合量達(dá)到最大 值，即27.4 ±1.2 mg/g。
[0034]表1實(shí)施例1~7所得蛋白A免疫親和柱的性能
在相同條件下，以2 mL標(biāo)準(zhǔn)兔血清為樣品，對實(shí)施例5的免疫親和柱、瓊脂糖基蛋白A免 疫親合柱(本公司自主開發(fā))和GE-Mabselcetxtra rprotein A商品柱開展抗體純化實(shí)驗(yàn) (見表2)。與其它方法制備的免疫親和柱和GE公司商品柱，本發(fā)明所制備的免疫親和柱具有 更大的抗體結(jié)合量，單位蛋白A具有更高的抗體結(jié)合比例，即蛋白A利用率更高。
[0035]表2不同親和柱純化抗體能力對比
*瓊脂糖基蛋白A免疫親和柱為廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司生產(chǎn)。
[0036]實(shí)施例9抗體IgG的純度測定:對以實(shí)施例1、5和7的免疫親合柱提純的抗體IgG進(jìn) 行SDS-PAGE研究，掃描膠片，通過凝膠成像系統(tǒng)分析洗脫液中抗體的純度，結(jié)果見圖4和5。 兔血清樣品在65 KDa、55 KDa和25KDa處出現(xiàn)3條明顯的條帶，分別對應(yīng)為白蛋白、兔IgG 重鏈和兔IgG輕鏈;而在提純得到的洗脫液中（即IgG樣品），分別在55KDa和25KDa處出現(xiàn)2 條條帶，分別對應(yīng)為兔IgG重鏈和IgG輕鏈，進(jìn)一步通過凝膠成像系統(tǒng)分析，兔IgG的純度 在92%~95%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蛋白A免疫親和柱的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：51. 將多孔硅膠與3-氨丙基三乙氧基硅烷在溶劑中反應(yīng)得到改性硅膠；52. 將S1中所得改性硅膠裝柱，以1，1'_羰基二咪唑?yàn)榕悸?lián)劑，在柱內(nèi)與蛋白A發(fā)生偶 聯(lián)反應(yīng)，得到所述蛋白A免疫親和柱； 所述多孔硅膠的粒徑為40 μπι，孔徑為100 nm; 按改性硅膠質(zhì)量計，所述S2中蛋白A的用量在10.0~75.0 mg/g。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述S2中蛋白A的用量在20.0~50.0 mg/g〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述S2中蛋白A的用量為40.0 mg/g。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述S1中硅膠與3-氨丙基三乙氧基硅 烷反應(yīng)的質(zhì)量體積比為1: 1.5;所述S1中溶劑為甲苯，所述反應(yīng)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流反應(yīng)，所 述反應(yīng)時間為4 h。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述S2中改性硅膠以乙腈-異丙醇的 混合液為勻漿液、甲醇為頂替液進(jìn)行裝柱，所述乙腈與異丙醇的體積比為1: 1。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述S2中以乙腈沖改性硅膠柱5~15 min，然后以1，Γ-羰基二咪唑的乙腈溶液循環(huán)沖柱5~30 min，再以溶解有蛋白A的roS溶液 循環(huán)沖柱20~40 min，最后繼續(xù)使用pH為7.0,質(zhì)量摩爾濃度為50 mM的PBS溶液循環(huán)沖柱5~ 15 min； 所述溶解有蛋白A的PBS溶液的pH為7.0,質(zhì)量摩爾濃度為10 mM。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述S2中所述1，Γ-羰基二咪唑的質(zhì) 量與乙腈的體積比為1:30。8. 權(quán)利要求1至7任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法制備得到的蛋白Α免疫親和柱。9. 權(quán)利要求8所述的蛋白A免疫親和柱應(yīng)用于純化兔血清蛋白中的抗體IgG。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種蛋白A免疫親和柱的制備方法，包括如下步驟：S1.多孔硅膠先與3-氨丙基三乙氧基硅烷反應(yīng)得到氨基改性的硅膠(即改性硅膠)；S2.將改性硅膠填裝成柱，以1,1ˊ-羰基二咪唑?yàn)榕悸?lián)劑與蛋白A在色譜柱內(nèi)反應(yīng)得到所述蛋白A免疫親和柱。所述多孔硅膠的粒徑為40μm，孔徑為100nm；所述S2中蛋白A量范圍在10.0~75.0mg/g(相對于改性硅膠質(zhì)量)。本發(fā)明選用一定粒徑和孔徑的改性硅膠，通過柱上衍生法將蛋白A與硅膠結(jié)合，制備方法簡單，條件溫和，減少轉(zhuǎn)移操作，有利于保持蛋白A的活性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)蛋白A免疫親和材料的連續(xù)化生產(chǎn)。
【IPC分類】C07K16/00, B01D15/38, B01J20/24, C07K1/22, B01J20/30
【公開號】CN105498706
【申請?zhí)枴緾N201510902638
【發(fā)明人】章偉光, 黃思, 范軍
【申請人】廣東研捷醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月9日