專利名稱：莽草酸的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及莽草酸的檢測方法，更具體說，本發(fā)明涉及能夠檢測植物材料中莽草酸的方法。
背景技術：
莽草酸是D-葡萄糖生物合成芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的重要的中間體。
除草劑草甘膦〔即，N-(磷酰基甲基)甘氨酸〕抑制了芳香族氨基酸的生物合成，這最終導致了莽草酸在植物中的積累。草甘磷是5-烯醇丙酮?；?莽草羧基-3-磷酸(EPSP)合成酶的強抑制劑，此酶在芳香族氨基酸生物合成途徑中是一個關鍵酶。草甘磷先導致EPSP合酶的底物——莽草羧基-3-磷酸的積累，后者隨后在植物中被水解成莽草羧基。檢測植物中的莽草酸，能夠用來確定植物是否接觸過草甘磷，還能夠用來測定該植物是否對這種除草劑有抗性。
Gaitonde和Gordon，J.Boil.Chem.，vol.230，no.1，p.1043-1050公開了一種定量測定莽草酸的方法，其中，用高碘酸氧化莽草酸的溶液，加入氫氧化鈉以形成黃色的生色團，并加入甘氨酸以穩(wěn)定該色彩。然后在該溶液加入氫氧化鈉后的十分鐘內(nèi)測量該溶液的光密度。
Millican，Methods in Enzymology，vol.17A，p.352-353，1970公開了一種檢測莽草酸的方法，其中，用高碘酸鹽氧化含莽草酸的溶液，然后用亞砷酸鹽處理。加入硫代巴比妥酸，溶液呈紅色。然后用環(huán)己酮抽提該溶液。澄清的上層環(huán)己酮相呈紅色，測定其光密度。
Singh和Shaner，Weed Technology，vol.12，p.527-530，1998公開了一種檢測植物組織中莽草酸的方法，其中，用高碘酸氧化含有莽草酸的試驗樣品。然后將樣品與氫氧化鈉混合，加入甘氨酸測量其光密度。
Sichl，在Herbicide ActivityToxicology Biochemistry and molecular Biology中(由R.M.Roc等人編輯，IOS出版，1997，p.37-65)公開了一種DAHP酶的試驗方法，其中，該酶在存在其底物磷酸烯醇丙酮酸和丁糖-4-磷酸下培育。加入高碘酸停止該反應。隨后加入亞硫酸鈉，以還原過量的高碘酸。然后加入硫代巴比土酸，接著在十分鐘內(nèi)加入二甲亞砜。測定其549nm吸收值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種檢測水溶液中莽草酸的方法，它包括a)用高碘酸或含有高碘酸鹽和高碘酸(高碘酸和所述試劑在本文同指高碘酸鹽)的試劑氧化莽草酸；b)加入強堿以產(chǎn)生生色團；c)加入亞硫酸鹽以穩(wěn)定生色團；d)檢測生色團的存在。還可包括步驟e)定量測定生色團。生色團的存在表明在該水溶液中存在莽草酸。生色團的量與水溶液中的莽草酸的量有直接的關系。在本發(fā)明的一個較佳實施例中，步驟b和c加入含有亞硫酸鹽和強堿的混合物同時進行，這樣，過量高碘酸鹽的還原和生色團的產(chǎn)生同時發(fā)生。
申請者已發(fā)現(xiàn)，同時使用高碘酸和高碘酸鹽與莽草酸反應，比單獨使用高碘酸具有更快的反應時間，特別是當氧化反應在溫度高于環(huán)境室溫進行時。
另外，申請者還發(fā)現(xiàn)，使用亞硫酸鹽來還原多余的高碘酸和高碘酸鹽大大地增進了加入強堿氧化莽草酸后產(chǎn)生的生色團的穩(wěn)定性。
申請者的方法也可用于檢測組織尤其是植物組織中的莽草酸。因此，本發(fā)明另一方面提供了一種檢測試驗樣品中的莽草酸的方法，該方法包括(a)用高碘酸或含有高碘酸鹽和高碘酸的試劑處理試驗樣品；(b)將強堿加入試驗樣品中以產(chǎn)生生色團；(c)用亞硫酸鹽穩(wěn)定生色團；(d)檢測生色團的存在。該方法還可以包括步驟(e)定量測定生色團。較佳的方法是，步驟b和c用含有亞硫酸鹽和強堿的混合物同時進行，這樣，過量的高碘酸鹽的還原和生色團的產(chǎn)生同時發(fā)生。
與現(xiàn)有的檢測莽草酸的一些方法不同，申請者的方法能直接應用于組織抽提液。適當?shù)慕M織抽提液可不用研磨而得到，或者延長植物材料的回流而得到。另外，與現(xiàn)有的其他一些方法不同，申請者的方法提供了更穩(wěn)定的生色團，這樣，生色團的檢測不需要在高碘酸氧化反應結束后盡可能快的進行。本發(fā)明方法直接用于組織樣品的適用性、可以延遲對生色團的檢測至少一小時、以及可任選地對生成的生色團進行定量測定使得本發(fā)明非常適合于以高通量對組織樣品進行篩選。
本發(fā)明這些和其他方面的內(nèi)容將在以下的本發(fā)明的詳細描述中進行陳述。
發(fā)明的詳細描述高碘酸氧化莽草酸產(chǎn)生反式-烏頭酸和一個二醛。當通過加入足量的氫氧化鈉去除多余的高碘酸以將pH值升至10以上時，產(chǎn)生了顯著的強烈的黃色。已發(fā)現(xiàn)只有莽草酸、奎尼酸和色氨酸在用高碘酸處理后，在堿性條件下產(chǎn)生黃色的生色團。莽草酸形成的黃色是幾種檢測莽草酸方法的基礎，這種黃色可能是形成的二醛的特征。呈黃色的生色團不穩(wěn)定，一些方法使用一種化合物如甘氨酸來穩(wěn)定該顏色。申請者已發(fā)現(xiàn)，亞硫酸鹽比已知的方法能更好得多地穩(wěn)定生色團，并提供了一種可直接用于組織樣品的方法。
本發(fā)明提供一種檢測水溶液中莽草酸的方法，該方法包括a)用高碘酸或含有高碘酸鹽和高碘酸(在這里同指高碘酸鹽)的試劑氧化莽草酸；b)加入強堿以產(chǎn)生生色團；c)加入亞硫酸鹽以穩(wěn)定生色團；d)檢測生色團的存在。并可任選地包括步驟e)定量檢測生色團。生色團的存在表明水溶液中存在莽草酸。生色團的量與水溶液中的莽草酸的量有直接的關系?？赡芤阎芤汉忻Р菟?，如當將已知數(shù)量的莽草酸加入到水溶液中以產(chǎn)生標準品時，或者懷疑含有莽草酸，如試驗樣品。
檢測植物中的莽草酸可用來確定一種植物是否接觸過除草劑草甘膦，也可用來測定植物是否對該除草劑有抗性。因而，本發(fā)明的方法可用于需要檢測和/或定量莽草酸的情況。例如，本發(fā)明的方法可用來篩選植物或植物組織或細胞，以確定其對除草劑草甘膦的抗性，或者用來測試農(nóng)作物，以確定其是否接觸過草甘膦。
本發(fā)明的方法可在水溶液中方便地進行。該水溶液可以是水，或者水與可水溶和的有機溶劑的混合液。本發(fā)明的方法適用于不同類型的組織，包括植物、動物和微生物組織。植物組織較佳。當使用組織樣品時，需先將莽草酸抽提到一種合適的溶劑中，如一種水溶液和可水溶和的有機溶劑，然后如有必要，澄清得到的溶液。
使用合適的方法可從組織中抽提莽草酸。申請者已發(fā)現(xiàn)，在室溫下，使用含有水和可水溶和的有機溶劑的溶液可不難且大量地從植物組織中抽提出莽草酸。較佳的是，該植物組織事先已被冷凍至-4℃以下。用來從組織中抽提莽草酸的溶液的pH可以是堿性的或酸性的。可水溶和的有機溶劑可以是莽草酸能溶于其中的任何溶劑，較佳的是低分子量的酒精，更佳的是異丙醇。在抽提液中培育該組織，直到全部或足夠量的莽草酸被抽提出來。一般大約24小時后完成抽提，但通常在16到24小時后完成，或甚至更短。
抽提莽草酸的溶液較佳的是體積比為2∶1的0.05M堿金屬氫氧化物(水溶液)和異丙醇。堿金屬氫氧化物以氫氧化鈉或氫氧化鉀較佳。
在從植物組織中抽提莽草酸的一個較佳的方法中，將冷凍至-4℃以下的組織切成小片，將其沉浸在足量的體積比為2∶1的0.05M氫氧化鈉或氫氧化鉀(水溶液)和異丙醇的混合液中。一般情況下，為了方便，每0.1克的植物組織用1毫升的抽提混合液，但其他抽提混合液與組織的比例也是合適的。抽提可以在室溫進行，直到?jīng)]有另外的莽草酸被抽提到溶液中。通過這些步驟，許多植物組織的莽草酸可在16-22小時里被全部抽提出來。
按照本發(fā)明的方法而無需額外的操作，可分析上述抽提混合液各等份中是否存在莽草酸，使大量的樣品分析能方便地進行。例如，可在96孔或更小的塑料板中對少量的植物組織進行組織抽提，用自動處理裝置從板孔中取出等份抽提液，測定其吸收值，從而確定植物樣品中的莽草酸量。
可以用高碘酸或含有高碘酸和高碘酸鹽的試劑(高碘酸鹽試劑)來進行莽草酸的氧化反應。為了易于參考，高碘酸和含有高碘酸和高碘酸鹽的試劑一般稱為高碘酸鹽。較佳的是，用含有比例為1∶1的高碘酸和高碘酸鹽試劑來進行氧化反應。該試劑可以用水配成0.5％(重量/體積)的高碘酸和0.5％(重量/體積)偏高碘酸鈉水溶液。將高碘酸鹽加到含有或懷疑含有莽草酸的水溶液中。將足量的高碘酸鹽加到該水溶液中，這樣，在該水溶液中就有超過已知量或懷疑量的莽草酸的摩爾濃度大大過量的高碘酸鹽。
莽草酸的氧化反應可在環(huán)境室溫或高的溫度下進行。較佳的是，氧化反應在25-65℃之間進行，更佳的在35-50℃之間。申請者已發(fā)現(xiàn)，在37℃時莽草酸的氧化反應在30到45分鐘后完成。當氧化反應在環(huán)境室溫下進行時，反應要花3小時。
在水溶液中加入強堿，停止或結束莽草酸的氧化反應，產(chǎn)生生色團；然后加入亞硫酸鹽，以還原過量的高碘酸鹽，穩(wěn)定該生色團。較佳的是，同時將含有強堿和亞硫酸鹽的混合物加到該水溶液中以結束該反應和穩(wěn)定生色團。然而，分別地加入堿和新配置的亞硫酸鹽溶液也能實現(xiàn)這些步驟。
堿是強堿較佳，如氫氧化物，是堿金屬氫氧化物更佳，如氫氧化鈉或氫氧化鉀，最佳的是氫氧化鈉。加入足量的堿，使水溶液堿性pH超過10，超過11較佳。較佳的是，用水或其他溶劑混合堿，本發(fā)明方法中更佳的是使用堿與水的混合液。在該水溶液中加入堿和亞硫酸鹽產(chǎn)生穩(wěn)定的生色團，在加入堿和亞硫酸鹽后大約1小時可在該水溶液中檢測到該生色團的存在。
將數(shù)量足以穩(wěn)定生色團的亞硫酸鹽分別或與強堿混合加入到該水溶液中，這些生色團因將強堿加入完成的高碘酸鹽氧化反應而產(chǎn)生。亞硫酸鹽被加入到水溶液中，因此，溶液中亞硫酸鹽比高碘酸鹽有更多的摩爾。過量的亞硫酸鹽并不干擾本發(fā)明的方法。任何溶液形式的亞硫酸鹽都可用于本發(fā)明的方法，例如鈉鹽或鉀鹽，較佳的是亞硫酸鈉。亞硫酸鹽宣與水或其它的溶劑混合，更佳的在本發(fā)明方法中采用亞硫酸鹽與水的混合液。
水溶液中表明有莽草酸的生色團的存在可用任何適合的方法檢測，例如用分光光度計測量382nm的光密度，或者目測水溶液是否呈黃色。任選地也可以定量測定試驗樣品的生色團，因而可提供水溶液中的莽草酸量。定量測定可用任何適合的方法進行，例如與標準莽草酸比較，該標準樣品是用本發(fā)明方法由已知數(shù)量的莽草酸制成。本發(fā)明的一個較佳實施例中，水溶液的光密度是用分光光度計測量382nm得到的，通過與用已知量莽草酸配制的并用分光光度計測量382nm光密度的莽草酸標準品的比較而確定生色團的量。
本發(fā)明方法的實施中，較佳的是，對于未處理對照植物試驗樣品，它的生色團的檢測至少有0.05吸光度單位(AU)的吸收值，為了從分光光度計測量生色團獲得最佳效果的含最大量莽草酸/莽草羧基的試驗樣品，其生色團的檢測少于2.0AU吸收值。申請者已發(fā)現(xiàn)，用致死量的草甘膦處理過的植物，大多數(shù)都積累了莽草酸/莽草羧基到如下水平可將150mg葉組織以8倍(w/v)0.25N的鹽酸研磨制成的水溶液5-10μL，加入250μL的高碘酸鹽試劑和水而得到0.5毫升。在上述水溶液中，莽草酸/莽草羧基與高碘酸鹽試劑反應之后，加入0.5毫升含有亞硫酸鹽和氫氧化鈉的混合液終止反應，得到1毫升溶液，其吸收值大約為1.8AU，而未處理的對照植物產(chǎn)生的吸收值大約為0.1AU。
本發(fā)明的一個較佳實施例中，用本發(fā)明方法來測定植物組織的酸性水抽提液中的莽草酸的存在和/或水平。在本發(fā)明的這個實施例中，組織的試驗樣品，宜是含有按本文所述用高碘酸或含有高碘酸鹽和高碘酸的試劑處理，使莽草酸氧化制得的植物組織的水溶液的試驗樣品。將強堿加入該試驗樣品中，以產(chǎn)生生色團，再用亞硫酸鹽穩(wěn)定生色團。然后檢測生色團的存在，從而表明試驗樣品中莽草酸的存在。可任選的，定量測定該試驗樣品中的生色團的量，以提供試驗樣品中的莽草酸量。
延遲檢測和/或定量測定生色團達到至少1小時的能力，和不用額外的操作即能運用組織抽提的能力使得本發(fā)明方法非常適合于高通量篩選，以及其它的檢測大量樣品的情況。
例如，組織抽提可在96孔板或更小的塑料板中的少量的植物組織上進行，通過自動采樣處理裝置從中取出等份抽提液，以測定其吸收值。植物樣品中的莽草酸量可以通過與莽草酸標準品的吸收值比較而確定。
具體實施例方式
實施例1-試劑的背景吸收將250μL水、250μL高碘酸鹽試劑、0.3毫升1N的NaOH和0.2毫升0.056M的Na2SO3混合，測定382nm的吸收值。吸收值是0.047，在5分鐘內(nèi)沒有明顯的漂移。選擇0.056M的亞硫酸鈉，是因其與加入的高碘酸鹽的摩爾相等。
高碘酸鹽試劑系將重量百分比0.5％的高碘酸和重量百分比0.5％的偏高碘酸鈉溶于水中制成。
表1加入試驗溶液 T＝0分時T＝5分時T＝30分時T＝60分時的物質的A(382) 的A(382)的A(382) 的A(382)先加NaOH，0.949 0.949 0.9410.924然后加Na2SO3加混合溶液 0.959 0.957 0.9530.930加堿后再加入亞硫酸鈉，使生色團具有超過30分鐘的優(yōu)異穩(wěn)定性，60分鐘后僅有大約3％的吸收值損失；而加入混合試劑，稍微增加了其敏感性，穩(wěn)定性相當?；旌先芤菏覝貢r可穩(wěn)定大約12小時，但另外的試驗可能顯示它能穩(wěn)定更長的時間。標準曲線的繪制將表2的每一個條目所顯示2mM莽草酸量加到在1.5毫升聚丙烯微型試管中，并加入水至250μL。然后加入250μL的高碘酸鹽試劑，將該試管37℃放置30分鐘。在第30分鐘時加入NaOH/Na2SO3混合試劑。在5分鐘內(nèi)測完各生成溶液的382nm吸收值，將兩組試驗結果平均，其值列于表2中的第2欄。
表2加2mM莽草酸的 僅加水的A(382)加了植物抽提液的A體積(μL)值 (382)值0 0.0660.0952 0.2180.2664 0.4090.4796 0.5750.66410 0.9441.02814 1.2431.320將黑麥草(Lolium perrenne)培養(yǎng)在溫室的土壤中2-3周，直到它長出3-4片葉子。采集其在空氣中的部分，然后立即將此部分冷凍，維持在-80℃。為了制備植物抽提液，將大約1克的組織樣品解凍并稱量。在液氮中將組織冷凍，并用研缽和杵將其研磨成細粉末。然后加入相當于4倍組織重量體積的0.25N鹽酸，再將得到的漿研磨5分鐘。將此材料以25000轉/分鐘離心15分鐘，用移液管將上清液移到琥珀色玻璃小瓶中。
重復上述繪制標準曲線的方法，但將5μL未處理的黑麥草(Lolium)抽提液加到每個試管中。其結果列在表2中的第三欄。如果將這些數(shù)據(jù)繪制成吸收值對所加莽草酸的曲線，將得到兩條平行的直線。僅對于莽草酸而言，其研究數(shù)據(jù)表明，在這個試驗步驟中，存在的莽草酸和其385nm的吸收值有直接的關系，其吸收值至少達到1.25AU。加入植物抽提液及莽草酸后所得的研究數(shù)據(jù)表明，未處理黑麥草(Lolium perrenne)抽提液含有少量的莽草酸，以及加入的植物抽提液并不影響到莽草酸的化學測試。
權利要求
1.一種檢測水溶液中莽草酸的方法，其特征在于，它包括(a)用高碘酸或含有高碘酸鹽和高碘酸的試劑氧化莽草酸；(b)加入強堿，產(chǎn)生生色團；(c)用亞硫酸鹽穩(wěn)定所述生色團；(d)檢測所述生色團的存在；以及可任選地(e)定量測定所述生色團的量。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述強堿是氫氧化鈉。
3.如權利要求1所述的方法，其中，所述亞硫酸鹽是亞硫酸鈉。
4.如權利要求1所述的方法，其中，所述步驟(b)和(c)是通過加入含有亞硫酸鹽和強堿的混合液同時進行。
5.如權利要求1所述的方法，其中，步驟(a)用含高碘酸和高碘酸鹽的試劑進行。
6.一種檢測試驗樣品中的莽草酸的方法，它包括(a)用高碘酸或含有高碘酸鹽和高碘酸的試劑處理試驗樣品；(b)在所述試驗樣品中加入強堿，產(chǎn)生生色團；(c)用亞硫酸鹽穩(wěn)定所述生色團；(d)檢測所述生色團的存在；以及可任選地(e)定量測定所述生色團的量。
7.如權利要求6所述的方法，其中，所述強堿是氫氧化鈉。
8.如權利要求6所述的方法，其中，所述試驗樣品是植物組織樣品。
9.如權利要求6所述的方法，其中，所述亞硫酸鹽是亞硫酸鈉。
10.如權利要求6所述的方法，其中，所述步驟(b)和(c)加入含有亞硫酸鹽和強堿的混合液同時進行。
11.如權利要求6所述的方法，其中，步驟(a)使用含高碘酸和高碘酸鹽的試劑進行。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測莽草酸的方法,它包括:用高碘酸或含有高碘酸鹽和高碘酸的試劑氧化莽草酸;加入強堿,以產(chǎn)生生色團;加入亞硫酸鹽,以穩(wěn)定生色團;檢測生色團的存在;還可任選地進行生色團的定量測定。本發(fā)明的方法可直接應用于組織抽提液,應用于植物組織抽提液較佳。
文檔編號G01N33/66GK1351711SQ00806428
公開日2002年5月29日 申請日期2000年2月7日 優(yōu)先權日1999年2月19日
發(fā)明者T·H·克羅馬蒂, N·D·波爾格 申請人:先正達有限公司