專(zhuān)利名稱(chēng)：提純分子的裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在分離步驟之后俘獲并收集被分離的生物分子的設(shè)備。本發(fā)明還 涉及使用該設(shè)備的方法。
背景技術(shù)：
分析生物分子，諸如蛋白質(zhì)、多核酸、脂類(lèi)和碳水化合物，通常需要一種分離和/ 或提純裝置。因此，在分離和提純過(guò)程之后，必須收集感興趣的樣本并將其轉(zhuǎn)移到后續(xù)分析 平臺(tái)諸如色譜儀。許多方法可以用來(lái)進(jìn)行分離，包括色析分離和電泳分離。不同類(lèi)型的分 離過(guò)程背后的原理是使得各種生物分子移動(dòng)，以不同速率經(jīng)過(guò)分離介質(zhì)，以便復(fù)雜樣本中 的各種分子在分離過(guò)程中從空間上分開(kāi)。因此，一旦分離過(guò)程結(jié)束，如何保持空間分辨力就 成為一個(gè)問(wèn)題，因?yàn)闃颖倦x開(kāi)分離介質(zhì)并準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移到下一步驟(例如，另一個(gè)分離步驟或 分析步驟)。利用提供高分辨力、再現(xiàn)性和回收率的優(yōu)選系統(tǒng)進(jìn)行分離對(duì)于蛋白質(zhì)組分析來(lái)說(shuō) 至關(guān)重要。在蛋白質(zhì)學(xué)中，基于MS的肽序列策略在分析之前采用熟知的分離技術(shù)來(lái)降低樣 本復(fù)雜性(Washburn，et al.，2001)。在完整蛋白質(zhì)水平，二維電泳法繼續(xù)被廣泛采用，但 仍然與無(wú)可匹敵的分辨力程度相去甚遠(yuǎn)(Gorg，et al. 2004)，但是二維電泳法無(wú)法提供分 離系統(tǒng)的眾多期望特征(Gygi，et al. 2000)。近來(lái)由Brimner等描述蛋白質(zhì)學(xué)“定靶”散彈方案的報(bào)告示出了完整蛋白質(zhì)預(yù)先 分餾來(lái)改善分析的重要性(Brimner，et al.，2007)。逐漸受到歡迎的順選蛋白質(zhì)分析同樣 點(diǎn)燃了對(duì)有效蛋白質(zhì)分離策略的需求。雖然如此，除了一些有名的個(gè)案之外(Nilsson and Davidsson,2000 ；Shi，et al.，2004 ；Wang andHanash, 2005 ；Lubman，et al.，2002)，優(yōu)化并 開(kāi)發(fā)完整水平的蛋白質(zhì)組分離新方案仍然是未開(kāi)發(fā)的領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及在分離步驟之后俘獲并收集生物分子的裝置和方法。在第一方面，本發(fā)明提供一種包括分離設(shè)備和收集腔的裝置。所述收集腔包括適 配成接收所述分離設(shè)備端部的進(jìn)入端口 ；包括俘獲介質(zhì)的排出端口和位于所述進(jìn)入端口和 排出端口之間的存取端口，其中，通過(guò)調(diào)節(jié)所述分離設(shè)備相對(duì)于所述存取端口處于所述進(jìn) 入端口的深度來(lái)調(diào)節(jié)所述收集腔的容積。在一種實(shí)施方式中，所述分離設(shè)備包括電泳分離 設(shè)備。該實(shí)施方式的所述分離設(shè)備可以具有長(zhǎng)度為IOcm以下的分離路徑和/或包括含有 二聚丙烯酰胺或瓊脂的分離介質(zhì)。在特定實(shí)施方式中，所述分離設(shè)備包括聚丙烯酰胺凝膠， 所述凝膠包括高度為6cm以下且直徑大約為0. 2-1. Ocm的溶解凝膠。
在另一種實(shí)施方式中，所述裝置的收集腔包含一個(gè)或多個(gè)可拆卸的俘獲器。所述 俘獲器可以包括疏水俘獲器、親水俘獲器、離子交換俘獲器、分子量截止俘獲器、親和性俘 獲器或者它們的組合。在包含一個(gè)以上俘獲器的實(shí)施方式中，所述俘獲器可以串聯(lián)排列。在另一種實(shí)施方式中，所述收集腔內(nèi)的所述存取端口進(jìn)一步包括閥。在另一種實(shí)施方式中，所述收集腔內(nèi)的所述排出端口中的所述俘獲介質(zhì)包括分子 量截止值大約為IkDa到大約IOkDa的膜。在額外的實(shí)施方式中，所述裝置包括兩個(gè)或更多個(gè)收集腔。所述收集腔可以用單獨(dú)一塊材料構(gòu)造。此外，所述存取端口之間的間隔可以設(shè)計(jì) 成容納標(biāo)準(zhǔn)多通道吸移管管理器。所述存取端口可以設(shè)計(jì)成容納標(biāo)準(zhǔn)吸移管末端。在另一種實(shí)施方式中，所述裝置包括兩個(gè)以上的分離設(shè)備和兩個(gè)以上的收集腔。 所述分離設(shè)備的數(shù)目可以等于所述收集腔的數(shù)目，并且每個(gè)收集腔緊接在分離設(shè)備的下游 設(shè)置。所述分離設(shè)備和所述收集設(shè)備可以并排排列。所述多分離設(shè)備和收集腔的結(jié)構(gòu)可以 為平面狀。所述復(fù)用設(shè)備還可以配置成弧形、半圓、半橢圓或管形。所述管形結(jié)構(gòu)可以是柱 狀或橢圓狀。各分離設(shè)備可以并排排列，或者形成另一種結(jié)構(gòu)，諸如塊體，取決于所述復(fù)用 裝置中的單元數(shù)目。所述復(fù)用裝置可以包括8個(gè)分離設(shè)備和8個(gè)收集腔。在另外的實(shí)施方式中，所述裝置進(jìn)一步包括設(shè)置在所述分離設(shè)備上游的上部腔室 和設(shè)置在所述收集腔下游的下部腔室。在第二方面，本發(fā)明提供一種利用本發(fā)明的裝置從一個(gè)或多個(gè)樣本中提純多種分 子或分子分餾物的方法，所述方法包括步驟(1)提供一個(gè)或多個(gè)樣本；(2)利用所述裝置 的分離設(shè)備分離分子；和(3)經(jīng)由所述收集腔中的所述存取端口依次收集多種分餾物。在第二方面的一種實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括步驟向所述分離設(shè)備施加 樣本，其中所述設(shè)備的裝載端抬高到與水平方向的夾角大于10度。在另一種實(shí)施方式中， 所述方法進(jìn)一步包括步驟允許所述樣本向所述分離設(shè)備中遷移，然后放下所述設(shè)備，使其 與水平方向的夾角小于10度。在第二方面的另一種實(shí)施方式中，所述分離步驟在停止并運(yùn)行的循環(huán)中實(shí)施，在 每個(gè)收集步驟中暫時(shí)停止分離步驟，隨后在完成每次收集步驟之后，重新啟動(dòng)分離步驟。在第二方面的另一種實(shí)施方式中，在所述裝置處于水平位置的同時(shí)，實(shí)施所述分 離步驟和收集步驟。在另一種實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括步驟通過(guò)調(diào)節(jié)所述分離設(shè)備處于所 述收集腔中的所述進(jìn)入端口中的深度來(lái)調(diào)節(jié)所述收集腔的容積。在另外一種實(shí)施方式中，被收集的分餾物中的分子較之它們?cè)跇颖局械臐舛?，?有相同或更大的濃度。在另一種實(shí)施方式中，所述分餾物包括可拆卸的俘獲器。所述分餾 物還可以在所述收集腔內(nèi)包括可拆卸的俘獲器和溶液。在另一種實(shí)施方式中，所述樣本包括粗細(xì)胞提取出、局部提出的提取物、或者先前 通過(guò)等電子聚焦或其他方法分離的樣本。在額外的實(shí)施方式中，所述裝置使用電泳分離設(shè)備，其中利用大于240伏特的電 壓對(duì)分子進(jìn)行分離。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述分離和收集步驟在大約100分鐘內(nèi)實(shí)施。 被分離的分子可以是蛋白質(zhì)，介于大約5kDa到大約200kDa之間，并且分子量偏差大約5kDa 的分子被有效地分離。
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在另一種實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括步驟在每次收集步驟之后，向所述收 集腔添加緩沖劑。


圖1是所述設(shè)備一種實(shí)施方式的截面圖；圖2是所述設(shè)備一種實(shí)施方式的俯視圖；圖3是收集腔的三維視圖；圖4是收集腔的側(cè)視截面圖；圖5是收集腔的截面圖；圖6示出了所述設(shè)備一種實(shí)施方式的照片，示出了在聚丙烯酰胺凝膠上運(yùn)行的預(yù) 染色蛋白質(zhì)分離過(guò)程；圖7是復(fù)用設(shè)備一種實(shí)施方式的俯視圖；圖8是復(fù)用設(shè)備收集腔的三維視圖；圖9是復(fù)用設(shè)備收集腔的側(cè)視截面圖；圖10是復(fù)用設(shè)備收集腔的截面圖；圖11示出了從Icm和3cm長(zhǎng)的溶解SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離的枯草芽孢桿菌 蛋白質(zhì)收集的分餾物的銀染色凝膠；圖12示出了染色聚丙烯酰胺凝膠的照片，指示出從收集腔回收的蛋白質(zhì)量；圖13示出了染色聚丙烯酰胺凝膠的照片，指示出了利用GeIFrEE(凝膠分餾物俘 獲電泳)設(shè)備進(jìn)行的3次獨(dú)立的分離過(guò)程。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的裝置和方法相對(duì)于在分離步驟之后俘獲并收集被分離的生物分子的其 他裝置和方法來(lái)說(shuō)，提供眾多優(yōu)勢(shì)。首先，本發(fā)明的裝置將生物分子分離與從分離介質(zhì)隔離 直接耦接。第二，所述裝置和方法用于與隔離同步濃縮生物分子。第三，所述裝置和方法用 于高效回收生物分子，即使在低至yg以下水平。第四，生物分子分離與洗脫和隔離整合， 在節(jié)省時(shí)間、減少所需的步驟并減少所述裝置所需的空間方面為使用者帶來(lái)顯著的優(yōu)勢(shì)。 第五，所述裝置可以容納多種不同的分離設(shè)備和分離介質(zhì)。第六，所述裝置可以與其他分離 和分析設(shè)備整合，以實(shí)現(xiàn)多維度平臺(tái)，這種平臺(tái)可以全面并有針對(duì)性地分析生物分子。I 裝置本發(fā)明的裝置包括收集腔，分離設(shè)備可以直接與該收集腔接合。A.收集腔本發(fā)明的裝置的收集腔設(shè)計(jì)成俘獲腔室內(nèi)的生物分子。所述收集腔還設(shè)計(jì)成在被 分離的樣本離開(kāi)所述分離設(shè)備之后，保持所述被分離樣本的空間分辨度。為了實(shí)現(xiàn)這一目 的，所述收集腔直接與所述分離設(shè)備接合。所述收集腔包括進(jìn)入端口、排出端口和存取端 口。所述存取端口允許直接存取被俘獲的樣本，以便于樣本收集。1.進(jìn)入端口所述收集腔的進(jìn)入端口允許直接與所述分離設(shè)備接合。所述進(jìn)入端口設(shè)計(jì)成適應(yīng) 所述分離設(shè)備端部的尺寸。因此，所述進(jìn)入端口包括圓形、橢圓形或矩形孔，或者柱狀、橢圓管或?qū)嵭木匦?，以允許所述分離設(shè)備的端部直接耦接到所述收集腔。所述進(jìn)入端口可以任 選包含膜，所述膜可以是分子量截止膜。在一種實(shí)施方式中，所述膜是將分離介質(zhì)保持在分 離設(shè)備中的膜，以便所述分離介質(zhì)不會(huì)進(jìn)入所述收集腔。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述膜可以 是具有較高分子量截止值的膜，諸如500kDa。可以提供用于密封所述分離設(shè)備的部件，以防 止所述分離設(shè)備與所述收集腔的結(jié)合部發(fā)生流體滲漏。所述密封部件取決于分離介質(zhì)，并 且可以使用也可以不使用。例如，對(duì)于凝膠電泳法來(lái)說(shuō)，密封部件可以包括橡膠0形環(huán)和夾 板。分離設(shè)備與收集腔經(jīng)由進(jìn)入端口耦接，允許收集多個(gè)被分離的分餾物。所述進(jìn)入端口還設(shè)計(jì)成讓所述收集腔的容積可以通過(guò)控制所述分離設(shè)備進(jìn)入所 述進(jìn)入端口的深度而方便地調(diào)節(jié)。2.排出端口所述收集腔的排出端口提供離開(kāi)所述收集腔的通道，并位于所述進(jìn)入端口下游。 所述排出端口包括俘獲介質(zhì)，所述俘獲介質(zhì)對(duì)于溶劑以及特定溶質(zhì)(例如，鹽、緩沖成分， 可能還有不想要的生物分子)具有選擇滲透性。所述俘獲介質(zhì)可以包括眾多俘獲介質(zhì)中任 意種類(lèi)。在一種實(shí)施方式中，所述俘獲介質(zhì)是分子量截止膜。所述膜可以是眾多膜中的任 意種類(lèi)，包括但不限于透析膜、硝酸纖維素膜、超濾膜或其他分子量截止膜。所述截止分子 量應(yīng)該小于感興趣的最小樣本成分的分子量，例如Ι-lOkDa。分子量截止膜或其他俘獲介 質(zhì)，有選擇地允許一些分子諸如分子量較小的分子通過(guò)。這種選擇性允許在隔離生物分子 的同時(shí)將它們濃縮。3.存取端口所述存取端口包括所述收集腔中位于所述進(jìn)入端口和排出端口之間的開(kāi)口。所述 開(kāi)口可以具有任何結(jié)構(gòu)和尺寸，包括但不限于圓形、橢圓形或矩形開(kāi)口，或者包括柱狀管、 橢圓管或?qū)嵭木匦蔚拈_(kāi)口。在一種實(shí)施方式中，所述開(kāi)口包括置于所述腔中的液體液位以 上的孔。在該實(shí)施方式中，所述分離設(shè)備在水平位置運(yùn)行，或者在水平位置和垂直位置之間 的位置運(yùn)行。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述存取端口容納標(biāo)準(zhǔn)吸移管末端。在另一種實(shí)施方 式中，所述存取端口允許分子俘獲器插入和取出。因此，所述存取端口允許方便地存取，用 于管理和收集被分離的分餾物，無(wú)論它們被俘獲在俘獲設(shè)備中還是處于溶液中。所述存取端口可以包括閥。如果所述分離設(shè)備以垂直位置工作，則閥特別有用。所 述閥可以是簡(jiǎn)單閥，諸如旋塞閥、勒爾鎖、端面密封或側(cè)面密封閥。所述閥還可以是單向閥， 所述單向閥在打開(kāi)時(shí)僅允許液體向一個(gè)方向流動(dòng)。單向閥的示例包括但不限于止回閥，諸 如在Kim和Bee (2007)的文章中描述的止回閥；或者Cheung和Morioka (1990)的文章中描 述的單向閥。其他單向閥的示例包括那些用在醫(yī)療設(shè)備中的閥替代品的閥。4.內(nèi)部所述收集腔的內(nèi)部允許保持分餾物，無(wú)論處于溶液相還是固相。所述內(nèi)部由所述 收集腔的壁所述限定。所述收集腔可以具有任何結(jié)構(gòu)，包括但不限于柱形、球形、正方形和 其他結(jié)構(gòu)。在一種實(shí)施方式中，所述收集腔的內(nèi)部為柱形，直徑大約等于柱狀分離設(shè)備的外徑。所述收集腔的內(nèi)部還可以容納俘獲設(shè)備，諸如疏水性俘獲器、親水性俘獲器、分子 量截止俘獲器、離子交換俘獲器(陰離子和/或陽(yáng)離子)、親和俘獲器或者它們的組合。所 述俘獲器可以包括俘獲具有特定物理屬性的分子，所述物理屬性諸如尺寸、電荷、疏水性、
8親水性、對(duì)配體的親和性或者它們的組合。所述介質(zhì)可以包含在允許分子進(jìn)入并離開(kāi)所述 俘獲器的腔室中。例如，俘獲器可以包含離子交換樹(shù)脂。在另一個(gè)示例中，不作為限制，所 述俘獲器可以是保護(hù)柱插件諸如Phenomenex (Torrance，California)提供的保護(hù)插件。在 一種實(shí)施方式中，所述收集腔可以容納一種以上的俘獲器，以便可以同時(shí)俘獲不同類(lèi)型的 分子。所述俘獲器還可以在所述收集腔中依次排列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)以上的所述收集腔存在于包括一個(gè)分離設(shè)備的裝置 中。在該實(shí)施方式中，所述收集腔可以排列在所述分離設(shè)備下游。以這種方式對(duì)齊的收集 腔在它們之間具有不同的分子量截止膜。在另一種實(shí)施方式中，所述收集腔可以包括不同 的分子俘獲器。B.分離設(shè)備本發(fā)明的裝置還包括用來(lái)分離生物分子的分離設(shè)備。所述分離設(shè)備包括分離介質(zhì) 和包含所述分離介質(zhì)的殼體。所述分離介質(zhì)包括任何用于分離生物分子的介質(zhì)。所述介質(zhì)包括但不限于根據(jù)分 子的尺寸和質(zhì)量分離生物分子的介質(zhì)。這些介質(zhì)包括但不限于凝膠過(guò)濾材料，諸如葡聚糖凝膠和瓊脂糖以及用于根據(jù)分 子尺寸進(jìn)行電泳分離的材料，包括聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠。其他分離介質(zhì)包括離子交換 材料，包括陽(yáng)離子和陰離子交換樹(shù)脂；親和材料，包括普通親和材料諸如磷酸纖維素、羥基 磷灰石和藍(lán)色葡聚糖。也包括更為專(zhuān)用的親和材料，諸如攜帶配體的材料，特定的生物分子 鍵合到所述配體。所述配體包括但不限于，抗體、蛋白質(zhì)、肽、核酸序列、碳水化合物和其他 配體。所述分離介質(zhì)還包括根據(jù)疏水性而分離生物分子的疏水材料和親水材料。所述分離介質(zhì)容納在設(shè)備中，所述設(shè)備通常具有上游端和下游端。所述設(shè)備可以 表現(xiàn)為任何形式，包括標(biāo)準(zhǔn)圓柱體。另一種形式是實(shí)心矩形，例如為板條聚丙烯酰胺凝膠。 用于分離介質(zhì)的殼體的尺寸可以顯著變化，取決于分離介質(zhì)和樣本尺寸。對(duì)于圓柱體來(lái)說(shuō)， 尺寸可以從短小的毛細(xì)管柱體變化到用于大型分離的非常巨大的柱體，通常用于商業(yè)分 離。還包括固定相填充柱。實(shí)心矩形殼體可以類(lèi)似地從非常小的殼體變化到非常大的殼體。所述收集腔的進(jìn)入端口以及在一些實(shí)施方式中，所述收集腔的尺寸設(shè)計(jì)成容納分 離設(shè)備殼體。需要驅(qū)動(dòng)力來(lái)移動(dòng)生物樣本通過(guò)分離介質(zhì)。所述分離設(shè)備利用驅(qū)動(dòng)力讓溶質(zhì)向收 集腔的方向移動(dòng)，所述驅(qū)動(dòng)力諸如，但不限于，電泳作用、壓力、重力滲透、溫度梯度、鹽度梯 度或者它們的組合。在驅(qū)動(dòng)力(諸如高壓)導(dǎo)致發(fā)熱的情況下，可以使用熱傳遞設(shè)備或冷卻設(shè)備來(lái)冷 卻所述設(shè)備。C.附件所述設(shè)備一般包括位于所述分離設(shè)備上游和所述收集腔下游的腔室。所述腔室可 以包含移動(dòng)生物分子通過(guò)所選分離介質(zhì)所需的緩沖劑。所述設(shè)備還可能要求密封所述裝置以防止泄露的裝置。所述密封裝置可以包括橡 膠墊片和夾板或螺母和螺栓，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于密封的其他裝置。所述密封 裝置還用于密封所述收集腔排出端口處的所述分子量截止膜。D.材料
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所述設(shè)備還可以由相對(duì)剛性的支撐材料形成，所述剛性材料不會(huì)和與其接觸放置 的材料發(fā)生反應(yīng)。所述材料也可以是不導(dǎo)電的。材料包括但不限于，聚甲基丙烯酸酯、塑料、 聚丙烯、聚碳酸酯、PTFE、TEFLON或者其他不反應(yīng)的或化學(xué)惰性的材料。此外，可以使用一 種以上的材料來(lái)制作所述設(shè)備。E.聚丙烯酰胺電泳當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)洗脫順序以可預(yù)測(cè)的方式發(fā)生時(shí)，蛋白質(zhì)組分離最為有益。這種可預(yù)測(cè) 性允許隔離特定的蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)類(lèi)(例如，PTM蛋白質(zhì)富集)，并且還協(xié)助識(shí)別過(guò)程 (Pal,et al.，2006)。蛋白質(zhì)的分子量恒定，且清楚地提供一種明顯不受樣本或溶劑條件影 響的確定參數(shù)。與電荷和疏水性?xún)烧哒?，蛋白質(zhì)的分子量提供一種非常令人期待的分離 模式。不幸的是，建立起來(lái)的根據(jù)尺寸來(lái)分離蛋白質(zhì)的基于溶液的系統(tǒng)非常少有。膜過(guò)濾 和超濾策略固有地勞動(dòng)量大，并且分辨度較低。尺寸排阻色譜法已經(jīng)耦接到其他分離平臺(tái) (Bushey and Jorgenson,1990 ；Opiteck and Jorgenson,1997 ；Lecchi, et al. ,2003),{i. 是在蛋白質(zhì)組學(xué)方面尚未具有廣泛應(yīng)用，原因是其峰值容量相對(duì)較低。分辨度、處理能力以 及樣本回收率高的基于尺寸的蛋白質(zhì)分離平臺(tái)將給出更為令人期待的系統(tǒng)。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS PAGE)是可論證的用于根據(jù)尺寸分 離蛋白質(zhì)的最佳方法。有意思的是，SDS PAGE最嚴(yán)重的局限涉及通常在吸收之后從凝膠中 回收蛋白質(zhì)，而不是涉及分離過(guò)程本身(Rabilloud，2002)。SDS的存在可以對(duì)MS (質(zhì)量光 譜)分析帶來(lái)迫在眉睫的限制。但是，SDS的好處在于實(shí)現(xiàn)了根據(jù)尺寸可預(yù)測(cè)地分離，以及 協(xié)助蛋白質(zhì)溶解作用，可論證地超出其缺陷。鑒于此，最好是利用SDS PAGE對(duì)于分子量分 離的高分辨能力，同時(shí)避免繁重的污點(diǎn)切除、凝膠內(nèi)吸收以及肽提取工作。作為溶劑提取的替代方案，在SDS PAGE之后，將蛋白質(zhì)從凝膠中電泳隔離。 Bio-Rad提供的Whole Gel Eluter在整個(gè)凝膠范圍內(nèi)采用電洗脫策略。Davidsson等人已 經(jīng)使用這種系統(tǒng)來(lái)分餾并分析人體腦脊髓液中的蛋白質(zhì)(Davidsson，et al. 2001)。雖然 這種設(shè)備實(shí)現(xiàn)了廣泛的基于尺寸的分離，但是這種設(shè)備可以獲得的分餾物數(shù)量受到限制， 制約了優(yōu)化分辨度的靈活性。此外，樣本裝載能力受到板條凝膠的尺寸限制。此外，Whole Gel eluter也難于實(shí)現(xiàn)復(fù)用，并且不容易整合到基于多維度溶液的平臺(tái)中。作為制備凝膠電泳法的不同策略，可以通過(guò)連續(xù)施加分離電場(chǎng)，從凝膠“柱體” 的端部洗脫蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)被分子量膜俘獲并隨后被收集(Lewisand Clark, 1963 ； Racusen and Calvanico，1964 ；Jovin，et al.，1964 ；Shain，，et al.，1992)。這禾中技術(shù) 一般稱(chēng)為連續(xù)洗脫管凝膠電泳法。雖然其良好地建立了以極高的分辨度提純蛋白質(zhì)的能 力(Masuoka，et al.，1998)，但是利用這種方法分餾完整的蛋白質(zhì)組的能力仍然存在問(wèn)題 (Rose and Opitek，1994 ;Meng，et al. 2002 ；Du，et al.，2004)。一般來(lái)說(shuō)，建立在這種方案 基礎(chǔ)上的系統(tǒng)偏向于分子量較低的蛋白質(zhì)(Meng，et al.，2002 ；Du，et al.，2004，Zerefos， et al. ,2006 ；Xixi, et al.，2006)。目前系統(tǒng)的其他嚴(yán)重局限包括較長(zhǎng)的分離時(shí)間；樣本 裝載量低時(shí)回收率不良；和分離過(guò)程中不可接受的大量稀釋樣本，特別是在高分子量時(shí)。在 連續(xù)洗脫電泳技術(shù)可以普遍用于全面、廣泛的大量蛋白質(zhì)組分離之前，需要克服這些困難。若干技術(shù)可以用于根據(jù)分子量來(lái)分離蛋白質(zhì)和其他材料，包括超速離心法、膜過(guò) 濾法、凝膠過(guò)濾色譜法和毛細(xì)(凝膠)電泳法。但是，在全部技術(shù)中，變性聚丙烯酰胺凝膠 電泳法無(wú)疑提供最高程度的分辨力。傳統(tǒng)形式的薄分析板條凝膠不僅允許簡(jiǎn)單而有效地散熱，而且在分離之后可以方便地存取凝膠用于樣本切除。歷史上，PAGE在管狀凝膠中實(shí)現(xiàn)。 簡(jiǎn)單地通過(guò)增加冷卻設(shè)備，電泳柱體的柱狀形狀可以放大，以實(shí)現(xiàn)更高的裝載容量，用于分 離較大質(zhì)量范圍的蛋白質(zhì)組。與本發(fā)明的裝置一起使用的制備凝膠電泳法改型方案具有多種優(yōu)勢(shì)。首先，適應(yīng) 較寬質(zhì)量范圍的蛋白質(zhì)分離。第二，允許在大約6kDA到大約200kDA的分子量范圍內(nèi)迅速分 餾蛋白質(zhì)組。第三，在分離之后，隨著樣本被收集而濃縮蛋白質(zhì)。第四，允許對(duì)低至亞微克 水平的樣本裝載量實(shí)現(xiàn)較高的回收率。第五，允許全面、可重復(fù)的分離復(fù)雜蛋白質(zhì)提取物。 第六，可以適用于隔離并利用質(zhì)譜分析識(shí)別極高M(jìn)W的蛋白質(zhì)組分餾物。在一種實(shí)施方式中，所述裝置包括小于2cm的短小聚丙烯酰胺柱體。使用短凝膠 的優(yōu)勢(shì)在于分離更快，因?yàn)橄疵摃r(shí)間與凝膠長(zhǎng)度成正比。較短的柱體也意味著被洗脫的分 餾物隨著時(shí)間被較輕微地稀釋。此外，可以使用更高的電壓，因?yàn)榘l(fā)熱較少。一方面，所述 分離設(shè)備包括小于2或3cm的短小的聚丙烯酰胺溶解凝膠和任選的2-3cm的積層凝膠。溶 解凝膠可以具有百分比較高的交聯(lián)劑(大約12到15% )，對(duì)于較短的凝膠而言，可以利用 240伏特電壓在一次90分鐘的運(yùn)行過(guò)程中，溶解從IOkDa以下到250kDa的分子。凝膠的尺 寸可以放大，以實(shí)現(xiàn)更高的裝載容量。較之SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法，根據(jù)分子重量分離蛋白質(zhì)的不帶凝膠的平臺(tái)一 般分辨力較低，并且不適用于較寬的質(zhì)量范圍。因此，本發(fā)明的一種實(shí)施方式優(yōu)化制備凝膠 電泳法技術(shù)，以適應(yīng)在微克范圍內(nèi)迅速、較寬質(zhì)量范圍的蛋白質(zhì)組分離。隨著從凝膠柱體端 部發(fā)生電泳遷移，蛋白質(zhì)分餾物最終收集在溶液相中，產(chǎn)生術(shù)語(yǔ)后期不帶凝膠的電泳法。本 發(fā)明的這種實(shí)施方式，稱(chēng)為凝膠分餾物俘獲電泳法或者GelFrEE，因此為蛋白質(zhì)組分餾提供 了一種替代或補(bǔ)充分離工具，這種分離工具也能根據(jù)可預(yù)測(cè)并可重復(fù)的分離特性提供有關(guān) 樣本的有價(jià)值的固有信息。由于其設(shè)計(jì)緊湊且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，所以GeIFrEE設(shè)備容易與復(fù)用技 術(shù)相適應(yīng)。F.復(fù)用裝置本發(fā)明裝置設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，允許復(fù)用該設(shè)備。復(fù)用設(shè)備包括兩個(gè)或更多個(gè)收集腔，所述 收集腔耦接到兩個(gè)或更多個(gè)分離設(shè)備。每個(gè)收集腔和每個(gè)分離設(shè)備包括相同的部件，作為 帶有一個(gè)收集腔和一個(gè)分離設(shè)備的設(shè)備。復(fù)用設(shè)備的原理是為了適應(yīng)分離大量樣本，每個(gè)樣本位于其各自分離設(shè)備中，并 且位于各自收集腔中。在一種實(shí)施方式中，收集腔的存取端口可以隔開(kāi)，以便分餾物或樣本 可以利用標(biāo)準(zhǔn)多通道吸移管管理器收集，以便多個(gè)收集腔中的全部溶液可以同時(shí)轉(zhuǎn)移。在 另一種實(shí)施方式中，所述收集腔相連，并以相同的材料塊制作。示例在圖8中示出。在另一種實(shí)施方式中，收集腔的數(shù)目少于分離設(shè)備。在一種實(shí)施方式中，兩個(gè)分離 設(shè)備洗脫到一個(gè)收集腔中，在另一種實(shí)施方式中，3個(gè)或更多個(gè)分離設(shè)備洗脫到一個(gè)收集腔 中。在另一種實(shí)施方式中，對(duì)于每個(gè)分離設(shè)備存在一個(gè)以上的收集腔。在一種實(shí)施方 式中，所述收集腔排列在分離設(shè)備下游。例如，所述裝置包括兩個(gè)分離設(shè)備A和B以及6個(gè) 收集腔1-6。收集腔1緊接在分離設(shè)備A下游，而收集腔2緊接在收集腔1下游，而收集腔 3緊接在收集腔2下游。而且，收集腔4緊接在分離設(shè)備B下游，收集腔5緊接在收集腔4 下游，而收集腔6緊接在收集腔5下游。以這種方式排列的收集腔可以在它們之間具有不
11同的分子量截止膜。在另一種實(shí)施方式中，它們可以包括不同的分子俘獲器。在另一種實(shí)施方式中，存在包含多條通道的一個(gè)分離設(shè)備，以適應(yīng)一個(gè)以上的樣 本。例如，但不作為限制，所述分離設(shè)備可以是帶有例如8通道的板條聚丙烯酰胺或瓊脂糖 凝膠。每個(gè)通道連接到收集腔。在這種實(shí)施方式中，所述收集腔可以用一塊材料制成，或者 每個(gè)收集腔可以用一塊材料制成。連接到收集腔的每個(gè)分離設(shè)備可以并排排列成不同結(jié)構(gòu)，包括但不限于平面結(jié) 構(gòu)、弧形、半圓、板橢圓或者管狀結(jié)構(gòu)。所述管狀結(jié)構(gòu)可以是柱狀管、橢圓管、矩形管或其他 結(jié)構(gòu)。耦接到復(fù)用設(shè)備的收集腔的分離設(shè)備數(shù)目可以從2到20以上，取決于實(shí)際需要。 在一種實(shí)施方式中，所述復(fù)用設(shè)備包括耦接到8個(gè)收集腔的8個(gè)分離設(shè)備。復(fù)用裝置中的每個(gè)分離設(shè)備可以與復(fù)用裝置中的其他分離設(shè)備具有相同的結(jié)構(gòu) 并包含相同的分離介質(zhì)。作為可選方案，每個(gè)分離設(shè)備可以具有相同結(jié)構(gòu)，但是包含不同于 同一復(fù)用裝置中的其他分離設(shè)備的分離介質(zhì)。另一種可選方案是，對(duì)于每個(gè)分離設(shè)備來(lái)說(shuō)， 具有不同于同一裝置中的其他分離設(shè)備的結(jié)構(gòu)，但是包含與其他分離設(shè)備相同的分離介 質(zhì)。第四種可選方案是，每個(gè)分離設(shè)備具有不同于同一裝置中的其他分離設(shè)備的結(jié)構(gòu)，且包 含不同于其他分離設(shè)備的分離介質(zhì)。這些不同的可選方案可以適應(yīng)同一復(fù)用裝置的不同分 離設(shè)備上運(yùn)行的不同樣本，或者在同一復(fù)用裝置的不同分離設(shè)備上運(yùn)行的不同量的樣本。所述分離設(shè)備可以連接到一個(gè)上游腔室或每個(gè)分離設(shè)備具有其自身的上游腔室。 例如，復(fù)用裝置可以包括8個(gè)分離設(shè)備，它們?nèi)窟B接到一個(gè)上游腔室，類(lèi)似于圖7所示的 設(shè)備。作為可選方案，復(fù)用裝置中的每個(gè)分離設(shè)備可以具有其自身上游腔室，以便對(duì)于帶有 8個(gè)分離設(shè)備的裝置來(lái)說(shuō)，存在8個(gè)上游腔室，每個(gè)上游腔室位于每個(gè)分離設(shè)備的上游。類(lèi) 似地，所述收集腔室可以經(jīng)由它們的排出端口連接到一個(gè)下游腔室，類(lèi)似于圖7所示的設(shè) 備，或者每個(gè)收集腔室連接到其自身的下游腔室。
G.與其他分離設(shè)備或分析設(shè)備接合所述設(shè)備可以連接到并行設(shè)備，以提高生產(chǎn)能力并允許同時(shí)分離和收集。所述并 行設(shè)備可以包括在本發(fā)明的裝置的分離設(shè)備上分離之前或之后實(shí)現(xiàn)的分子分離步驟，或者 分析步驟，諸如質(zhì)譜分析、氣相色譜分析、HPLC，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種其他分析 步驟。本發(fā)明的裝置可以制作地結(jié)構(gòu)緊湊，這使得其更容易連接到并行設(shè)備，當(dāng)然較大型的 本發(fā)明的裝置也可以連接到其他設(shè)備。所述復(fù)用設(shè)備還有能力與用于多維分離平臺(tái)的其他分離設(shè)備整合，其中來(lái)自第一 維分離的每種“分餾物”裝載到復(fù)用系統(tǒng)的其中一個(gè)分離通道中。第一維分離示例包括但 不限于，溶液等電子聚焦、反相HPLC和離子交換色層分離。在一種實(shí)施方式中，包括8個(gè)聚丙烯酰胺分離凝膠的復(fù)用設(shè)備可以整合到溶液等 電子聚焦設(shè)備中。兩個(gè)設(shè)備組合可以提供類(lèi)似二維蛋白質(zhì)凝膠電泳法的基于溶液的分離技 術(shù)。在使用短小聚丙烯酰胺凝膠時(shí)，諸如小于2cm的凝膠，上述組合可以提供類(lèi)似于可以在 3小時(shí)的總運(yùn)行時(shí)間內(nèi)完成的2D凝膠的基于溶液的分離技術(shù)。II ·方法使用所述裝置來(lái)分離并收集生物分子的方法包括以下步驟(1)提供樣本或多個(gè) 樣本；(2)利用分離設(shè)備分離所述樣本；和(3)經(jīng)由收集腔收集來(lái)自分離設(shè)備的生物分子分
12餾物。A.樣本樣本包括生物分子。包括生物分子的任何樣本都可以利用本發(fā)明的裝置進(jìn)行分 離。例如，所述樣本可以表現(xiàn)為粗細(xì)胞提取物形式、部分提純的提取物形式或樣本與細(xì)胞分 餾物形式，諸如但不限于，膜分餾物、核分餾物、線(xiàn)粒體分餾物和細(xì)胞質(zhì)分餾物。樣本也可以 包括來(lái)自任何生命形式的體液，或者組織或器官提取物。部分提純分餾物也可以利用所述 裝置分離。在一種實(shí)施方式中，樣本包括待分離蛋白質(zhì)，而在另一種實(shí)施方式中，樣本包括 核酸。樣本還可以包括合成分子，諸如合成肽、蛋白質(zhì)、核酸等。樣本可以針對(duì)分離步驟進(jìn)行制備。制備取決于分離設(shè)備和分離設(shè)備中的材料。例 如，如果分離設(shè)備包括SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法，則樣本通常在包含SDS (十二烷基硫酸 鈉)的緩沖劑中煮沸而變性，并添加隨著緩沖劑前鋒遷移的染料。如果分離設(shè)備中的材料 包括瓊脂，例如，所述樣本制備成包括緩沖劑，凝膠在所述緩沖劑中運(yùn)行。B.分離分離步驟包括將樣本或多個(gè)樣本裝載到分離設(shè)備中，并運(yùn)行所述分離設(shè)備，以允 許樣本中的生物分子分離。樣本可以通過(guò)對(duì)特定分離所采用的標(biāo)準(zhǔn)方式裝載到分離設(shè)備上。例如，對(duì)于聚丙 烯酰胺凝膠電泳法來(lái)說(shuō)，液體樣本施加到凝膠上的容積中。在一種實(shí)施方式中，使用收集腔 的排出端口不帶閥的裝置，所述設(shè)備抬高到與水平方向的夾角大于10度的角度，以允許樣 本借助重力流向分離介質(zhì)的頂部。驅(qū)動(dòng)力，諸如用于聚丙烯酰胺介質(zhì)的電壓或用于離子交 換或凝膠過(guò)濾介質(zhì)的壓力啟動(dòng)，直到樣本遷移到分離設(shè)備的介質(zhì)中為止，此時(shí)，所述設(shè)備抬 高的角度可以落下，也可以不落下。接下來(lái)利用驅(qū)動(dòng)力進(jìn)行分離，移動(dòng)樣本中的生物分子通過(guò)分離介質(zhì)。如果收集腔 的存取端口不具有閥，則將所述設(shè)備保持在水平位置或傾斜位置，以便材料不會(huì)從收集腔 通過(guò)存取端口泄漏出來(lái)。如果收集腔的存取端口具有防止泄漏的閥，則所述設(shè)備可以在垂 直位置、水平位置或傾斜位置運(yùn)行。C.收集借助收集腔收集被分離的分餾物以取決于分離設(shè)備的方式實(shí)施。但是，對(duì)于所有 設(shè)備來(lái)說(shuō)，通過(guò)調(diào)節(jié)收集設(shè)備處于收集腔的進(jìn)入端口中的深度來(lái)調(diào)節(jié)收集腔的容積?？梢?在樣本裝載到收集腔之前或者此后的任何時(shí)間實(shí)施這項(xiàng)工作。在分離過(guò)程中，借助收集腔上的存取端口實(shí)施分餾物收集?？梢栽隍?qū)動(dòng)力操作的 同時(shí)進(jìn)行分餾物收集，或者可以在收集每一種分餾物的時(shí)候切斷驅(qū)動(dòng)力。如果在收集每種 分餾物的時(shí)候切斷驅(qū)動(dòng)力，則分離步驟以停止和運(yùn)行的循環(huán)進(jìn)行操作，在每個(gè)收集階段過(guò) 程中存在分離暫停，隨后在完成每個(gè)收集步驟之后，重新啟動(dòng)分離步驟。分餾物可以在相等的時(shí)間間隔之后收集，或者收集每一種分餾物之間的時(shí)間可以 變化。本發(fā)明的裝置允許使用者控制收集每種分餾物的時(shí)間，這相對(duì)于其他設(shè)備而言具有 優(yōu)勢(shì)。在一種實(shí)施方式中，在收集過(guò)程之間設(shè)置較短的時(shí)間間隔，以便于更快速地洗脫溶 質(zhì)，設(shè)置較長(zhǎng)的時(shí)間間隔以便更長(zhǎng)時(shí)間地洗脫溶質(zhì)?？刂剖占瘯r(shí)間導(dǎo)致對(duì)于較長(zhǎng)時(shí)間地洗 脫介質(zhì)來(lái)說(shuō)稀釋程度較輕。因?yàn)槭占槐３趾愣ㄈ莘e而非恒定流量，所以溶質(zhì)也會(huì)濃縮而 不是稀釋。因此，隨著分離步驟的進(jìn)行，連續(xù)收集過(guò)程之間的時(shí)間逐漸加長(zhǎng)，以適應(yīng)移動(dòng)緩慢的種類(lèi)。例如，在使用根據(jù)尺寸來(lái)分離蛋白質(zhì)介質(zhì)時(shí)，蛋白質(zhì)越大，則需要越長(zhǎng)的時(shí)間將 該特定蛋白質(zhì)帶從分離介質(zhì)中洗脫。為了保持相同分餾物中該特定蛋白質(zhì)的總量，則需要 通過(guò)加長(zhǎng)收集時(shí)間來(lái)適應(yīng)這種情況。由于排出端口處存在俘獲器(例如，分子量截止膜)， 所以樣本中的分子保持被俘獲在腔室中，直到它們被收集或除去的時(shí)刻為止。收集腔不僅用作收集樣本的腔室，還用作預(yù)濃縮腔室，在該腔室中，溶質(zhì)的絕對(duì)量 隨著時(shí)間增加。這是因?yàn)槭占槐３衷诤愣ㄈ莘e而非恒定流量。因此，在樣本裝載量處于 亞微克水平時(shí)，容積可調(diào)的收集腔也可以允許回收率更高。例如，如果裝載量處于亞微克水 平，則可以通過(guò)增大分離設(shè)備進(jìn)入收集腔進(jìn)入端口的深度而將收集腔的容積調(diào)節(jié)到較小容 積。容積較小的收集腔允許從亞微克樣本中更多地回收少量被分離的分子，因?yàn)榉肿釉谑?集腔中濃縮。上述分子俘獲器可以在分離步驟之前或過(guò)程中放置于收集腔中。這樣允許使用者 收集保持固相，即吸收到俘獲設(shè)備上的被分離分餾物。在使用收集腔中的俘獲設(shè)備時(shí)，也可 以隨著分子俘獲而同時(shí)收集液體分餾物。在該實(shí)施方式中，在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，收集兩種分餾 物一種包括分子俘獲器，包括處于分子俘獲器中的分子；另一種處于溶液中，包括沒(méi)有被 分子俘獲器截留的分子。在另一種實(shí)施方式中，可以針對(duì)分離步驟中收集的一些但不是全 部分餾物放置并收集分子俘獲器。可以在分離步驟中，經(jīng)由存取端口以新鮮的俘獲設(shè)備依 次替換所述俘獲設(shè)備。在一些是實(shí)施方式中，需要在收集每個(gè)樣本之后，替換收集腔中的緩沖劑。例如， 如果分離設(shè)備是聚丙烯酰胺凝膠電泳設(shè)備，則需要在收集每種液體分餾物之后向收集腔添 加緩沖劑。收集分餾物可以手工實(shí)施，或者可以借助分餾物收集器或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的其他設(shè)備自動(dòng)進(jìn)行收集。對(duì)于復(fù)用系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，所述使用方法類(lèi)似于帶有單一分離設(shè)備和收集設(shè)備的系統(tǒng)。在一種實(shí)施方式中，分離介質(zhì)是聚丙烯酰胺、瓊脂或類(lèi)型相似的凝膠。這種實(shí)施方 式，稱(chēng)為GeIFrEE(凝膠分餾物俘獲電泳法)，表示根據(jù)質(zhì)量分離樣本，諸如蛋白質(zhì)、核酸或 其他生物分子。本發(fā)明的這種復(fù)用設(shè)備可以在單次運(yùn)行中容納多個(gè)樣本。電壓應(yīng)用條件相 同，其他條件也是一樣，諸如溫度和溶劑緩沖劑組分。相同的樣本可以運(yùn)行多次，以重復(fù)數(shù) 據(jù)，或者獨(dú)立的樣本也可以同時(shí)運(yùn)行。在一種實(shí)施方式中，復(fù)用設(shè)備用于實(shí)施多維分離。對(duì)于單樣本分離和復(fù)用分離而言，從第一次分離收集的分餾物可以利用形式獨(dú)立 的分離步驟進(jìn)行額外的分餾。例如，對(duì)于蛋白質(zhì)分析而言，最常用的多維分離形式是2D凝 膠電泳技術(shù)，這種技術(shù)組合使用等電子聚焦(維度1)和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(維度 2)。雖然這種技術(shù)有其優(yōu)點(diǎn)，但是2D凝膠電泳存在若干已知的問(wèn)題，使得研究者希望更好 的替代方案。在一個(gè)方面，IEF方案與SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳相結(jié)合。在一種實(shí)施方式中，產(chǎn) 生8種樣本分餾物且容積為每樣本300 μ L級(jí)別的IEF設(shè)備，與利用本發(fā)明的裝置進(jìn)行的聚 丙烯酰胺凝膠電泳以及樣本收集(GeIFrEE)耦接。本發(fā)明包括與8個(gè)收集腔耦接的8個(gè)分 離設(shè)備的復(fù)用設(shè)備與上述IEF產(chǎn)生的8個(gè)樣本工作良好。通過(guò)這種方式，IEF與利用本發(fā) 明的設(shè)備進(jìn)行的分離與收集耦接的方案，2D凝膠實(shí)現(xiàn)的蛋白質(zhì)分離可以利用本發(fā)明的復(fù)用 裝置在溶液相實(shí)現(xiàn)。
III.按照附圖的實(shí)施方式在附圖中例示以及在說(shuō)明書(shū)中描述的特定設(shè)備和過(guò)程僅僅是附帶的權(quán)利要求書(shū) 所限定的本發(fā)明構(gòu)思的示例實(shí)施方式。因此，與文中公開(kāi)的實(shí)施方式相關(guān)的具體尺寸和其 他物理特征不應(yīng)該認(rèn)為是限制，除非權(quán)利要求中明確表明。圖1示出了本發(fā)明設(shè)備一種實(shí)施方式的截面圖。圖2示出了該實(shí)施方式的俯視圖。 附圖標(biāo)記10 —般指代圖1所示設(shè)備實(shí)施方式。收集腔20設(shè)置在分離設(shè)備30下游。收集 腔包括進(jìn)入端口 22、排出端口 24和存取端口 26。收集腔還包括分子量截止膜28。分離設(shè) 備30經(jīng)由進(jìn)入端口 22與收集腔20接合。在該實(shí)施方式中，進(jìn)入端口 22包括位于收集腔 20上游端的孔或柱體。排出端口 24將收集腔與下游腔室50連接。在排出端口 24處，存在 分子量截止膜28。收集腔還包括存取端口 26，所述存取端口包括孔或閥，可以通過(guò)所述孔 或閥存取收集腔內(nèi)容物。圖3、4和5示出了收集腔視圖。圖3示出了包含收集腔的塊體的三維視圖，示出 了排出端口 24和存取端口 26。圖4是收集腔的側(cè)視截面圖，示出了進(jìn)入端口 22、排出端口 24和存取端口 26。圖5是收集腔塊體的正視截面圖，示出了存取端口 26和位于進(jìn)入端口 和排出端口之間的收集腔內(nèi)部23。圖1中的分離設(shè)備30包括分離介質(zhì)34，所述分離介質(zhì)包括積層介質(zhì)或凝膠33和 分離凝膠或介質(zhì)35。分離介質(zhì)34可以是聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂或其他分離介質(zhì)。分離設(shè)備 30包括柱狀管38和包含在該管內(nèi)的分離介質(zhì)34。柱狀管38可以由玻璃、硅化玻璃或透明 塑料制成。圖1和2中的設(shè)備10還包括上游腔室40和下游腔室50。分離設(shè)備30的柱狀管 38的上游端32經(jīng)由其排出端口 42連接到上游腔室40。類(lèi)似地，分離設(shè)備30的柱狀管38 的下游端36經(jīng)由其進(jìn)入端口 52連接到下游腔室50。上游腔室40和下游腔室50還包括電 極44、54和端口 46、56。腔室40和50通常包含適合用于分離介質(zhì)的緩沖劑。設(shè)備10還包括各上游密封裝置和下游密封裝置60和70。上游密封裝置60包括 墊片62，所述墊片通常由橡膠制成；和位于墊片62任一側(cè)的板件64和66。下游密封裝置 70還包括通常以橡膠制成的墊片72，和位于墊片72上游端的板件74。所述設(shè)備可以借助 夾板或螺母例如78和螺栓67、77密封以防泄漏，如圖2所示。圖6示出了設(shè)備10 —種實(shí)施方式的照片。在操作中，設(shè)備10組裝起來(lái)，并且密封設(shè)備30位于進(jìn)入端口 22內(nèi)或收集腔20內(nèi) 的深度調(diào)節(jié)成設(shè)定收集腔的容積。為了在凝膠柱體周?chē)纬擅芊饧?，還使用了橡膠墊片。樣 本置于分離設(shè)備30的柱狀管38的上游端32內(nèi)，并允許其流向積層介質(zhì)或凝膠33的上游 端。實(shí)現(xiàn)這種目的的一種方法是傾斜裝置10，與水平方向形成大約30°的夾角，并允許樣 本借助重力向積層介質(zhì)33的上游端遷移。在上游電極44和下游電極54之間施加電勢(shì)，允 許樣本遷移到積層介質(zhì)33中。接下來(lái)可以任選將所述裝置下落到水平位置或者保持與水 平方向成30°夾角。如下述這樣收集樣本首先，暫停在電極44和54之間施加電勢(shì)。第 二，利用吸移管經(jīng)由存取端口 26存取所述收集腔，將收集腔20的全部容積轉(zhuǎn)移到潔凈玻璃 瓶中。第三，經(jīng)由存取端口 26將一部分新鮮緩沖劑裝載到收集腔中。第四，重新在電極44 和54之間施加電勢(shì)，以繼續(xù)分離過(guò)程。在分離過(guò)程中重復(fù)步驟1-4，在步驟1-4的每個(gè)循環(huán) 過(guò)程中收集分餾物。步驟1-4的每個(gè)循環(huán)之間的時(shí)間可以在分離過(guò)程中調(diào)節(jié)。可以在步驟2和3之間進(jìn)行調(diào)節(jié)分離設(shè)備30處于進(jìn)入端口 22內(nèi)的深度的額外步驟。復(fù)用設(shè)備的實(shí)施方式在圖7中示出，圖7是該設(shè)備的俯視圖。注意，圖7是放大視 圖，目的是便于觀察復(fù)用設(shè)備的部件。在操作中，例如收集腔120和下游腔室150之間的空 間關(guān)閉。附圖標(biāo)記110 —般指代圖7所示設(shè)備實(shí)施方式。類(lèi)似于圖1和2所示的設(shè)備，包 括收集腔120的塊體設(shè)置在分離設(shè)備130下游。每個(gè)收集腔包括進(jìn)入端口 122、排出端口 124和存取端口 126。每個(gè)收集腔還包括分子量截止膜128。分離設(shè)備130經(jīng)由進(jìn)入端口 122與收集腔120接合。排出端口 124將收集腔與下游腔室150連接。在排出端口 124處， 存在分子量截止膜128，所述膜在復(fù)用設(shè)備的該實(shí)施方式中是覆蓋全部排出端口 124的膜。 在其他實(shí)施方式中，每個(gè)排出端口具有單獨(dú)的分子量截止膜。在另一些實(shí)施方式中，每個(gè)收 集腔的每個(gè)排出端口可以具有尺寸不同的分子量截止膜。收集腔還包括存取端口 126，所述 存取端口 126包括孔或閥，可以通過(guò)所述孔或閥存取收集腔內(nèi)容物。在圖7所示實(shí)施方式 中，收集腔以一塊材料制備。在其他實(shí)施方式中，收集腔可以分別單獨(dú)制備，并與分離設(shè)備 130排列起來(lái)。圖7中的分離設(shè)備130包括兩個(gè)或更多個(gè)分離設(shè)備。在所示實(shí)施方式中，每個(gè)分 離設(shè)備包括柱狀管138，所述柱狀管包含分離介質(zhì)134。分離介質(zhì)134可以是聚丙烯酰胺凝 膠、瓊脂或其他分離介質(zhì)。柱狀管138可以用玻璃、硅化玻璃或透明塑料或者其他透明剛性 材料制成。圖7示出了分離設(shè)備彼此相通。在其他實(shí)施方式中，柱狀管可以具有不同直徑 和/或包含不同的分離介質(zhì)。圖7還示出了連接到6個(gè)收集腔的6個(gè)分離設(shè)備。分離設(shè)備 和收集腔的數(shù)目可以低至兩個(gè)，或者高至200個(gè)，或者取決于實(shí)際需要。在另一種實(shí)施方式 中，分離設(shè)備和收集設(shè)備的數(shù)目為8個(gè)，以適應(yīng)多通道吸移管。圖7中的設(shè)備110還包括上游腔室140和下游腔室150。分離設(shè)備130的柱狀管 138的上游端經(jīng)由其排出端口 142與上游腔室140連接。類(lèi)似地，分離設(shè)備130的柱狀管 138的下游端經(jīng)由其進(jìn)入端口 152連接到下游腔室150。上游腔室140和下游腔室150還 包括電極144和154。腔室140和150通常包含適合分離介質(zhì)的緩沖劑。圖7所示實(shí)施方 式具有一個(gè)上游腔室和一個(gè)下游腔室，全部分離設(shè)備連接到它們。在其他實(shí)施方式中，每個(gè) 分離設(shè)備連接到單獨(dú)的上游腔室和下游腔室。就是說(shuō)，如果存在8個(gè)分離設(shè)備，則存在8個(gè) 上游腔室和8個(gè)下游腔室。設(shè)備110還分別包括上游和下游密封裝置160和170。上游密封裝置160包括通 常以橡膠制成的墊片162和位于上游腔室140上游的板件164和位于墊片162下游的板件 166。下游密封裝置170還包括通常以橡膠制成的墊片172 ；和位于墊片172上游端的板件 172 ；和位于下游腔室150下游的第二板件176。墊片162和172在本實(shí)施方式中為一片橡 膠。在其他實(shí)施方式中，墊片可以包括橡膠環(huán)，每個(gè)分離設(shè)備有兩個(gè)橡膠環(huán)(上游和下游)。 所述設(shè)備借助螺母168和178以及螺栓167和177密封以防泄漏。所述設(shè)備還可以利用夾 板密封。圖8、9和10示出了收集腔的視圖。圖8示出了包含收集腔的塊體的三維示出，示 出了排出端口 124和存取端口 126。圖9是收集腔的側(cè)視截面圖，示出了進(jìn)入端口 122、排 出端口 124和存取端口 126。圖10是收集腔塊體的正視截面圖，示出了存取端口 126和位 于進(jìn)入端口和排出端口之間的通道123。復(fù)用設(shè)備的操作類(lèi)似于單用設(shè)備。裝置110組裝起來(lái)，并且調(diào)節(jié)分離設(shè)備130處
16于收集腔120的進(jìn)入端口 120內(nèi)的深度，以設(shè)定收集腔的容積。每個(gè)分離設(shè)備130處于進(jìn) 入端口 122內(nèi)的深度對(duì)于每個(gè)分離設(shè)備和進(jìn)入端口相同，因此為每個(gè)收集腔120設(shè)定相同 的容積。作為可選方案，每個(gè)分離設(shè)備130處于其各自進(jìn)入端口 122內(nèi)的深度相對(duì)于每個(gè) 分離設(shè)備和進(jìn)入端口可以不同，因此為一個(gè)或多個(gè)收集腔120設(shè)定不同的容積。樣本置于 分離設(shè)備130的柱狀管138的上游端132內(nèi)，并允許其流向分離介質(zhì)134的上游端。實(shí)現(xiàn) 這一目的的一種方式是傾斜裝置110，與水平方向成30°的夾角，并允許樣本借助重力向 積層介質(zhì)134的上游端遷移。在上游電極144和下游電極154之間施加電勢(shì)，允許樣本向 分離介質(zhì)134遷移。接下來(lái)可以任選將所述裝置放下到水平位置，或者保持與水平方向成 30°的夾角。如下所述收集樣本首先，暫停在電極144和154之間施加電勢(shì)。第二，利用 吸移管或多通道吸移管經(jīng)由存取端口 126存取所述收集腔，將收集腔120的全部容積轉(zhuǎn)移 到潔凈玻璃瓶或多井板中。第三，經(jīng)由存取端口 126將一部分新鮮緩沖劑裝載到收集腔中。 第四，重新在電極144和154之間施加電勢(shì)，以繼續(xù)分離過(guò)程。在分離過(guò)程中重復(fù)步驟1-4， 在步驟1-4的每個(gè)循環(huán)過(guò)程中收集分餾物。步驟1-4的每個(gè)循環(huán)之間的時(shí)間可以在分離過(guò) 程中調(diào)節(jié)?？梢栽诓襟E2和3之間進(jìn)行調(diào)節(jié)分離設(shè)備130處于進(jìn)入端口 122內(nèi)的深度的額 外(任選)步驟。在操作過(guò)程中，所述設(shè)備包含在箱體內(nèi)，所述箱體用來(lái)保護(hù)使用者免受高壓應(yīng)用損害。IV.示例文中所述的示例、實(shí)驗(yàn)和結(jié)果僅用于例述本發(fā)明，并不能以任何方式理解為限制 本發(fā)明的范圍。示例1 材料Milli-Q級(jí)的水提純到18. 2mco/cm。所有用于凝膠電泳的反應(yīng)劑 利用Bio-Rad(Mississauga，Ontario)獲得。3. 3kDa分子量截止?jié)B透膜從 FisherCanada(Mississauga, Ontario)采購(gòu)。所有的蛋白質(zhì)，包括胰島素(TPCK treated, cat. T8802)、凍干的枯草芽孢桿菌和其他化學(xué)品從Sigma(Oakville，Ontario)采購(gòu)。示例2:樣本制備枯草芽孢桿菌凍干細(xì)胞懸浮在純水中并在French壓力機(jī)中在8000psi下進(jìn)行細(xì) 胞溶解。溶解的細(xì)菌以13000xg進(jìn)行離心，并收集上層浮液。樣本存放在_20°C，直到準(zhǔn)備 使用。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)根據(jù)重量制備成接近濃度。為了保持一致，200 μ L的樣本裝載到設(shè)備中， 組合180 μ L的樣本與20 μ L的5χ裝載凝膠的緩沖劑(0. 25Μ Tris-HCl ρΗ 6. 8，10% w/v 505，50%丙三醇，0. 5% w/v溴酚藍(lán))。在裝載到柱體之前，樣本加熱到95°C，持續(xù)5分鐘。示例3 分離和收集設(shè)備除了所述柱體，這些示例中的GeIFrEE設(shè)備以Teflon構(gòu)造，并且如圖6所示。所 述設(shè)備包括4個(gè)主要部件陰極腔室、凝膠柱體、收集腔和陽(yáng)極電解腔。本例中所用分離設(shè)備是聚丙烯酰胺凝膠柱體，該凝膠柱體澆鑄在0. 8cm(外徑) x6. Ocm的玻璃管中。除了另外指出，凝膠柱體由1. Ocm高、澆鑄成15% T、2. 67% C的溶解 凝膠以及1. 5cm高、含4% T、2. 67% C的積層凝膠構(gòu)成。凝膠利用澆鑄分析用板條凝膠的 標(biāo)準(zhǔn)程序制備(Lamelli，1970)。樣本裝載到玻璃管的空白容積中，位于積層凝膠上方。制備工作完成后，在收集腔中俘獲并回收樣本。收集腔由圓形腔構(gòu)成，其直徑匹配包含凝膠柱的玻璃管的外徑。3. 5kDa分子量截止?jié)B透膜夾置在收集腔和陽(yáng)極電解腔之間， 并且隨著所述腔室?jiàn)A緊在一起而借助壓力密封(參見(jiàn)圖6A)。存取端口鉆設(shè)在所述腔室的 頂部，允許在不拆解所述設(shè)備的情況下，取出分餾物?？梢酝ㄟ^(guò)控制插入收集腔的凝膠柱體 深度來(lái)調(diào)節(jié)收集腔的容積。示例4:操作條件所述設(shè)備的操作分3個(gè)不同階段進(jìn)行描述⑴樣本裝載；⑵分離；和⑶收集。 對(duì)于樣本裝載來(lái)說(shuō)，所述設(shè)備的電解腔以及凝膠柱體上方的空白容積完全以運(yùn)行的緩沖劑 填充(0. 192M 丙三醇，0. 025M Tris，0. 1 % SDS) (Laemml i，1970)。IOOyL 的運(yùn)行緩沖劑也 引入收集腔中。為了便于裝載樣本，所述設(shè)備的陰極(裝載)端抬高到30°角，以便樣本借 助重力流向積層凝膠頭部。在所述系統(tǒng)上恒定施加240V電壓的情況下進(jìn)行分離。在樣本 完全遷移到凝膠( 10分鐘)之后，將所述設(shè)備放平，用于剩余的分離步驟。在染料前鋒 可見(jiàn)地進(jìn)入收集腔的時(shí)候，開(kāi)始收集過(guò)程。在收集過(guò)程中，暫停電力供應(yīng)，并利用吸移管將 收集腔的全部容積轉(zhuǎn)移到干凈玻璃瓶中。將100 μ L新鮮運(yùn)行緩沖劑裝載到收集腔中，并且 接通電源，以繼續(xù)分離步驟。在分離程序中重復(fù)這一過(guò)程，在每個(gè)停止并運(yùn)行的循環(huán)中收集 分餾物。圖6Β示出了在240V時(shí)，在該設(shè)備中，在0. 6cm直徑的丙烯酰胺凝膠上分離預(yù)先染 色的MW蛋白質(zhì)的梯度。照片是在進(jìn)入分離過(guò)程之后大約15分鐘時(shí)拍攝的，并且在向系統(tǒng) 第一次施加電壓時(shí)進(jìn)行測(cè)量。相對(duì)于較低電壓(120V)分離(結(jié)果未示出)而言，較高的電 壓應(yīng)用(高至240V)用于更快速地分離，而且不會(huì)損害帶條的分辨力。而且，6mm直徑的管 狀凝膠，與長(zhǎng)度至少為樣本塞頭兩倍的積層凝膠耦接，允許裝載至多200 μ L并與所述設(shè)備 有效疊置，相對(duì)于體積較小的樣本裝載量而言，沒(méi)有明顯的分辨力損失。從圖6中，可以看 到蛋白質(zhì)清楚地分離，類(lèi)似于在傳統(tǒng)分析板條凝膠中觀察到的情形。從圖6Β可以看到，最 小的蛋白質(zhì)(7kDa)在通過(guò)大約Icm的溶解凝膠遷移之后，從染料前鋒完全溶解出來(lái)。示例5:溶解凝膠柱體GeIFrEE(凝膠分餾物俘獲電泳)分餾物利用帶有15% T溶解板條凝膠的不連續(xù) SDS PAGE進(jìn)行分析。為此，20 μ L的GeIFrEE分離的分餾物與5 μ L的5χ凝膠裝載的緩沖 劑混合，并且20 μ L的這種混合物連同適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)樣品裝載到凝膠的各通道上。凝膠進(jìn)行 銀染色(SheVChenk0，et al. 1996)或考馬斯(coomassie)染色，并在平臺(tái)式掃描儀上掃描。圖IlA示出了從利用澆鑄成15% T的Icm長(zhǎng)的(溶解)凝膠柱體200 μ g枯草芽 孢桿菌中的蛋白質(zhì)組提取物分離過(guò)程中收集的分餾物。溶解凝膠的成分(即，％ T)是考 慮給定質(zhì)量范圍內(nèi)的分離分辨力時(shí)的重要參數(shù)。一般來(lái)說(shuō)，澆鑄成較低％ T的凝膠對(duì)于高 質(zhì)量種類(lèi)提供優(yōu)化的分辨力，而較高％ T有利于較低質(zhì)量范圍。雖然可以在狹窄的范圍上 進(jìn)行優(yōu)化，但是在本例中，利用GeIFrEE設(shè)備實(shí)現(xiàn)了較寬質(zhì)量范圍的蛋白質(zhì)組分離。為了分 餾質(zhì)量下限延伸到IOkDa以下的蛋白質(zhì)，需要最小15% T的凝膠。低于該值，蛋白質(zhì)連同緩 沖劑前鋒一起洗脫，因此無(wú)法分離。利用15% T的凝膠，即使對(duì)于分子量差異小至2kDa的 情況，也可以進(jìn)行部分分離。從圖IlA可以看出，從初始施加電壓起90分鐘時(shí)收集的最后蛋白質(zhì)分餾物包含近 似分子量介于150kDa到200kDa(從Rf值測(cè)量)的蛋白質(zhì)。分子量大于IOOkDa的蛋白質(zhì) 容易在1小時(shí)的運(yùn)行過(guò)程中收集?？焖俜蛛x是在短小凝膠柱體上采用大電場(chǎng)強(qiáng)度時(shí)進(jìn)行的
18運(yùn)行過(guò)程的結(jié)果。因此，圖11表明了在單獨(dú)一組操作條件下，在較寬質(zhì)量范圍內(nèi)對(duì)基本上 全部蛋白質(zhì)進(jìn)行的迅速分離。在制備電泳法中使用極短的溶解凝膠看起來(lái)不同尋常。但是，由于蛋白質(zhì)的分散 性質(zhì)，這種性質(zhì)有助于帶條在凝膠電泳中加寬，所以較長(zhǎng)的凝膠可能不能必然提供較高的 總體分辨力，特別是在樣本的全部質(zhì)量范圍內(nèi)(Yarmola and Charmbach，1998)。而且，假設(shè) 電場(chǎng)恒定，則較長(zhǎng)的凝膠需要成正比的較長(zhǎng)的分離時(shí)間。圖IlB示出了在3cm凝膠上實(shí)施 的同等分離分布圖。較長(zhǎng)凝膠的分離時(shí)間延長(zhǎng)到3小時(shí)，注意上部質(zhì)量范圍也達(dá)到了 Icm 凝膠分離的上部質(zhì)量范圍。此外，為了從收集腔回收樣本的原因，在3cm凝膠上運(yùn)行產(chǎn)生大 約3倍于分離過(guò)程分餾物的分餾物。如圖11所暗示，這種較長(zhǎng)凝膠的分辨力增益并沒(méi)有顯 著不同，特別是在超過(guò)30kDa的質(zhì)量范圍內(nèi)。此外，因?yàn)樵谑占筚|(zhì)量蛋白質(zhì)的過(guò)程中增加 了樣本稀釋?zhuān)詮?fù)合了工作負(fù)載增加，因?yàn)樗鼈冮_(kāi)始穿過(guò)多個(gè)分餾物洗脫。Icm凝膠柱體實(shí)際上在全部蛋白質(zhì)組范圍內(nèi)提供了令人印象非常深刻的分辨列， 同時(shí)因總分離時(shí)間最小而保持了生產(chǎn)能力最大。圖11中分離過(guò)程類(lèi)似地表示在連續(xù)洗脫 凝膠電泳設(shè)備中溶解的最大質(zhì)量范圍，特別是在這種有利的分解時(shí)間下。示例6 俘獲，收集腔的獨(dú)特特征通過(guò)逐漸增大后續(xù)分餾物收集過(guò)程之間的分離時(shí)間間隔，實(shí)現(xiàn)了明顯線(xiàn)性化的分 離過(guò)程，如SDS PAGE所顯示，(這實(shí)際上表示一種對(duì)數(shù)分子量分離)。時(shí)間是從圖11中表 示的總表示分離時(shí)間中推算出來(lái)的。因此，GeIFrEE分餾法容易克服連續(xù)洗脫電泳設(shè)備中 所遭遇的樣本稀釋問(wèn)題。換句話(huà)說(shuō)，由于連續(xù)洗脫系統(tǒng)采用恒流液體流從俘獲腔提取樣本， 所以分子量較大的種類(lèi)無(wú)可避免地收集在較大的容積中，因此被稀釋。這種情況來(lái)源于分 子量較大的種類(lèi)移動(dòng)性下降，這樣將增大蛋白質(zhì)帶條的洗脫窗口，所述窗口因分離過(guò)程中 的分散和其他處理而具有有限的寬度。利用GeIFrEE裝置，即便洗脫時(shí)間加長(zhǎng)，也能在洗脫 和樣本收集過(guò)程中保持恒定容積。收集時(shí)間間隔僅增加到匹配分子量較大的蛋白質(zhì)加大的 洗脫窗口。在所述實(shí)驗(yàn)中，200 μ L的樣本裝載量導(dǎo)致樣本濃度可能增大兩倍，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分 餾物以IOOyL的間隔收集。因此，由于避免了樣本過(guò)度稀釋?zhuān)运鲈O(shè)備可以在非常大 的質(zhì)量范圍進(jìn)行收集，這對(duì)于低至亞微克的裝載量來(lái)說(shuō)，特別有好處。從所述設(shè)備進(jìn)行樣本 回收的過(guò)程將在以下段落中詳細(xì)描述。示例7 從收集腔進(jìn)行回收GeIFrEE收集腔的一項(xiàng)重要特征就是3. 5kDa分子量截止膜的俘獲效率。再生醋酸 纖維素具有3. 5的等電離點(diǎn)(Pontie，1998)。在pH為8的操作緩沖劑中，所述膜將被負(fù)充電 (Pincet, 1995)，因此應(yīng)該排斥結(jié)合SDS的蛋白質(zhì)，防止結(jié)合到所述膜。實(shí)際上，在2. 5 μ g/ μ L的BSA溶液裝載到收集腔中(經(jīng)過(guò)所述柱體)的時(shí)候，在實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)，在240V的情 況下，進(jìn)行30分鐘的俘獲之后，觀察到可量化的回收率。蛋白質(zhì)損失的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)期隨著蛋白 質(zhì)濃度下降而升高，因此類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)利用50iig/yL BSA(100yL總裝載量)來(lái)實(shí)施。用于 分析樣本的考馬斯染色凝膠分布圖給出在俘獲間隔從5到15分鐘的范圍內(nèi)，觀察到了較高 的回收率，表示俘獲膜并沒(méi)有顯著影響該設(shè)備的樣本損失。在30分鐘的俘獲時(shí)間處，凝膠 中的帶條強(qiáng)度與一些樣本損失一致。因此，對(duì)于給定的分餾物來(lái)說(shuō)，俘獲時(shí)間間隔在整個(gè)實(shí) 驗(yàn)中保持低于15分鐘，以便防止在在收集腔內(nèi)進(jìn)行的更長(zhǎng)時(shí)間的俘獲過(guò)程中樣本損失到 所述膜。
19
示例8 =GeIFrEE設(shè)備的裝載容量已經(jīng)描述了在連續(xù)洗脫制備電泳法中從聚丙烯酰胺凝膠回收的蛋白質(zhì)取決于 樣本裝載量，隨著所述設(shè)備上的裝載量從每平方厘米凝膠3mg下降到100 μ g，而產(chǎn)率從 90%下降到60%的(Chrambach and Rodbard，1971)。在一定的樣本裝載量范圍上探索了 GeIFrEE設(shè)備的樣本回收率(0. 3cm2凝膠柱體)，從亞毫克到微克量。收集腔俘獲并濃縮樣 本的效率提供了從所述設(shè)備較高的樣本回收率。利用細(xì)胞色素C作為單一目標(biāo)蛋白質(zhì)，裝 載0. 5 μ g(在200 μ L中)并從GeIFrEE實(shí)驗(yàn)進(jìn)行回收，隨后在銀染色分析板條凝膠上顯示。 結(jié)果在圖12Α中示出，并表示對(duì)從GeIFrEE分離中總收集分餾物的1/5進(jìn)行分析。在該凝膠 中最大裝載10 η g細(xì)胞色素C接近銀染色的檢測(cè)極限，而在GeIFrEE分離中，容易在單一分 餾物中觀察到蛋白質(zhì)，這表示分離窗口為2分鐘。在更大的樣本裝載量(高至200 μ g細(xì)胞 色素C)，在不存在明顯分辨力損失的情況下，觀察到較高的回收率(圖12B)。但是，在Img 裝載量時(shí)，分辨力開(kāi)始削弱，正如考馬斯染色凝膠中所顯示的那樣(圖12C)。由于有效的疊 加和樣本收集，對(duì)于蛋白質(zhì)組混合物來(lái)說(shuō)，0. 6cm的i. d.的凝膠柱體可以適應(yīng)高至2. 5mg的 樣本裝載量。圖13A、B和C分別示出了在蛋白質(zhì)總裝載量為lmg、0. 5mg和0. Img時(shí)，對(duì)于 5個(gè)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)混合物來(lái)說(shuō)，分辨力保持不變。此外，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)通道進(jìn)行帶條強(qiáng)度比較， 暗示出在該質(zhì)量范圍以及在所述樣本裝載量的情況下，全部蛋白質(zhì)的回收率較高。要注意， 圖13中的標(biāo)準(zhǔn)通道考慮了來(lái)自樣本裝載量與收集之間容積減小而產(chǎn)生的兩倍樣本富集因 素。通過(guò)以較高分辨力回收蛋白質(zhì)(即，在單一分餾物中)，并通過(guò)避免蛋白質(zhì)從凝膠柱體 洗脫之后不必要的稀釋?zhuān)沟脴颖緭p失最小化。因此，這樣的結(jié)果表明GeIFrEE樣本分餾以 及收集如何在一定范圍的樣本裝載量上提供極高的蛋白質(zhì)回收率。示例9:再現(xiàn)性GeIFrEE過(guò)程的再現(xiàn)性高度取決于運(yùn)行緩沖劑以及澆鑄凝膠柱體的一致性。凝膠 的成分(％T、％ C、聚合過(guò)程)，以及柱體長(zhǎng)度，必須保持，以提供恒定的洗脫時(shí)間。圖13Α 和B顯示了利用相同的條件以及相同的收集時(shí)間通過(guò)GeIFrEE分離的5種蛋白質(zhì)混合物的 凝膠曲線(xiàn)。圖像揭示出被收集蛋白質(zhì)的體積在相同的被收集分餾物中大致相同，或者換句 話(huà)說(shuō)，這些蛋白質(zhì)在相同的時(shí)間周期內(nèi)從凝膠柱體洗脫。圖13C表示同等的5種蛋白質(zhì)混 合物分離，除了分餾物收集時(shí)間較之前述圖像向后偏移一分鐘。預(yù)期觀察到蛋白質(zhì)的分餾 數(shù)量更低。這表明收集時(shí)間的較小變化(通常90分鐘的運(yùn)行中的1分鐘)對(duì)于樣本洗脫 分布圖的強(qiáng)烈影響。雖然如此，在受控的一組操作條件下，GeIFrEE設(shè)備提供了再現(xiàn)性高的 分離過(guò)程。較高的再現(xiàn)性最終允許使用者直接根據(jù)給定一組條件下的運(yùn)行時(shí)間來(lái)預(yù)測(cè)洗脫 蛋白質(zhì)的分子量范圍。對(duì)于有目的的收集分子量已知的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，這特別有用。這種特 點(diǎn)還給出而來(lái)固有的分子量信息，以協(xié)助識(shí)別蛋白質(zhì)。參考文獻(xiàn)Brunner, Ε. ；Ahrens, C. H. ；Mohanty, S. ；Baetschmann, , H. ；Loevenich, S.； Potthast, F. ；Deutsch, Ε. W. ；Panse, C ；Lichtenberg, U. ；Rinner, 0. ；Lee, H. ；Pedrioli, P. G. A ；Malmstrom J. ；Koehler, K. ；Schrimpf, S. ；Kri jgsveld, J. ；Kregenow, F. ；Heck, F. ；Heck, A. J. R. ；Hafen, Ε. ；Schlapbach, R. ；Aebersold, R. Nat. Biotechnol. 2007, 25, 576-583.Bushey, Μ. Μ. Jorgenson，J. W. Anal. Chem. 1990，61，161-167.
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2權(quán)利要求
一種裝置，包括a)分離設(shè)備；和b)收集腔，所述收集腔包括i)適配成接收所述分離設(shè)備端部的進(jìn)入端口；ii)包括俘獲介質(zhì)的排出端口；和ii)位于所述進(jìn)入端口和排出端口之間的存取端口，其中，通過(guò)調(diào)節(jié)所述分離設(shè)備相對(duì)于所述存取端口處于所述進(jìn)入端口中的深度來(lái)調(diào)節(jié)所述收集腔的容積。
2.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述分離設(shè)備包括電泳分離設(shè)備。
3.如權(quán)利要求2所述的裝置，其特征在于，所述分離設(shè)備包括分離路徑長(zhǎng)度為IOcm以 下的分離設(shè)備。
4.如權(quán)利要求2或3所述的裝置，其特征在于，所述分離設(shè)備包括含有二聚丙烯酰胺或 瓊脂的分離介質(zhì)。
5.如權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述分離設(shè)備包括聚丙烯酰胺凝 膠，所述凝膠包括高度為6. Ocm以下且直徑大約為0. 2-1. Ocm的溶解凝膠。
6.如權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述收集腔包含可拆卸的俘獲ο
7.如權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于，所述收集腔包括兩個(gè)以上的可拆卸的俘獲ο
8.如權(quán)利要求6或7所述的裝置，其特征在于，所述俘獲器包括疏水俘獲器、親水俘獲 器、離子交換俘獲器、分子量截止俘獲器、親和性俘獲器或者它們的組合。
9.如權(quán)利要求6至8任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述俘獲器頭對(duì)頭布置。
10.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述收集腔內(nèi)的所述存取端口進(jìn)一步包括閥。
11.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述俘獲介質(zhì)包括分子量截止值大約為 IkDa到大約IOkDa的膜。
12.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述裝置以基本上化學(xué)惰性的、非導(dǎo)電的 材料構(gòu)成。
13.如權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述裝置包括兩個(gè)或更多個(gè)收集腔。
14.如權(quán)利要求13所述的裝置，其特征在于，所述收集腔用單獨(dú)一塊材料構(gòu)造。
15.如權(quán)利要求13所述的裝置，其特征在于，所述存取端口之間的間隔設(shè)計(jì)成容納標(biāo) 準(zhǔn)多通道吸移管管理器。
16.如權(quán)利要求13至15任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述存取端口設(shè)計(jì)成容納標(biāo) 準(zhǔn)吸移管末端。
17.如權(quán)利要求11所述的裝置，其特征在于，所述收集腔設(shè)置在彼此的下游，與所述分 離設(shè)備成一列。
18.如權(quán)利要求13所述的裝置，進(jìn)一步包括兩個(gè)以上的分離設(shè)備。
19.如權(quán)利要求11所述的裝置，其特征在于，所述分離設(shè)備的數(shù)目等于所述收集腔的 數(shù)目，并且每個(gè)收集腔緊接在分離設(shè)備的下游設(shè)置。
20.如權(quán)利要求18或19所述的裝置，其特征在于，所述分離設(shè)備和所述收集設(shè)備并排 排列。
21.如權(quán)利要求20所述的裝置，其特征在于，包括并排排列的分離設(shè)備和收集腔的所 述裝置成平面狀結(jié)構(gòu)。
22.如權(quán)利要求20所述的裝置，其特征在于，包括并排排列的分離設(shè)備和收集腔的所 述裝置配置成弧形、半圓或半橢圓形。
23.如權(quán)利要求20所述的裝置，其特征在于，包括并排排列的分離設(shè)備和收集腔的所 述裝置配置成管狀結(jié)構(gòu)。
24.如權(quán)利要求23所述的裝置，其特征在于，所述管形結(jié)構(gòu)是柱狀或橢圓狀。
25.如權(quán)利要求13至16或18至24任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述裝置進(jìn)一步 包括設(shè)置在所述分離設(shè)備上游的上部腔室和設(shè)置在所述收集腔下游的下部腔室。
26.如權(quán)利要求13至16或18至25任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述裝置包括8 個(gè)分離設(shè)備和8個(gè)收集腔。
27.一種利用上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的裝置從一個(gè)或多個(gè)樣本中提純多種分子或分 子分餾物的方法，所述方法包括步驟a)提供一個(gè)或多個(gè)樣本；b)利用所述分離設(shè)備分離分子；和c)經(jīng)由所述收集腔中的所述存取端口依次收集多種分餾物。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，進(jìn)一步包括步驟向所述分離設(shè)備施加樣本，其中所述 設(shè)備的裝載端抬高到與水平方向的夾角大于10度。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，進(jìn)一步包括步驟允許所述樣本向所述分離設(shè)備中遷 移，然后放下所述設(shè)備，使其與水平方向的夾角小于10度。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述分離步驟在停止并運(yùn)行的循環(huán)中實(shí) 施，在每個(gè)收集步驟中暫時(shí)停止分離步驟，隨后在完成每次收集步驟之后，重新啟動(dòng)分離步 馬聚ο
31.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，在所述裝置處于水平位置的同時(shí)，實(shí)施所 述分離步驟和收集步驟。
32.如權(quán)利要求27所述的方法，進(jìn)一步包括步驟通過(guò)調(diào)節(jié)所述分離設(shè)備處于所述收 集腔的所述進(jìn)入端口中的深度來(lái)調(diào)節(jié)所述收集腔的容積。
33.如權(quán)利要求27至32任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，被收集的分餾物中的分子較 之它們?cè)跇颖局械臐舛龋哂邢嗤蚋蟮臐舛取?br> 34.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述分餾物包括可拆卸的俘獲器。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述分餾物包括所述收集腔內(nèi)的可拆卸 的俘獲器和溶液。
36.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述樣本包括粗細(xì)胞提取物、局部提純的 提取物、或者先前通過(guò)等電子聚焦或其他方法分離的樣本。
37.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述裝置是權(quán)利要求3至9任一項(xiàng)所述的 裝置，并且利用大約240伏特的電壓對(duì)分子進(jìn)行分離。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述分離和收集步驟在大約100分鐘內(nèi)實(shí)施。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，被分離的分子是蛋白質(zhì)，介于大約5kDa到 大約200kDa之間，并且分子量偏差大約5kDa的分子被有效地分離。
40.如權(quán)利要求27所述的方法，進(jìn)一步包括步驟在每次收集步驟之后，向所述收集腔 添加緩沖劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于在分離步驟之后俘獲并收集被分離的生物分子的設(shè)備。本發(fā)明提偶那個(gè)一種包括分離設(shè)備和收集腔的裝置。所述收集腔包括適配成接收所述分離設(shè)備端部的進(jìn)入端口；包括俘獲介質(zhì)的排出端口和位于所述進(jìn)入端口和排出端口之間的存取端口，其中，通過(guò)調(diào)節(jié)所述分離設(shè)備相對(duì)于所述存取端口處于所述進(jìn)入端口的深度來(lái)調(diào)節(jié)所述收集腔的容積。
文檔編號(hào)C25B9/00GK101896250SQ200880119863
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2008年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月9日
發(fā)明者約翰·C·特蘭, 艾倫·A·道塞特 申請(qǐng)人:達(dá)爾豪西大學(xué)