專利名稱：腸道益生菌發(fā)酵培養(yǎng)物對天然藥物的轉(zhuǎn)化與修飾的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然藥物組合物的生產(chǎn)方法，特別是涉及利用仿生學(xué)原理，并借助模擬人腸道微生態(tài)環(huán)境的腸道益菌共生發(fā)酵培養(yǎng)物對任何植物或動物來源的天然藥物進行生物學(xué)轉(zhuǎn)化和修飾，以改善所說的天然藥物的生物學(xué)活性并降低或消除其毒性的方法。本發(fā)明進一步涉及所說的方法在制備天然中草藥制劑中的應(yīng)用。
中草藥在東方國家特別是中國的臨床應(yīng)用已有數(shù)千年的歷史，但人類卻一直無法解釋中草藥藥理作用的科學(xué)機理。隨著人體微生態(tài)學(xué)研究的不斷深入，人們認(rèn)識到人腸道內(nèi)菌叢的微生態(tài)學(xué)改變可能與中醫(yī)學(xué)中所說“癥”存在著十分密切地內(nèi)在相互聯(lián)系，一方面中草藥的調(diào)理作用可以改善腸道有益和有害細菌間的平衡；另一方面，平衡的腸道微生態(tài)環(huán)境亦將有利天然藥物的吸收、轉(zhuǎn)化、運輸及生物學(xué)作用的發(fā)揮。
中草藥治病的物質(zhì)基礎(chǔ)是其所含有的化學(xué)物質(zhì)，這些化學(xué)物質(zhì)以傳統(tǒng)的湯劑即水提取物的形式經(jīng)口進入人體之后，可表現(xiàn)有不同的運轉(zhuǎn)途徑(1)原型化合物被機體吸收并進入循環(huán)發(fā)揮其藥理作用；(2)原型化合物被機體吸收，經(jīng)肝腸循環(huán)或在組織或血液內(nèi)經(jīng)過一系列代謝加工后發(fā)揮其藥理作用；(3)化合物不被吸收，只能隨糞便排出體外；(4)藥物或其原型化合物在腸道正常菌群的作用下發(fā)生某些由腸道細菌代謝酶導(dǎo)致的化學(xué)改變，改善了其吸收率、運轉(zhuǎn)速度及生物學(xué)活性，從而在降低毒副作用的同時更有利于其藥理學(xué)功能的發(fā)揮。因此，從實驗室藥代動力學(xué)研究和臨床應(yīng)用觀察兩方面入手，深入研究人腸道厭氧菌對天然藥物化合物的加工與代謝轉(zhuǎn)化，對于闡明傳統(tǒng)中藥的作用機理具有十分重要的意義。
自十九世紀(jì)五十年代以來，已有許多研究者利用不同的動物模型和方法，研究了腸道正常菌群對天然藥物或其有效成分的轉(zhuǎn)化及結(jié)構(gòu)修飾。許多體內(nèi)和體外研究證明，腸道正常菌群對以湯劑(水提取物)形式導(dǎo)入的天然化合物存在一個生物轉(zhuǎn)化和結(jié)構(gòu)修飾的復(fù)雜代謝加工過程，從而對天然中草藥的體內(nèi)吸收、運輸、代謝及作用的發(fā)揮起著重要作用。例如，Dooth等人(Dooth AN et al..，J.Biol.Chem.，223251，1956)的早期研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠經(jīng)口灌服槲皮素后，尿中可檢出3，4-二羥基苯乙酸等B環(huán)裂解產(chǎn)物，但預(yù)先給動物投用抗生素(如新霉素)，尿中則不能檢出這些槲皮素代謝產(chǎn)物。結(jié)果提示這些裂解產(chǎn)物是經(jīng)腸內(nèi)細菌代謝轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的。Drasar和Hill(“Human Intestinal Flora”，Academic press，1974)進一步發(fā)現(xiàn)，預(yù)先給大鼠腹腔內(nèi)注射抗生素抑制腸道細菌后，再口服投用含有強毒性苦杏仁苷的中藥杏仁，動物沒有發(fā)生苦杏仁苷所致的毒性反應(yīng)。另外，將苦杏仁苷與分離的小鼠腸道細菌一起保溫，發(fā)現(xiàn)腸桿菌和腸球菌能夠?qū)⒖嘈尤受账獬杀揭掖茧?，并進而分解產(chǎn)生可從其排泄物檢測出來的有毒性的氫腈酸(Scheline RK，Pharmacol.Rev.，25；451，1973)。也已證明，真桿菌Eubacterium sp.CLH可借助其產(chǎn)生的β-葡糖醛酸酶，將甘草的主要成分苷草甜素轉(zhuǎn)化成甘草次酸。小橋恭一等人(和成醫(yī)藥學(xué)雜志，15(1)1-13，1998)使用限菌大鼠和無菌大鼠模型進行的實驗進一步證明，口服投用的甘草甜素只有在腸道內(nèi)被細菌酶水解成甘草次酸后才能通過腸粘膜細胞被吸收(血漿內(nèi)甘草次酸水平升高)，并進而在體內(nèi)發(fā)揮其保肝作用(導(dǎo)致血清AST和ACT轉(zhuǎn)氨酶降低)。另外，還有的實驗觀察到，將羊的腸內(nèi)容物與豆科植物來源的異黃酮類化合物一起保溫，可導(dǎo)致這些化合物的結(jié)構(gòu)改變，即可使7-羥基-4-甲基異黃酮轉(zhuǎn)化成大豆糖苷配基和epuol，同時使鷹嘴豆芽素A轉(zhuǎn)化成染料木黃酮。表明羊腸道內(nèi)容物中的腸道菌群具有生物轉(zhuǎn)化異黃酮類化合物的能力(Niissou，A，et al.，Biochem.Biophys.Acta，14892，1967)。
上述這些及其他許多實驗均提示，已知結(jié)構(gòu)或未知結(jié)構(gòu)的天然藥物，如通過胃腸道途徑攝入體內(nèi)后，必須經(jīng)過腸道內(nèi)菌群或其代謝產(chǎn)物的作用，并發(fā)生某些結(jié)構(gòu)改變后才能被吸收并發(fā)揮其生物學(xué)活性。然而，現(xiàn)在技術(shù)中尚沒有關(guān)于利用已知的益生菌在人體外加工和處理某些藥物，特別是未知結(jié)構(gòu)的天然藥物組合物，以激活、誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或修飾其中的有效成分，使之在經(jīng)口攝入體內(nèi)后更有效地發(fā)揮其生物學(xué)作用的報導(dǎo)。而且迄今為止也未見使用益生菌體外發(fā)酵處理天然藥物制劑，以改善其生物活性并在臨床上獲得成功應(yīng)用的報道。
本發(fā)明人在以前研制腸道益生菌制劑及抗腫瘤天然藥物的長期實踐中，依據(jù)仿生學(xué)原理，利用在人體內(nèi)分布廣泛并且作用確切的多種腸道益生菌與多種天然藥物組合物的水提取物一起發(fā)酵，結(jié)果令人驚喜發(fā)現(xiàn)，所說的天然藥物組合物經(jīng)腸道益生菌及其代謝產(chǎn)物的發(fā)酵處理后，顯著地提高了體內(nèi)藥理學(xué)活性。據(jù)此，本發(fā)明人成功地完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的一個目的是提供一種生產(chǎn)天然中藥藥物制劑的方法，該方法包括在加有天然藥物提取物的營養(yǎng)培養(yǎng)基中接種一種或多種腸道益生菌，并在適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件下發(fā)酵培養(yǎng)之。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的方法是首先制備一種或多種益生菌的共生發(fā)酵培養(yǎng)物，然后向培養(yǎng)物中加入預(yù)制備的一種或多種天然藥物的提取物或未經(jīng)泡制的天然藥物粉末，并繼續(xù)混合發(fā)酵培養(yǎng)之。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的方法是將預(yù)制備的一種或多種天然藥物的提取物或其未經(jīng)泡制的粉末加入到適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中，然后向如此得到的混合物中接種一種或多種腸道益生菌并共生發(fā)酵培養(yǎng)之。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的益生菌選自雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、丙酸菌屬、明串珠屬及芽孢桿菌屬的一種或多種人腸道非致病菌。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的益生菌選自兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、嗜酸性乳桿菌、保加利亞乳桿菌、奶酪乳桿菌、德氏乳桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、嗜檸檬酸明串珠菌、枯草芽孢桿菌和地衣形芽孢桿菌。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的天然藥物是具有任何預(yù)防和/或治療作用并含有一種或多種可被人正常腸道細菌及其代謝產(chǎn)物加工或修飾的任何植物或動物來源的藥物或其組合物。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的天然藥物是一種或多種天然藥物組合物的水提取物或有機溶劑提取物，或這些藥物的未經(jīng)泡制的固體粉末。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實施方案，其中是所說的有機溶劑選自甲醇、乙醇、正丙醇、乙丙醇、甲醚、乙醚、二甲醚、丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙腈或它們的混合物。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實施方案，其中是所說的天然藥物選自祛邪扶正藥、補氣善血藥、健脾益腎藥、軟堅化瘀藥、化痰祛濕藥、消炎排毒藥、生精補血藥、利尿補氣藥或它們的混合物。
本發(fā)明涉及天然藥物組合物的生產(chǎn)方法，特別是涉及利用仿生學(xué)原理，并借助模擬人腸道微生態(tài)環(huán)境的腸道益菌共生發(fā)酵培養(yǎng)物對任何植物或動物來源的天然藥物進行生物學(xué)轉(zhuǎn)化和修飾，以改善所說的天然藥物的生物學(xué)活性并降低或消除其生理毒性的方法。本發(fā)明進一步涉及所說的方法在制備天然中草藥制劑中的應(yīng)用。
眾所周知，天然中草藥的水煎煮工藝是中藥泡制中使用最為廣泛、歷史最為悠久的生藥加工工藝。然而，水煎煮工藝(中藥湯劑生產(chǎn)工藝)雖然操作簡單，但也存在著很嚴(yán)重的缺陷，即一方面很難使藥物中的水溶性成分充分煎出，另一方面還可造成絕大部分脂溶性成分的丟失。近幾十年來，許多基礎(chǔ)和應(yīng)用研究者汲取西方醫(yī)藥學(xué)的現(xiàn)代藥品生產(chǎn)技術(shù)，已在傳統(tǒng)的水提取法的基礎(chǔ)上引入醇或其他有機溶劑提取方法，但這些方法仍存在有機溶劑的殘留、藥物吸收率較低及活性較差的問題。二十世紀(jì)九十年代初，有人曾提出以所謂的“半仿生提取法”制備中藥制劑，試圖模擬口服給藥經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運過程，分別用酸性水溶劑和堿性水溶劑提取中藥有效成分，以期有利于小腸的吸收。然而，該方法過于簡單地看待了人體的內(nèi)環(huán)境，另外也忽視了中藥成分的復(fù)雜性。事實上，人的胃腸道內(nèi)是一個有著差不多超過人體細胞總數(shù)10倍的近100種有益和有害細菌的微生態(tài)環(huán)境，而遠不只是簡單的偏酸或偏堿性環(huán)境。另外，每味中藥幾乎都是一個包括許多種化學(xué)物質(zhì)的復(fù)雜的化合物庫，而不是像合成藥物那些只存在某種單一化合物。因此，簡單地模擬胃腸道中的酸和堿性條件體外泡制中藥將很難達到預(yù)期的中草藥泡制效果。
本發(fā)明人在研制微生態(tài)和中藥制劑的長期實踐中發(fā)現(xiàn)，使用適當(dāng)選擇的益生菌培養(yǎng)物處理包括多種天然藥物的中藥水煎劑，或者在預(yù)先制備的中藥組合物水煎劑中加入所說的三株益生菌共同發(fā)酵，可使經(jīng)益生菌發(fā)酵處理的中藥制劑顯著地提高了預(yù)期的藥理學(xué)活性，同時也在一定程序上降低其非特異性生理毒性。
本發(fā)明的目的是提供一種利用仿生學(xué)原理，并借助模擬人腸道微生態(tài)環(huán)境的腸道益菌共生發(fā)酵培養(yǎng)物對任何植物或動物來源的天然藥物進行生物學(xué)轉(zhuǎn)化和修飾，以改善所說的天然藥物的生物學(xué)活性并降低或消除其毒性的方法，該方法包括(1)分別按常規(guī)方法制備植物來源和動物來源的天然藥物的提取物，然后分別在減壓下濃縮并混合之；(2)在含有上述步驟(1)中制得的天然藥物提取物的發(fā)酵容器內(nèi)，依次接種選擇的益生菌菌株，并在適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件下發(fā)酵培養(yǎng)所說的菌株；(3)發(fā)酵完成并加熱殺死或不殺死益生菌后，收集發(fā)酵培養(yǎng)物。
根據(jù)本發(fā)明，其中所說的益生菌可以是人腸道中固有的任何有益無毒細菌，其中包括選自乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、雙歧桿菌屬、明串珠菌屬及芽孢桿菌屬的一種或多種細菌。
作為舉例，其中優(yōu)選的菌種包括但不只限于嗜酸性乳桿菌、植物乳桿菌、德氏氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌、奶酪乳丁菌或其混合物、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌、長雙歧桿菌或其混合物、嗜熱鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、嗜檸檬酸、明串珠菌(Leucenostoc citrovorum)、謝氏丙酸菌(Propionibacterium shermanii)、枯草芽孢桿菌及地衣形芽孢桿菌。為本發(fā)明的目的，其中特別優(yōu)選的是嗜酸性乳桿菌、雙歧桿菌(包括嬰兒雙歧桿菌、兩歧雙歧桿功和和短雙歧桿菌)、嗜熱鏈球菌和糞鏈球菌以及屎腸球菌。
一般說來，對益生菌菌種(或菌株)的選擇沒有特殊的限制，但從仿生學(xué)和生態(tài)平衡的角度考慮，最好選用兩種或兩種以上(甚至多達九種)分布于人正常腸道不同部位，而且具有功能互補性的一組益生細菌。作為一個具體實例，本發(fā)明選用包括嗜酸性乳桿菌、雙歧桿菌(包括短雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌)和屎腸球菌在內(nèi)的一組三種益生菌。
眾所周知，嗜酸性乳桿菌、雙歧桿菌和屎腸球菌均為人腸道正常益生菌。從這三種細菌的正常體內(nèi)分布來看，它們分別見于腸道的不同部位，并可在小腸和結(jié)腸的不同部位發(fā)揮其優(yōu)勢益生功能。例如嗜酸性乳桿菌主要定居于迥腸部位，它能夠在腸道內(nèi)合成維生素、輔助食物消化、促進宿主新陳代謝，并增強宿主對乳糖的耐受性。雙歧桿菌是人體最重要的生理性細菌，主要分布在結(jié)腸內(nèi)，它對于人體的營養(yǎng)、生長發(fā)育、生物拮抗及免疫功能均具有重要促進作用。屎鏈球菌則主要存在于盲腸部位，其具有明顯地降低血膽固醇水平的作用。因此，本發(fā)明優(yōu)選上述三種在人體內(nèi)數(shù)量較大，總體分布廣泛，而且生理學(xué)活性顯著的益生菌。本發(fā)明人確信，上述三株益生菌的選擇，是完全符合本發(fā)明所依據(jù)的仿生學(xué)原理的。
另外，為了更有利于益生菌的存活，亦可選用包括嗜酸性乳桿菌、謝氏丙酸菌和嗜檸檬酸明串珠菌在內(nèi)的一組三種益生菌。其中(1)丙酸菌可將嗜酸性乳桿菌在腸道內(nèi)產(chǎn)生的過量乳酸轉(zhuǎn)化成丙酸和二氧化碳，從而可阻止霉菌和酵母菌生長；(2)丙酸菌可合成能夠分解乙醛的醇脫氫酶(已知酵母在腸道中生長可產(chǎn)生有害的代謝產(chǎn)物乙醛)；(3)嗜檸檬酸明串珠菌可利用簡單的糖和檸檬酸，并可由之產(chǎn)生有利于嗜酸性乳桿菌和丙酸菌生長的二氧化碳。
根據(jù)本發(fā)明，其中所說中藥組合物是一味以上植物來源和動物來源的中藥，并且所說的中藥可以是未改變其基本組織結(jié)構(gòu)的生藥，或其水提取物或有機溶劑提取物。這里所說的有機溶劑包括但不只限于甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇等醇，甲醚、二甲醚、乙醚等醚、丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲酸乙酯、乙酸乙酯或它們混合物。然而，從安全性和有利于發(fā)醇過程進行角度看，所說的藥物最好是天然藥物的水提取物。
從藥理學(xué)功能上說，可依據(jù)本發(fā)明的原則和方法進行體外發(fā)酵處理的天然藥物組合物包括但不只限于溫中理氣藥、清熱解毒藥、祛邪扶正藥、補氣養(yǎng)血藥、健脾益腎藥、軟堅化瘀藥、化痰祛濕藥、消炎排毒藥、生精補血藥、利尿補氣藥或它們的混合物。
用于培養(yǎng)和增殖本發(fā)明中使用的益生菌的培養(yǎng)基，可以是含有細菌生長所需的碳源、氮源、必要的維生素及礦物質(zhì)的任何已知的常規(guī)培養(yǎng)基。但為了盡可能地降低大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的成本，簡化生產(chǎn)工藝并補充大豆異黃酮、可溶性食物纖維及大豆寡糖(如水蘇糖和棉籽糖)等有益成分，本發(fā)明優(yōu)先選用由大豆芽蒸煮液、蛋白酶解牛肉肉湯、酵母浸膏、糖及礦物質(zhì)組成的培養(yǎng)基。本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基不同于常規(guī)細菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其主要特征在于其中除含有基本碳源(葡萄糖和蔗糖)、氮源(酶解肉湯和酵母浸膏)及礦物質(zhì)外，還特別加入了占液體培養(yǎng)基較大體積(約25％)的大豆胚芽蒸煮液。用于本發(fā)明的典型的培養(yǎng)基組成如下2.5％酶解牛肉肉湯、1.3％酵母浸膏、25％大豆芽煎煮液、1.3％葡萄糖、1.3％蔗糖、0.05％MgSO4、0.05％CaCO3、0.03％K2HPO4、0.03％KH2PO4、0.03％NaCI。以上比例均為重量百分比(W/W)。
這里應(yīng)特別指出的是，培養(yǎng)基中的大豆芽蒸煮液主要并不是作為氮源和/或碳源加入的。培養(yǎng)基中加入大豆芽蒸煮液的目的主要在于為益生菌培養(yǎng)液提供或補充大豆異黃酮、可溶性纖維及大豆寡糖(如水蘇糖和棉籽糖)。已知大豆異黃酮類化合物(包括大豆甙元、染料木黃酮及大豆黃素)作為植物雌激素，具有抗自由基、降低血脂、減小心血管疾病的危險性、防止絕經(jīng)期女子內(nèi)分泌失調(diào)引起的骨質(zhì)疏松等作用。大豆芽浸出液中所含有的可溶性食物纖維可阻止腸道內(nèi)中性脂肪及膽固醇的吸收、促進胃腸蠕動、防止便秘并延緩或抑制碳水化合物的吸收。另外，大豆芽浸出液中所含有的大豆寡糖可被腸道乳酸菌分解利用，但幾乎不被腸道有害菌利用，從而有利于糾正腸道菌群失調(diào)?？傊?，以大豆芽蒸煮液作為益生菌培養(yǎng)基的主要成分之一，代表了本發(fā)明技術(shù)特征的一個方面。經(jīng)檢測，按本發(fā)明方法制得的益生菌液體培養(yǎng)物中所含大豆異黃酮和可溶性纖維的濃度分別為20-40μg/ml和30-100μg/ml。
為了制備作為培養(yǎng)基主要組分的大豆芽蒸煮液，首先將新鮮的成熟大豆在約2倍體積的溫水中浸泡5-6小時，以使大豆組織吸水膨脹。然后置于25-27℃環(huán)境下保溫60-72小時，以使大豆生長出長約3-8厘米的胚芽。收集發(fā)芽并吸水膨脹的大豆，按照每升斤發(fā)芽大豆加約3升水的比例向發(fā)芽大豆中加入自來水，并在控制溫度約105-121℃的高壓蒸煮容器內(nèi)加熱30分鐘。加熱后，通過雙層濾布過濾并收集如此得到的發(fā)芽大豆蒸煮液。
用于本發(fā)明的培養(yǎng)基中的另一個主要組分是蛋白酶處理的新鮮牛肉和牛肝組織水解物。與現(xiàn)有技術(shù)中所使用的常規(guī)肉湯不同的是本發(fā)明的肉湯在材料選擇上不僅使用牛肉組織，還加用了富含各種酶類的牛肝臟組織，另外肉湯制備中還使用了從豬或牛胰腺中提取的粗制胰蛋白酶制劑。因此，為了制備作為本發(fā)明所用培養(yǎng)成分的酶解牛肉湯，首先將仔細選擇的牛肉和牛肝組織按5∶2的重量比混合并絞碎成肉糜。向其中加入1-1.5倍體積的水?dāng)嚢杈鶆?，并于大約100℃下加熱約60分鐘。然后使溫度下降至38-41℃，向其中加入約1％(V/V)按下述方法制備的粗胰蛋白酶制劑。在pH7-9條件下消化處理約1小時。酶水解后，以2000rmp離心收集上清液，得到蛋白酶水解的牛肉湯。如此制得的肉湯大大增加了細菌生長所需的營養(yǎng)成分，減少了原料的浪費，而且明顯地改善了培養(yǎng)基及發(fā)酵后所得細菌培養(yǎng)物的味道和口感。
為了制備用于水解牛肉和牛肝組織的粗胰酶提取物，可首先制備動物如牛、馬、羊或豬的胰組織勻漿，并按1∶1∶3的比例將所得勻漿與無水乙醇和蒸餾水混合，然后持續(xù)攪拌72小時。攪拌后離心(500rpm，10分鐘)收集上清并用濃鹽酸將所得上清液的pH調(diào)至約5.5，從而得到所需的粗制胰蛋白酶制劑。
可以使用按上述方法制備的營養(yǎng)培養(yǎng)基作基質(zhì)材料，向其中加入按常規(guī)中藥湯(煎)劑制備方法制得的中藥組合物的水或有機溶劑提取物。混勻并將所說的基質(zhì)原液與中藥提取物的混合物加熱煮沸約10分鐘，然后冷卻至大約37℃。在此溫度下，依次向所說的混合物中接種一株或多株選自乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、丙酸菌屬、明串珠菌屬及芽孢桿菌屬的人正常腸道益生菌，并于約37℃和pH6.2條件下發(fā)酵培養(yǎng)約18-24小時。發(fā)酵完成后，使體系的溫度自然降至室溫，過濾收集濾液即得到按本發(fā)明方法經(jīng)益生菌發(fā)酵處理的溶液態(tài)天然藥物組合物。
或者，也可以在按照本申請人于同一申請日提交的共同待批專利申請中所述的益生菌分級接種共生發(fā)酵完成以后(約24小時)和升高發(fā)酵體系的溫度以熱殺死細菌之前，向總細菌培養(yǎng)物內(nèi)加入適于被所說的細菌或其代謝產(chǎn)物加工或轉(zhuǎn)化的、已知結(jié)構(gòu)或未知結(jié)構(gòu)的任何天然來源的一種或多種藥物或其混合物。在接近生理狀態(tài)的發(fā)酵條件(37℃，pH6.2)下，繼續(xù)發(fā)酵約18小時。在此發(fā)酵過程中，所加入的天然藥物提取物中的一種或多種成分將會在厭氧益生菌或代謝產(chǎn)物的作用下發(fā)生結(jié)構(gòu)改變或代謝轉(zhuǎn)化，使原來無活性的天然藥物化合物轉(zhuǎn)化成有活性的化合物，或者將某些原來活性較弱的分子修飾成具有較強生物學(xué)活性的分子或其集合體，或者使某些原來具有較強生理毒性的化合物(特別是動物來源的天然化合物)變成有較小毒性或無毒性的化合物或其集合體。
如前所述，雖然實施例中舉例描述了在使用嗜酸性乳桿菌、雙歧桿菌和屎鏈球菌作為益生菌在轉(zhuǎn)化天然抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。但在某些特定情況下，例如在選用其他益生菌菌種或用于發(fā)酵轉(zhuǎn)化某些其他特定的天然藥物組合物時，亦可使用具有不同組分但盡可能模擬腸道內(nèi)環(huán)境的培養(yǎng)基及發(fā)酵方法。
作為在本發(fā)明基本原理和構(gòu)思指導(dǎo)下完成的一個具體實例，本發(fā)明特別選用具有抗腫瘤活性的，由黃芪、熟地、黨參、靈芝、溪黃草、黃芩、枇杷葉、蘆根和七葉一枝花等植物藥以及僵蠶、蝎牛、全蝎、蜈蚣和壁虎等動物藥的水提取物及阿膠構(gòu)成的天然藥物組合物。本說明書實施例1中詳細描述了該藥物組合物的制備方法。
特別令人感興趣的是，我們的研究發(fā)現(xiàn)，上述抗腫瘤天然藥物組合物在未使用益生菌進一步發(fā)酵處理的情況下，直接投用于攜帶實驗性S180肉瘤或H22肝癌的動物腫瘤模型，三次重復(fù)試驗均未見明顯地腫瘤生長抑制作用(即計算的抑瘤率小于30％)。同樣，單純使用按上述方法制備的含有三種益生菌及由培養(yǎng)基提供的大豆異黃酮和可溶性植物纖維的發(fā)酵培養(yǎng)物本身，也沒有記錄到可檢測的腫瘤生長抑制作用。然而，如果將上述天然植物藥物水與動物藥物的水煎煮提取物的1∶1混合物加到所說的發(fā)酵培養(yǎng)物中，并于大約39℃±1℃下持續(xù)厭氧發(fā)酵約18-25小時，結(jié)果令人驚異地發(fā)現(xiàn)，如此得到的總天然藥物提取物的益生菌發(fā)酵產(chǎn)物對上述兩種腫瘤模型表現(xiàn)有十分明顯的腫瘤生長抑制活性(參見實施例3和4)。雖然有關(guān)機理尚不明嘹，但這一研究結(jié)果進一步證明天然藥物，特別是某些天然植物或動物來源并且未知結(jié)構(gòu)的藥物或其混合物，必須在正常腸道微生物菌群的體外或體內(nèi)作用下，經(jīng)過某些已知或未知的化學(xué)修飾或生物轉(zhuǎn)化后才能被宿主吸收，并進而發(fā)揮其生物學(xué)功能。
下文實施例2和3中詳細舉例描述了在含有多種營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中，使用三株益生菌發(fā)酵處理由前述十三種植物來源藥物和六種動物來源藥物提取物組成的藥物組合物的方法。另外，我們還利用活體動物腫瘤模型進一步證實，與未經(jīng)處理的藥物組合物相比，經(jīng)腸道益生菌發(fā)酵處理的抗腫瘤藥物組合物顯著地改善了其抗腫瘤活性。所得藥物組合物一方面可以作為常規(guī)抗腫瘤治療(包括常規(guī)化學(xué)藥物治療和放射治療)的強有力輔助治療劑，另一方面，該制劑還可在很大程度上降低常規(guī)化學(xué)藥物治療和放射治療對腫瘤病人的毒付作用(參見實施例4和5)。在另一項使用帶瘤小鼠所作的研究中，進一步證明經(jīng)益生菌混合發(fā)酵處理的抗腫瘤天然藥物對帶瘤小鼠的免疫功能增強活性，其中包括(1)顯著地提高帶瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能；(2)明顯地促進帶瘤小鼠淋巴細胞在T細胞有絲分裂原ConA作用下轉(zhuǎn)化功能(數(shù)據(jù)未示出)。
最后應(yīng)特別指出的是，雖然本說明詳細描述部分和實施例中舉例說明了益生菌對本發(fā)明人設(shè)計并制備的天然抗腫瘤藥物的體外仿生學(xué)轉(zhuǎn)化與修飾，以及由之產(chǎn)生的積極效果，但本發(fā)明人確信本發(fā)明的方法并不只限于本文用來舉例說明的特定腫瘤及所使用的特定益生菌。因此，在不背離本發(fā)明的精神和原則基礎(chǔ)上，對本發(fā)明所作的任何平行改動或改變均將落入本發(fā)明待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。
實施例1腸道益生菌共生發(fā)酵培養(yǎng)物的制備本實施例舉例說明以分級接種、共生發(fā)酵方法，在同一培養(yǎng)基中生產(chǎn)混合的嗜酸性乳桿菌、短雙歧桿菌和屎腸球菌共生發(fā)酵培養(yǎng)物的方法。
1、益生菌菌種的選擇雙歧桿菌是人或乳哺動物體內(nèi)最重要的生理性細菌，主要分布于小腸下部和結(jié)腸內(nèi)。已知雙歧桿菌對于人體的營養(yǎng)、生長、發(fā)育及免疫功能均具有重要作用。嗜酸性乳桿菌是人體內(nèi)分布最為廣泛的益生菌。在胃腸道中，該細菌主要分布于迥腸部。嗜酸性乳桿菌參予維生素，特別是B族維生素的生物合成，具有輔助食物消化、促進營養(yǎng)素代謝及提高宿主對乳糖的耐受性等功能。屎腸球菌主要分布在小腸的盲腸部分，具有幫助膽固醇分解代謝，降低血膽固醇的作用。因此，本發(fā)明選用短雙歧桿菌、嗜酸性乳桿菌和屎腸球菌等的三個常見益生菌菌株，主要是基于它們在人腸道內(nèi)分布的總體廣泛性及其生理學(xué)活性的互補性。
可以從中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)(中國，武漢)等菌種保藏機構(gòu)購得，或者從正常人的糞便或腸粘膜組織中分離得到這些細菌菌株。
2、培養(yǎng)基組成及制備培養(yǎng)基組成每升培養(yǎng)基含有25ml蛋白酶水解牛肉肉湯、15g酵母浸膏、250ml大豆芽蒸煮液、12g葡萄糖、13g蒸糖、5gMgSO4、3gCaCO3、3gNaCI、3g K2HPO4和3gKH2PO4。
基本上按照本說明詳細描述部分所述的方法制備用于配制本發(fā)明特定培養(yǎng)基的蛋白酶水解牛肉肉湯和大豆芽(或發(fā)芽大豆)蒸煮液。將培養(yǎng)基各成分混合均勻后，于121℃高壓滅菌30分鐘備用。
3、分級接種共生發(fā)酵方法將經(jīng)過滅菌處理的上述培養(yǎng)基100升加熱至大約40℃，按生物量濕重約占培養(yǎng)基總重量約0.8％的比例(W/W)在培養(yǎng)基中接種活化的雙歧桿菌1000g(濕重)，并于39℃下厭氧發(fā)酵7.5小時。當(dāng)發(fā)酵過程中pH降至5.0時，持續(xù)攪拌下向培養(yǎng)基中滴加適當(dāng)量的0.5NNaOH以將pH調(diào)到大約6.2，并再次向培養(yǎng)基中接種活化的屎腸球菌生物量約950g(濕重)，并攪拌20分鐘。于同樣溫度下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)6小時。當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)pH降至大約5.5時，再次向培養(yǎng)基中加入0.5N NaOH溶液以將調(diào)至6.2，然后接種嗜酸性乳桿菌生物量約850g(濕重)，并繼續(xù)在同樣溫度下發(fā)酵。當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)總細菌濃度達到6.5×108/ml以上，并且pH降低到大約3.5-3.8時，通過控制循環(huán)水溫度使發(fā)酵培養(yǎng)物的溫度降低至大約32℃，并保持約2小時，以完成發(fā)酵產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化。發(fā)酵完成后，根據(jù)如此得到的益生菌共生發(fā)酵培養(yǎng)物的使用目的的不同，可以(1)離心收集共生發(fā)酵的活的益生菌并凍干之，以制備含有凍干菌粉的固體藥物或營養(yǎng)補充組合物；(2)向包括培養(yǎng)基和活菌及其代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)物中加入待轉(zhuǎn)化的天然藥物提取物，以制備具有特定生物學(xué)活性和功能的藥物組合物；(3)使發(fā)酵培養(yǎng)物的溫度升高至大約39℃，熱殺死增殖的活菌，離心分離培養(yǎng)物上清后或直接制備含有益生菌共生發(fā)酵產(chǎn)物及細菌碎片的營養(yǎng)補充組合物。
對共生發(fā)酵培養(yǎng)物上清的生物化學(xué)分析結(jié)果顯示，培養(yǎng)物上清中水解氨基酸含量達23.322mg/ml，其中可以滿足雙歧桿菌和乳桿菌生長所需，并且含有二硫鍵的胱氨酸含量為1.8mg/ml(水解的)和0.33mg/ml(游離的)。共生發(fā)酵培養(yǎng)物上清中總糖含量約為0.04mg/ml，其中除還原糖外，還存在有雙歧桿菌等益生菌生長繁殖所需的低聚糖和膳食纖維。后者在腸道內(nèi)具有抑制血糖升高，阻止中性脂肪和膽固醇吸收及緩解便秘的作用。另外，用乙酸乙酯提取并用HPLC法分析(255nm)，測得培養(yǎng)物上清中大豆異黃酮的細菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)物即大豆甙元高達80mg/ml。再者，培養(yǎng)物上清中還含有多種維生素和一定量的礦物質(zhì)，其中主要是B族維生素(約40mg/l)及P、Fe、Zn、Mg、K和Na等礦物質(zhì)(分別為5.04、5.36、8.29、88.83、783、283mg/l)。這些檢測結(jié)果進一步表明共生發(fā)酵培養(yǎng)物上清足可作為培養(yǎng)基，提供細菌生長所需的全部營養(yǎng)素。在細菌增殖到一定程度之后，由于菌體代謝產(chǎn)生大量酸性產(chǎn)物(有機酸)，故導(dǎo)致培養(yǎng)體系的pH值下降(4.0以下)，進而使細菌停止生長。
實施例2抗腫瘤中藥提取物的制備本實施旨在舉例說明根據(jù)中藥制劑中所用原料來源的不同，分別制備植物來源和動物來源藥物的水提取物的方法。
1、抗腫瘤天然藥提取物的制備(1)植物藥提取物的制備將經(jīng)過常規(guī)預(yù)處理的黃芪12g、熟地20g、黨參12g、靈芝8g、天花粉12g、甘草5g、溪黃草40g、黃芩12g、炙杷葉12g、蘆根12g、七葉一枝花12g、核桃皮20g、白花蛇舌草12g共十三種189g天然植物藥在5升容器內(nèi)混合后，加入1600ml水煎煮1.5小時，得到植物藥的第一份水提取物約500ml。然后再向容器內(nèi)加入1200ml水并煎煮約1小時，得到第二份約400ml水提取物。最后再次向容器內(nèi)加入水1200ml，加熱煎煮約0.5小時，得到植物藥的第三份水提取物約600ml。合并植物藥的三份水提取物，并于減壓下將三份水提取物的總體積濃縮至300ml。
(2)動物藥提取物的制備將經(jīng)過常規(guī)處理的蟾皮20g、僵蠶8g、蝸牛6g、全蝎4g、蜈蚣4g、壁虎4g共六種46g天然動物藥混合加入2升容器內(nèi)，首先加入水350ml，并于常溫下浸泡12小時。然后用組織粉碎機以1000rpm攪拌約2分鐘，并將粉碎的動物藥加熱煎煮約15小時。收集水提取物后再次加入水250ml，并煮沸約1小時。收集并合并兩份提取物后，用4層濾布過濾。冷卻至常溫后，向濾液內(nèi)加入30g阿膠，加熱(約80 ℃，5分鐘)使阿膠溶融后，減壓濃縮至200ml備用。
實施例3腸道益生菌對抗腫瘤中藥提取物的生物學(xué)轉(zhuǎn)化本實施例舉例說明利用腸道益生菌和/或其發(fā)酵培養(yǎng)物，以兩種方式生物轉(zhuǎn)化天然藥物提取物的方法。
1、按照實施例1中所述的方法制備短雙歧桿菌、嗜酸性乳桿菌和屎腸球菌的共生發(fā)酵培養(yǎng)物。當(dāng)培養(yǎng)物中細菌濃度達到7.0×108/ml以上，并且在活菌存在下于32℃保溫2小時以完成總成分的生物學(xué)轉(zhuǎn)化之后，將反應(yīng)體系的溫度升高至大約39℃并保持約6小時，以殺死細菌。在離心(10000×g，20分鐘)除去或不除去熱殺死的細菌及大的細菌碎片的情況下，按5∶3∶2的比例向培養(yǎng)物中加入按上述方法制備的天然植物藥和天然動物藥提取物。重新加熱至38-40℃，并在此溫度下厭氧發(fā)酵約18小時。發(fā)酵完成后，收集發(fā)酵培養(yǎng)物，并離心分離上清液。
2、在按本說明書詳細描述部分所述的方法制備的新鮮培養(yǎng)基(每升含有250ml大豆芽蒸煮液、25ml胰酶解牛肉肉湯、15g酵母浸膏、13g蔗糖、12g葡萄糖、5gMgSO4、3gNaCI、3gCaCO3、5gK2HPO4、5gKH2PO4)中按5∶3∶2的比例無菌加入按上述方法制備的天然植物和動物藥物提取物。將物料與培養(yǎng)基充分混勻后，按照實施例1中所述的方法和接種量向培養(yǎng)基與藥物提取物的混合物中依次接種雙歧桿菌、嗜酸性乳桿菌及屎腸球菌?；靹蚝笥?8-40℃下厭氧發(fā)酵約20小時。發(fā)酵完成后，收集發(fā)酵培養(yǎng)物并離心分離上清液，即得到經(jīng)益生微生物轉(zhuǎn)化并修飾的抗腫瘤藥物組合物。
實施例4腸道益生菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化對抗腫瘤中藥提取物之生物學(xué)活性的影響本實施例利用腫瘤動物模型，舉例描述抗腫瘤天然藥物提取物在經(jīng)腸道益生菌體外發(fā)酵轉(zhuǎn)化后生物學(xué)活性的改善。
使用皮下接種S180肉瘤或H22肝癌細胞的昆明種小鼠作為腫瘤動物模型，觀察大或小劑量上述經(jīng)益生菌發(fā)酵培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化的或未轉(zhuǎn)化的抗腫瘤藥物提取物對腫瘤生長的抑制活性。
為此，首先對120只體重約18-25g的昆明種小鼠腋部皮下接種1×107/ml S180肉瘤或H22肝癌細胞(0.2ml/只)，以造成實體瘤動物模型。將動物隨機分為12組。實驗組動物每只每天口服接受1∶1或1∶4倍稀釋的未經(jīng)發(fā)酵處理的藥物提取物或經(jīng)過發(fā)酵處理的藥物提取物。
陰性對照組口服接受同樣容量的自來水，陽性對照組按每公斤體重60mg的劑量每天皮下注射化學(xué)合成的抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺(CTX)。
接種腫瘤細胞后第4天(即可觸及皮下實體瘤時)開始給藥。連續(xù)給藥10天后，斷頸處死攜帶S180和H22實體瘤的小鼠，分別測量動物的體重和瘤體重量，并由之計算出抑制率。每種腫瘤的治療實驗均重復(fù)進行3次。下列表1和表2分別給出了使用S180肉瘤動物模型和H22肝癌動物模型所作實驗的結(jié)果。
表1 益生菌共生培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化的或未轉(zhuǎn)化的抗腫瘤藥物提取物對小鼠S180肉瘤的抑制作用動物體重瘤體重量 抑瘤率組別(n＝10) P值用藥前用藥后(X±SD) (％)陰性對照組 20.9*26.1 1.41±0.69陽性對照組 20.1 21.2 0.55±0.19 61.0 ＜0.001經(jīng)過轉(zhuǎn)化的藥物 20.4 23.9 0.99±0.36 38.1 ＜0.05大劑量組 20.4 23.9 0.99±0.36 38.1 ＜0.05小劑量組 20.6 25.9 1.44±1.18 21.3 ＞0.05未經(jīng)轉(zhuǎn)化的藥物大劑量組 21.0 23.8 0.93±0.49 29.5 ＞0.05小劑量組 20.6 24.6 1.22±0.89 -4.1 ＞0.05*表中所給出的數(shù)值均為三次重復(fù)實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X+SD)。
表2 益生菌共生培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化的或未轉(zhuǎn)化的抗腫瘤藥物提取物對小鼠H22肝癌的抑制作用動物體重 瘤體重量 抑瘤率組別P值(n＝10) 用藥前用藥后(x±SD) (％)陰性對照組 21.2*28.8 1.91±0.78陽性對照組 21.2 27.9 0.72±0.36 62.4 ＜0.001經(jīng)過轉(zhuǎn)化的藥物大劑量組 20.6 28.6 1.80±0.47 44.8 ＜0.001小劑量組 21.0 30.4 1.07±0.53 26.2 ＜0.05未經(jīng)轉(zhuǎn)化的藥物大劑量組 21.6 27.6 1.14±0.38 29.6 ＞0.05小劑量組 21.5 27.4 1.45±0.49 10.5 ＞0.05*表中所給出的數(shù)值均為三次重復(fù)實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)。
本動物治療實驗中，抑瘤率大于30％視為被試樣品對所說的腫瘤具有抗腫瘤(或腫瘤抑制)活性，而抑瘤率小于30％則視為無抗腫瘤(或腫瘤抑制)活性。從表1和表2中所示的數(shù)據(jù)可以看出，植物和動物來源的藥物提取物未經(jīng)模擬腸道正常菌群及其代謝產(chǎn)物的益生菌共生發(fā)酵培養(yǎng)物的生物轉(zhuǎn)化之前，基本上沒有表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)上有意義的抑瘤活性(抑瘤率為-10.5至29.5)。然而，當(dāng)所說的藥物提取物與多種腸道益生菌共同發(fā)酵后，由于益生菌及其代謝產(chǎn)物對藥物的生物化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾及酶促轉(zhuǎn)化作用，使之生物學(xué)活性顯著提高(抑瘤率達到40％以上)。
實施例5腸道益生菌及其代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化并修飾的抗腫瘤中藥制劑對常規(guī)腫瘤化療和放療的影響本實施例利用腫瘤動物模型，分別觀察(1)按本發(fā)明方法制備的天然藥物組合物與常規(guī)腫瘤化療和放療方法聯(lián)合使用時，所說的經(jīng)發(fā)酵處理的天然藥物組合物對常規(guī)化療和放療的協(xié)同增效作用，以及(2)按本發(fā)明方法制備的天然藥物組合物對常規(guī)化療和放療所致毒性或付損傷的保護或緩解作用。
1、80只體重約18-22g的昆明種小鼠(雄雌各半)分別于右腋皮下接種用生理鹽水按1∶3稀釋的H22肝癌細胞懸液(107細胞/ml，0.2ml/只)，接種瘤細胞后將動物隨機分成8組，前四組用于觀察本發(fā)明的天然藥物組合物對抗腫瘤化學(xué)藥物氟尿嘧啶(5-Fu，15mg/kg)之治療效果的影響，后四組用于觀察本發(fā)明的天然藥物組合物對抗腫瘤放射治療(Co60全身照射，4.5GY/日/只動物)的影響。接種腫瘤細胞后次日開始，分別對兩大組動物進行聯(lián)合治療，連續(xù)治療7天。兩大組中各設(shè)1-4組，其中第2組分別灌服本發(fā)明的中藥組合物；第4組分別給予本發(fā)明的中藥制劑+抗腫瘤化學(xué)藥物或Co60照射(實驗組)；第3組皮下注射抗腫瘤化學(xué)藥物或Co60照射(陽性對照組)；第1組分別灌同體積的水或給予中劑量Co60照射(陰性對照組)。
治療7天后斷頸處死動物，分別稱量動物體重和腫瘤重量，并由之計算出各種治療的抑瘤率。為了評價按本發(fā)明方法制備的中藥組合物對腫瘤化療或放射治療的協(xié)同增效作用，將所得出的抑瘤率數(shù)據(jù)代入下列Burgi修正公式Q＝E(A+B)/EA+EB-EA×EB其中E(A+B)為聯(lián)合治療腫瘤抑制率EA和EB分別為單獨使用本發(fā)明的中藥組合物或化學(xué)治療或放射治療的腫瘤抑制率(以小數(shù)表示)。
結(jié)果判定由上述公式計算出的q值小于0.85，視為聯(lián)合治療具有拮抗作用；q值在0.85至1.15之間，視為聯(lián)合治療具有相加作用；q值大于1.15則認(rèn)為聯(lián)合治療具有協(xié)同作用。結(jié)果如下列表3和4中所示。表3 按本發(fā)明方法制備的中藥組合物與抗腫瘤化學(xué)藥物聯(lián)合應(yīng)用對帶瘤(H22肝癌)小鼠的治療效果動物體重 腫瘤重量組別(n＝10)抑瘤率P值治療前 治療后(X±SD)(％)1 20.529.5 2.15±0.67 --2 20.925.9 0.72±0.21 66.5 ＜0.0013 20.927.4 1.06±0.31 56.7 ＜0.0014 21.223.5 0.39±0.18 81.9 ＜0.001**q值＝0.99，故判定本發(fā)明的中藥組合物與5-Fu聯(lián)合用藥對H22肝癌小鼠表現(xiàn)有效果相加作用。表4 按本發(fā)明方法制備中藥組合物與Co60放射治療聯(lián)合應(yīng)用對帶瘤(H22肝癌)小鼠的治療效果動物體重 腫瘤重量組別(n＝10)抑瘤率(％)P值治療前治療后 (X±SD)1 21.7 33.32.77±0.292 21.4 31.11.31±0.1352.7 ＜0.013 21.5 24.20.99±0.0564.3 ＜0.0014 21.9 25.60.62±0.0677.6 ＜0.001**q值＝0.93，故判定本發(fā)明的中藥組合物與CO60放射治療聯(lián)合應(yīng)用時丙者間表現(xiàn)有效果相加作用。
從表3和4中所示結(jié)果可以看出，按本發(fā)明方法制備的抗腫瘤天然藥物組合物制劑與常規(guī)腫瘤化學(xué)藥物治療或放射治療聯(lián)合使用時，可獲得比單獨使用任何一種療法都更好的治療效果(抑瘤率)。另外，依照評價聯(lián)合治療效果的Burgi修正公式計算，上述聯(lián)合治療的q值均在0.85至1.95之間，表明聯(lián)合治療具有的效果相加作用。
2、80只體重約18-22g的昆明種小鼠(雄雌各半)隨機分為兩大組各4小組。治療實驗組(第3和4組)動物(1)經(jīng)灌胃投用中等劑量或小劑量按本發(fā)明方法制備的抗腫瘤天然藥物組合物，每日一次，連續(xù)投用7天，同時在第一天給動物一次性投用抗腫瘤化學(xué)藥物環(huán)磷酰胺(CTX，60mg/Kg)(表5)；或者(2)動物在接受中等劑量或小劑量按本發(fā)明方法制備的抗腫瘤天然藥物組合物的同時，每天接受一次Co60全身照射(4.5GR)，連續(xù)照射7天。
陰性對照組(第1組)投用同樣體積的水。陽性對照組(第2組)只接受上述劑量的化學(xué)藥物或放射治療。七天后，經(jīng)尾靜脈采集動物末梢血分別進行白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)和血小板(BPC)計數(shù)及血紅蛋白(Hb)含量測定。結(jié)果分別如下列表5和6所示。
表5按本發(fā)明方法制備的中藥組合物對腫瘤化療后外周血象損傷的保護作用組別 WBC RBC BPC Hb(n＝10) (×106/ml) (×109/ml) (×106/ml) (mg/l)1 8.78±3.75 8.91±1.50 130.0±24.0 15.6±1.32 4.28±1.48 6.70±1.98 56.5±23.0 13.7±0.83 6.62±1.44 9.90±1.43 118.5±26.0 17.6±0.74 5.56±1.83 9.44±1.22 128.5±35.7 16.9±0.6表6 按本發(fā)明方法制備的中藥組合物對腫瘤放療后外周血象損傷的保護作用組別 WBC RBC BPC Hb(n＝10) (×106/ml) (×109/ml) (×106/ml) (mg/l)1 7.64±1.95 8.59±1.03 158.7±32.6 15.5±0.62 0.64±0.34 7.65±1.27 163.5±36.4 13.8±0.83 1.42±1.14 8.08±1.35 165.0±74.2 17.1±1.14 1.25±0.36 7.13±1.64 164.1±64.7 16.7±1.1抗腫瘤化學(xué)藥物CTX和放射性Co60均可造成被治療動物造血系統(tǒng)的功能障礙，導(dǎo)致WBC、RBC、Hb及BPC的損傷，其中放射治療對WBC數(shù)和Hb含量的影響尤為明顯。從表5和表6所示的結(jié)果可以看出，在對帶瘤動物進行腫瘤化療或放射的同時，給動物投用按本發(fā)明方法制備的經(jīng)益生菌發(fā)酵處理的天然藥物組合物，可使用腫瘤放療或化療導(dǎo)致的損傷得到很大程度的緩解和改善。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)天然中藥藥物制劑的方法，該方法包括在加有天然藥物提取物的營養(yǎng)培養(yǎng)基中接種一種或多種腸道益生菌，并在適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件下發(fā)酵培養(yǎng)之。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的方法是首先制備一種或多種益生菌的共生發(fā)酵培養(yǎng)物，然后向培養(yǎng)物中加入預(yù)制備的一種或多種天然藥物的提取物或未經(jīng)泡制的天然藥物粉末，并繼續(xù)混合發(fā)酵培養(yǎng)之。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的方法是將預(yù)制備的一種或多種天然藥物的提取物或其未經(jīng)泡制的粉末加入到適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中，然后向如此得到的混合物中接種一種或多種腸道益生菌并共生發(fā)酵培養(yǎng)之。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的益生菌選自雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、丙酸菌屬、明串珠屬及芽孢桿菌屬的一種或多種人腸道非致病菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的益生菌選自兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、嗜酸性乳桿菌、保加利亞乳桿菌、奶酪乳桿菌、德氏乳桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、嗜檸檬酸明串珠菌、枯草芽孢桿菌和地衣形芽孢桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的天然藥物是具有任何預(yù)防和/或治療作用并含有一種或多種可被人正常腸道細菌及其代謝產(chǎn)物加工或修飾的任何植物或動物來源的藥物或其組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的天然藥物是一種或多種天然藥物組合物的水提取物或有機溶劑提取物，或這些藥物的未經(jīng)泡制的固體粉末。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中是所說的有機溶劑選自甲醇、乙醇、正丙醇、乙丙醇、甲醚、乙醚、二甲醚、丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙腈或它們的混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中是所說的天然藥物選自祛邪扶正藥、補氣善血藥、健脾益腎藥、軟堅化瘀藥、化痰祛濕藥、消炎排毒藥、生精補血藥、利尿補氣藥或它們的混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及天然藥物組合物的生產(chǎn)方法,特別是涉及利用仿生學(xué)原理,并借助模擬人腸道微生態(tài)環(huán)境的腸道益菌共生發(fā)酵培養(yǎng)物對任何植物或動物來源的天然藥物進行生物學(xué)轉(zhuǎn)化和修飾,以改善所說的天然藥物的生物學(xué)活性并降低或消除其毒性的方法。本發(fā)明進一步涉及所說的方法在制備天然中草藥制劑中的應(yīng)用。
文檔編號C12R1/01GK1273839SQ0011108
公開日2000年11月22日 申請日期2000年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月26日
發(fā)明者吳炳新, 董立山, 孫筱林, 王紅 申請人:濟南三株藥業(yè)有限公司