專利名稱：壓電基因診斷實(shí)時定量分析方法與儀器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于體外基因檢測方法和實(shí)施該方法的儀器。
背景技術(shù)：
絕大多數(shù)疾病的發(fā)生發(fā)展都與患者遺傳背景或者其改變有關(guān)，基因診斷是指運(yùn)用基因分析對疾病做出診斷的方法?；蛟\斷的對象首先是病原生物的侵入，直接檢測病原生物的遺傳物質(zhì)可以大大提高診斷的敏感性和特異性，而且在無法得到商業(yè)化抗體時，基因診斷就成為檢測病原微生物感染，尤其是病毒感染的唯一手段；其次是先天遺傳性疾患，一些發(fā)病原因確定的遺傳性疾患和其它病因尚不清楚的疾病都可能與某個或某些基因的持有或改變有關(guān)；再者是后天基因突變引起的疾病，例如腫瘤的發(fā)生可以初步認(rèn)為是由于個別細(xì)胞基因如抑癌基因或癌基因發(fā)生突變而引起的細(xì)胞無限增殖；其它如DNA指紋、個體識別、親子關(guān)系識別、法醫(yī)物證等。基因診斷不僅對臨床診斷，而且對疾病的病因和發(fā)病機(jī)理的研究、為病人檢測療效，分析愈后，客觀正確地評價人體的健康狀況都具有重要的意義?；蛟\斷技術(shù)的應(yīng)用，使許多疑難病的診斷變得簡便、精確，避免了臨床上有些病癥靠經(jīng)驗(yàn)指導(dǎo)治療的盲目性，達(dá)到了最早、最有效、最經(jīng)濟(jì)的治療目的。
但是基因樣品的缺乏是進(jìn)行基因診斷的一大障礙。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的問世，為此提供了有效的手段。PCR技術(shù)是利用熱穩(wěn)定的DNA合成酶-Taq多聚酶在體外合成DNA片段，通過反復(fù)循環(huán)的DNA變性、退火和延伸，可使靶DNA得到大量擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增DNA片段只是一個重要手段，擴(kuò)增片段的檢測和分析才是目的，因此，PCR擴(kuò)增后根據(jù)研究對象和目的的不同而主要采用以下兩種分析方法凝膠電泳分析法通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后用溴化乙淀染色，于UV燈下觀察結(jié)果并拍照。凝膠電泳可以鑒定產(chǎn)物的大小，檢測擴(kuò)增的情況。斑點(diǎn)雜交法首先將擴(kuò)增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的探針雜交。斑點(diǎn)雜交法有助于檢測突變DNA的突變類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分型。
PCR技術(shù)用于定量基因診斷還需采用特定的方法?！吨腥A檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》2000，23(2):120-121發(fā)表的“定量聚合酶鏈反應(yīng)的研究進(jìn)展與臨床應(yīng)用”文章，綜述了幾種傳統(tǒng)定量PCR方法，主要包括內(nèi)標(biāo)法在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的人工合成內(nèi)標(biāo)和-對引物(其一為熒光標(biāo)記)，在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量檢測模板。PCR-ELISA法利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再與加入的酶標(biāo)抗地高辛或抗生物素結(jié)合，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。但上述傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測，即PCR到達(dá)平臺期后進(jìn)行檢測，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，由于在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，PCR反應(yīng)中存在內(nèi)標(biāo)與模板之間的干擾和競爭，尤其當(dāng)兩者的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。另外由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。因此，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但實(shí)際上仍然只是一種半定量的方法。
為此，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)于1996年提出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。美國Applied Biosystems公司1999年公開的“DNA/RNA Real-Time Quantitative PCR-Rev.A&B”報告，介紹了實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的原理和特點(diǎn)。所謂實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光探針，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。熒光定量PCR成功的一個關(guān)鍵是采用特殊的熒光探針實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度。在該技術(shù)中，將PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號即熒光本底信號作為熒光域值，每個反應(yīng)管內(nèi)(即每個模板)的熒光信號到達(dá)域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct)與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。與傳統(tǒng)PCR的內(nèi)標(biāo)定量方法比較，實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。由于PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對數(shù)期)，此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性較好，大大提高了定量的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。
另外，近年出現(xiàn)的基因芯片技術(shù)也可望應(yīng)用于基因診斷?；蛐酒夹g(shù)是指將大量基因探針分子(基因探針陣列)固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息，實(shí)現(xiàn)對基因的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測?；蛐酒夹g(shù)解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作繁雜、自動化程度低、操作序列數(shù)量少、檢測效率低等不足。而且，通過設(shè)計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的基因診斷應(yīng)用。《生物工程進(jìn)展》1999,Vol.19(No.4)45-51發(fā)表的“基因芯片技術(shù)及應(yīng)用研究進(jìn)展”文章，綜述了國內(nèi)外對基因芯片技術(shù)在加工制備、功能和應(yīng)用方面的主要研究成果?，F(xiàn)有基因芯片技術(shù)一方面基因芯片的制備主要是采用固相原位合成結(jié)合照相平板印刷的技術(shù)在玻璃片等載體上合成、固定探針分子陣列；另一方面基因芯片的檢測主要是利用熒光素等標(biāo)記靶基因，借助激光共聚焦顯微掃描技術(shù)或電荷藕合器件攝像技術(shù)對基因芯片上雜交靶基因的熒光信號進(jìn)行檢測和分析。
上述實(shí)時熒光定量PCR和基因芯片技術(shù)，一方面，均是采用熒光檢測，需要大型復(fù)雜、精密昂貴的檢測設(shè)備，同時需要較長時間(3-4小時)，即需在多次(15次以上)擴(kuò)增循環(huán)后，或完成雜交反應(yīng)后進(jìn)行檢測，而且影響分析結(jié)果準(zhǔn)確性的因素較多，難以控制把握，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，并且需對靶基因或探針進(jìn)行熒光標(biāo)記，增加了消耗試劑成本；另一方面，一次分析過程包括多步操作，尤其是包括樣品預(yù)處理、靶基因獲取和標(biāo)記等，操作繁瑣，整個分析系統(tǒng)難以集成化、自動化和小型化。這些缺陷是目前推廣普及基因診斷技術(shù)的難以逾越的障礙。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于此，本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有基因診斷技術(shù)存在的上述問題，提供一種準(zhǔn)確靈敏、快速高效、自動簡便、成本低廉的壓電基因診斷實(shí)時定量分析方法與儀器。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明利用多重PCR技術(shù)同時擴(kuò)增多種靶基因，采用基因探針診斷技術(shù)與壓電傳感器芯片技術(shù)相結(jié)合的壓電基因診斷芯片，同時識別雜交多種靶基因，并實(shí)時獲取各個探針一靶基因雜交的反應(yīng)信息，以準(zhǔn)確靈敏、快速高效、簡便價廉地進(jìn)行基因診斷的分析；另一方面，本發(fā)明將樣品處理、進(jìn)樣檢測、結(jié)果分析等基因診斷分析過程的各個模塊集成于一個系統(tǒng)，構(gòu)建壓電基因診斷實(shí)時定量分析儀器，采用微機(jī)和特定程序，以自動控制進(jìn)行基因診斷定量分析的各個環(huán)節(jié)，并動態(tài)顯示各環(huán)節(jié)信息，來實(shí)施本發(fā)明的基因診斷分析方法。
本發(fā)明的壓電基因診斷實(shí)時定量分析方法，對某類疾病的基因診斷定量分析，采用有至少一種疾病基因的探針的壓電基因診斷芯片，將有至少一種靶基因、相應(yīng)的引物、Taq-DNA多聚酶、三磷酸脫氧核苷的樣品與壓電基因診斷芯片接觸，進(jìn)行雜交-延伸-變性的溫度循環(huán)，雜交溫度為30-70℃，延伸溫度為65-80℃，變性溫度為85-99℃；溫度循環(huán)起點(diǎn)為變性溫度10-60秒，然后雜交溫度10-60秒，終點(diǎn)為延伸溫度10-60秒；在雜交階段，樣品中的各靶基因與對應(yīng)的疾病基因的探針及引物基于序列互補(bǔ)進(jìn)行雜交結(jié)合；在延伸階段，雜交的探針和引物以靶基因?yàn)槟０逶赥aq-DNA多聚酶的作用下進(jìn)行多聚酶鏈反應(yīng)，使探針和引物得到延伸，直至兩者的鏈長與靶基因相同；在變性階段，探針-靶基因、引物-靶基因雜合物解離，并根據(jù)第一個雜交階段的頻率變化即本底噪聲設(shè)置頻率變化的域值，當(dāng)頻率變化超過域值時，停止循環(huán)，再根據(jù)頻率變化達(dá)到域值所需的循環(huán)次數(shù)與樣品中靶基因濃度的對數(shù)存在線性關(guān)系，用外標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行靶基因的定量分析。
上述探針、引物為20-30個堿基、序列與靶基因互補(bǔ)、且兩者序列不重復(fù)的寡核苷酸；本底噪聲(G)為預(yù)定的時間內(nèi)頻率變化的標(biāo)準(zhǔn)偏差，或?yàn)轭A(yù)定的時間內(nèi)頻率變化的極差(最大頻率與最小頻率之差)，頻變域值(fR)設(shè)為本底噪聲(G)的2-10倍；頻率變化達(dá)到域值所需的循環(huán)次數(shù)(Nt)與樣品中靶基因濃度(CT)的關(guān)系為Nt=AlogCT+B，式中A和B對某一傳感器和靶基因在同一溫度循環(huán)下為與CT無關(guān)的常數(shù)；外標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過測定2-10個含已知濃度靶基因的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測出對應(yīng)的各Nt對logCT作圖得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線；樣品中靶基因的濃度是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品達(dá)到域值所需的循環(huán)次數(shù)測得。
實(shí)施本發(fā)明的基因診斷分析方法的壓電基因診斷實(shí)時定量分析儀(參見附圖1、2)，包含殼體(10)，殼體上的控制面板、顯示器，殼體中的電源(20)及其相聯(lián)接的電路、微型計算機(jī)的主板模塊(60)、分析軟件，其特征在于殼體中有與電路和主板模塊相聯(lián)接的能一次提取至少一個臨床DNA樣品的樣品制備模塊(30)、選擇并輸送樣品的定位液流模塊、擴(kuò)增并檢測靶基因的壓電基因診斷芯片檢測模塊(50)。
上述的樣品制備模塊(30)有由2-100個、容積為0.2-2cm3的放置試管的微孔構(gòu)成的微孔板(31)，有由加熱與制冷器件及其相聯(lián)接的溫度傳感器構(gòu)成的溫度控制器(32)。
上述的定位液流模塊，有由驅(qū)動機(jī)驅(qū)動的機(jī)械臂(41)及其相連的吸針(42)，吸針、蠕動泵(43)、壓電基因診斷芯片檢測模塊(50)、廢液儲存瓶(47)依次連通，壓電基因診斷芯片檢測模塊的進(jìn)口和出口分別有液位傳感器(44、45)。
上述的壓電基因診斷芯片檢測模塊(50)有微體積流通型檢測池(52)和封裝在其中的由壓電基因傳感器陣列構(gòu)成的壓電基因診斷芯片(51)，與電路及主板模塊(60)中壓電基因診斷芯片檢測電路相連。微體積流通型檢測池(52)有在檢測池上的半導(dǎo)體加熱與制冷器件及其相聯(lián)接的溫度控制器(53)。
使用本發(fā)明的壓電基因診斷實(shí)時定量分析儀(參見附圖)，首先，根據(jù)臨床診斷對象，選擇相應(yīng)的壓電基因診斷檢測模塊和基因診斷試劑試管，將壓電基因診斷芯片檢測模塊置入壓電基因診斷實(shí)時定量分析儀中，將配備好的樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液加入基因診斷試劑試管并置入樣品制備模塊。然后，通過分析軟件設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度、樣品序列及其待檢靶基因組、以及樣品制備、定位液流和壓電基因診斷芯片檢測模塊的參數(shù)。最后，由程序控制自動實(shí)施并動態(tài)顯示樣品制備、定位液流和壓電基因診斷芯片檢測模塊的狀態(tài)，以及壓電基因診斷芯片的檢測信號(頻率變化)，當(dāng)頻率變化達(dá)到設(shè)定的頻變域值時，停止循環(huán)，壓電基因診斷芯片檢測模塊保持在變性階段，同時開始吸取清洗溶液，壓電基因診斷芯片各位點(diǎn)頻率指示各位點(diǎn)恢復(fù)檢測前頻率后，排空檢測池溶液，測定下一個樣品。完成所有樣品測定后，進(jìn)入數(shù)據(jù)分析界面，給出各靶基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其線性參數(shù)(斜率、截距和相關(guān)系數(shù))，以及各樣品中各待測靶基因的濃度。
本發(fā)明與已有基因診斷技術(shù)比較，具有如下的優(yōu)點(diǎn)和效果。
首先，本發(fā)明壓電基因診斷實(shí)時定量分析方法，采用壓電傳感器芯片與基因診斷技術(shù)相結(jié)合的壓電基因診斷芯片，一方面具有壓電傳感技術(shù)高靈敏、實(shí)時監(jiān)測芯片上探針-靶基因雜交反應(yīng)的獨(dú)特優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)了在壓電基因診斷芯片上同時進(jìn)行雜交反應(yīng)與信號檢測兩個步驟，使本發(fā)明分析方法簡便快捷；另一方面，又具有基因診斷芯片大信息量、高效率的優(yōu)勢，使本發(fā)明分析方法可一次同時對多個靶基因進(jìn)行檢測。
其次，本發(fā)明壓電基因診斷實(shí)時定量分析方法，一方面，建立在動態(tài)跟蹤分析探針-靶基因雜交反應(yīng)的基礎(chǔ)上，消除了終點(diǎn)檢測方法中影響分析結(jié)果準(zhǔn)確性的因素，使本發(fā)明分析方法更為準(zhǔn)確可靠；另一方面，通過探針雜交確定靶基因，因探針的序列具有特異性，故避免了假陽性，也保證了本發(fā)明分析結(jié)果的可靠性。
再次，本發(fā)明壓電基因診斷實(shí)時定量分析方法，一方面，所用探針和靶基因都不需標(biāo)記，也不另加標(biāo)記物，既降低了試劑費(fèi)用，又對環(huán)境無污染；另一方面，與通常PCR用熒光檢測基因需擴(kuò)增至50-100ng數(shù)量級相比，只需擴(kuò)增至pg數(shù)量級，大大減少了循環(huán)次數(shù)，縮短了檢測時間，同時還大大減少了試劑如Taq酶的用量，節(jié)省了診斷檢驗(yàn)的消耗費(fèi)用。
最后，本發(fā)明構(gòu)建的壓電基因診斷實(shí)時定量分析儀，一方面，壓電基因診斷芯片的檢測即頻率測量精度高而相關(guān)電路簡單，價廉且易于小型化；另一方面，將包括樣品制備、基因擴(kuò)增和檢測、數(shù)據(jù)分析的整個分析過程集成化，操作簡便，自動高速，可在一個系統(tǒng)、短時間內(nèi)完成從原始樣品到獲取所需分析結(jié)果的全套操作，而且，全分析過程的集成化同時使分析體系與外界嚴(yán)密隔離，有效避免了污染，對外界環(huán)境無須嚴(yán)格的潔凈要求。
本發(fā)明適于臨床疾病診斷及分子機(jī)理的研究、監(jiān)測流行病和傳染病擴(kuò)散、監(jiān)測有害微生物的發(fā)生和擴(kuò)散等，具有廣泛的應(yīng)用前景。
下面，再用實(shí)施例及其附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步地說明。


附圖的簡要說明。
圖1是本發(fā)明的一種壓電基因診斷實(shí)時定量分析儀的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是圖1的結(jié)構(gòu)原理圖。
圖3是使用圖1進(jìn)行基因診斷分析時壓電基因診斷檢測模塊的溫度循環(huán)圖。
圖4是使用圖1進(jìn)行基因診斷分析時壓電基因診斷芯片一個位點(diǎn)與圖3對應(yīng)的頻率變化-時間關(guān)系圖。
圖5是使用圖1進(jìn)行基因診斷分析時對同一靶基因濃度多次測定的頻率變化-循環(huán)次數(shù)關(guān)系圖。
圖6是本發(fā)明壓電基因診斷實(shí)時定量分析法的一種靶基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本發(fā)明的一種壓電基因診斷實(shí)時定量分析儀，如附圖1、2所示。由殼體10、電源20、樣品制備模塊30、定位液流模塊、壓電基因診斷芯片檢測模塊50、電路及主板模塊60、以及壓電基因診斷實(shí)時定量分析儀軟件等構(gòu)成。
上述殼體10，和殼體中的電源20，采用通常分析儀器的殼體和電源結(jié)構(gòu)。殼體提供內(nèi)裝結(jié)構(gòu)和外觀造型，使儀器內(nèi)部各模塊間緊湊且無干擾，外型美觀。殼體面上有與微機(jī)相連的控制面板11和顯示器12，控制面板上有通常的數(shù)字鍵、上下左右鍵以及確認(rèn)和消除鍵，顯示器為通常分析儀器的顯示器。電源向各模塊提供工作電源。
上述樣品制備模塊30，實(shí)現(xiàn)多個樣品的同時制備，即一次完成多個臨床樣品的DNA提取，由微孔板31和溫度控制器32構(gòu)成。上述的微孔板31用熱導(dǎo)性良好的金屬材料，如金、銀、銅、鋁等，制成矩形或圓形板，板上開制有多個微孔，微孔體積為0.2-2cm3，微孔數(shù)為2-100，微孔的數(shù)量和體積，以及由此而定的板的大小，視實(shí)際應(yīng)用的需要而定。上述的溫度控制器32由用半導(dǎo)體制成的加熱與制冷器件和溫度傳感器構(gòu)成，與主板及電路模塊60中相應(yīng)電路相連，受相應(yīng)子程序控制，上述溫度控制的精度為±0.1℃以下，加熱和制冷速度在1.5℃/sec以上，恒溫時每分鐘的波動小于±0.1℃。
上述定位液流模塊，實(shí)現(xiàn)自動選擇進(jìn)樣，選定吸取待測溶液并送入檢測池，由通常結(jié)構(gòu)的機(jī)械臂41、吸針42、蠕動泵43、液位傳感器44、45、連接膠管46構(gòu)成。上述的機(jī)械臂41，包含X、Y二坐標(biāo)數(shù)控聯(lián)動及Z坐標(biāo)驅(qū)動機(jī)械結(jié)構(gòu)，與主板及電路模塊60中相應(yīng)電路相連，受相應(yīng)子程序控制。上述的吸針42，用耐熱、耐化學(xué)腐蝕的材料，如不銹鋼、聚四氟乙烯等制成，固定在機(jī)械臂41上。上述的蠕動泵43，采用通常蠕動泵的殼體和結(jié)構(gòu)，與主板及電路模塊60中相應(yīng)電路相連，受相應(yīng)子程序控制。上述的液位傳感器44、45采用光電式液體位置傳感器，分別安置在壓電基因診斷芯片檢測池52的前后，與電路及主板模塊60中相應(yīng)電路相連。上述的連接膠管46，采用耐熱、耐熱、耐化學(xué)腐蝕的彈性材料，如聚四氟乙烯等制成，與吸針42和檢測池52相連，通向廢液儲存瓶47。
上述壓電基因診斷芯片檢測模塊50，實(shí)現(xiàn)靶基因的擴(kuò)增和檢測，由壓電基因診斷芯片51、微體積流通型檢測池52、溫度控制器構(gòu)成。上述的壓電基因診斷芯片51，由壓電基因傳感器陣列構(gòu)成，上述壓電基因診斷芯片封裝于微體積流通型檢測池52中，與電路及主板模塊60中的壓電基因診斷芯片檢測電路相連。上述的微體積流通型檢測池52，由檢測池52和安裝在檢測池上的半導(dǎo)體加熱與制冷器件及其溫度控制器53構(gòu)成，與電路及主板模塊60中溫度檢測與控制電路相連。上述壓電基因診斷芯片檢測電路頻率測量的精度為1Hz以下、每分鐘的波動小于±1Hz，上述溫度測量的精度為±0.1℃以下，加熱和制冷速度在1.5℃/sec以上，恒溫時每分鐘的波動小于±0.1℃。
上述電路及主板模塊60，為各模塊提供工作電路及接口電路，以及微機(jī)功能，由上述各模塊的電路和微機(jī)主板構(gòu)成，微機(jī)主板采用奔騰Ⅱ以上，有良好的穩(wěn)定性和可擴(kuò)展性，如華碩2000年標(biāo)準(zhǔn)主板P3V133。各模塊電路通過接口與微機(jī)主板相連。
上述壓電基因診斷實(shí)時定量分析軟件，實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)總控以及數(shù)據(jù)分析。分析軟件由總控界面以及數(shù)據(jù)分析界面構(gòu)成。上述的總控界面由與上述各模塊子程序通信、進(jìn)行系統(tǒng)總控、系統(tǒng)初始化與檢測模式設(shè)置、各模塊功能顯示、檢測數(shù)據(jù)調(diào)用和動態(tài)曲線顯示等子程序構(gòu)成。上述的數(shù)據(jù)分析界面給出標(biāo)準(zhǔn)曲線及其線性參數(shù)(斜率、截距和相關(guān)系數(shù))，和靶基因濃度。
使用本發(fā)明的上述壓電基因診斷實(shí)時定量分析儀實(shí)施本發(fā)明的壓電基因診斷實(shí)時定量分析方法的工作過程如下首先，在潔凈的、通常的試管如Ependoff管中，加入10-100μl準(zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列和樣品溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液系列為兩種或兩種以上包括空白(靶基因濃度為0)和已知濃度待檢靶基因組的溶液，如靶基因濃度為0、0.1×10-5mol/L的兩個標(biāo)準(zhǔn)溶液，或0、0.1×10-5、1×10-5mol/L的三個標(biāo)準(zhǔn)溶液，或0、0.1×10-5、0.5×10-5、1×10-5mol/L的四個標(biāo)準(zhǔn)溶液等。在上述各溶液試管中加入含引物、Taq-DNA多聚酶、三磷酸脫氧核苷的基因診斷試劑，使待檢靶基因與相應(yīng)的引物、Taq-DNA多聚酶、三磷酸脫氧核苷的樣品與壓電基因診斷芯片接觸，隨后，分別放入樣品制備模塊的微孔板的各微孔中。然后，通過總控界面和控制面板輸入而設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度、樣品序列及其待檢靶基因組、樣品制備的溫度與時間、以及溫度循環(huán)的溫度與時間等參數(shù)。
然后，由微機(jī)主板的程序控制下實(shí)施并動態(tài)顯示下列步驟①由溫度控制器控制，加熱樣品制備模塊而預(yù)制樣品，即加熱溫度85-99℃，并保持時間10-100秒。
②機(jī)械臂將吸針運(yùn)動至預(yù)定的微孔板中的一個樣品試管內(nèi)，開啟蠕動泵吸取樣品并注入檢測池，當(dāng)液位傳感器指示檢測池充滿樣品后，停止吸取、停止注入。
③按進(jìn)行雜交-延伸-變性的溫度循環(huán)，溫度循環(huán)的溫度和時間為變性階段85-99℃、10-60秒，雜交階段30-70℃、10-60秒，延伸階段65-80℃、10-60秒，如附圖3所示。在溫度循環(huán)的同時在顯示器上實(shí)時顯示壓電基因診斷芯片各與預(yù)定待檢靶基因組對應(yīng)的位點(diǎn)頻率變化-時間曲線，如附圖4所示，并根據(jù)各位點(diǎn)在第一個雜交階段的頻率變化確定該位點(diǎn)的頻變域值，如10-100Hz，當(dāng)各位點(diǎn)頻率變化達(dá)到或超過設(shè)定的頻變域值時，停止溫度循環(huán)，并確定各位點(diǎn)達(dá)到頻變域值時的循環(huán)次數(shù)。
④將檢測池加熱并保持在變性溫度，同時由吸針開始吸取清洗溶液清洗檢測池，待壓電基因診斷芯片各位點(diǎn)頻率指示各位點(diǎn)恢復(fù)檢測前頻率后，排空檢測池溶液并送至廢液儲存瓶。
重復(fù)第②～④步操作，測定其余樣品。
⑤完成所有溶液的檢測后，通過數(shù)據(jù)分析界面，程序處理數(shù)據(jù)，由標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的結(jié)果得出各靶基因檢測循環(huán)次數(shù)-靶基因濃度對數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如附圖6所示，再根據(jù)樣品靶基因檢測的循環(huán)次數(shù)得出樣品靶基因的濃度。
如前所述，本發(fā)明僅需較少的循環(huán)次數(shù)，通常少于10次，就可達(dá)到靶基因檢出所需的頻率變化，如附圖5所示，對同一濃度靶基因的溶液，多次測定頻率變化與溫度循環(huán)次數(shù)的關(guān)系，結(jié)果表明，達(dá)到頻變域值的循環(huán)次數(shù)有極好的重現(xiàn)性，但此后隨溫度循環(huán)次數(shù)的增加，不同測定下的頻率變化相差越大。因此，與實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)循環(huán)次數(shù)通常在15次以上相比，本發(fā)明基因定量分析具有更高的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，且時間更短的優(yōu)點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.壓電基因診斷實(shí)時定量分析方法，其特征在于采用壓電基因診斷芯片和頻率檢測儀，在壓電基因診斷芯片的電極陣列上固定有至少一種疾病基因的探針，將已加入含至少一種靶基因的引物、Taq-DNA多聚酶、三磷酸脫氧核苷的基因診斷試劑的樣品與壓電基因診斷芯片接觸，進(jìn)行雜交-延伸-變性的溫度循環(huán)，其雜交溫度為30-70℃，延伸溫度為65-80℃，變性溫度為85-99℃，溫度循環(huán)的起點(diǎn)為變性溫度10-60秒，然后雜交溫度10-60秒，終點(diǎn)為延伸溫度10-60秒；在雜交階段，靶基因與探針、引物基于序列互補(bǔ)進(jìn)行雜交結(jié)合，在延伸階段，雜交的探針和引物以靶基因?yàn)槟０逶赥aq-DNA多聚酶的催化作用下進(jìn)行多聚酶鏈反應(yīng)，使探針和引物得到延伸，在變性階段，探針-靶基因、引物-靶基因雜合物解離，隨溫度循環(huán)次數(shù)的增加，樣品中靶基因濃度增大，與探針結(jié)合的靶基因量擴(kuò)增，使電極表面質(zhì)量增加而各檢測位點(diǎn)的頻率發(fā)生變化，在溫度循環(huán)全過程中監(jiān)測頻率變化，將第一個雜交階段的頻率變化即本底噪聲設(shè)置為頻率變化的域值，當(dāng)頻率變化超過域值時，停止溫度循環(huán)，根據(jù)頻率變化達(dá)到域值所需的循環(huán)次數(shù)與樣品中靶基因濃度的對數(shù)存在的線性關(guān)系，用外標(biāo)準(zhǔn)曲線對靶基因進(jìn)行定量分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的壓電基因診斷實(shí)時定量分析方法，其特征在于所說的探針和引物均為20-30個堿基、序列與靶基因互補(bǔ)、且兩者序列不重復(fù)的寡核苷酸；本底噪聲即G為預(yù)定的時間內(nèi)頻率變化的標(biāo)準(zhǔn)偏差，或?yàn)轭A(yù)定的時間內(nèi)頻率變化的最大頻率與最小頻率之間的極差；頻率變化的域值即fR為本底噪聲的2-10倍；頻率變化達(dá)到域值所需的循環(huán)次數(shù)即Nt與樣品中靶基因濃度即CT的關(guān)系為Nt=AlogCT+B，式中A和B為常數(shù)；外標(biāo)準(zhǔn)曲線是經(jīng)測定2-10個含已知濃度靶基因的標(biāo)準(zhǔn)溶液所得對應(yīng)的各Nt對logCT作圖得出的曲線。
3.實(shí)施權(quán)利要求1或2所述方法的壓電基因診斷實(shí)時定量分析儀，包含殼體(10)，殼體上的控制面板、顯示器，殼體中的電源(20)及其相聯(lián)接的電路、微型計算機(jī)的主板模塊(60)、分析軟件，其特征在于殼體中有與電路和主板模塊相聯(lián)接的能一次提取至少一個臨床DNA樣品的樣品制備模塊(30)、選擇并輸送樣品的定位液流模塊(40)、擴(kuò)增并檢測靶基因的壓電基因診斷芯片檢測模塊(50)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的壓電基因診斷實(shí)時定量分析儀，其特征在于所說的樣品制備模塊(30)有由2-100個、容積為0.2-2cm3的放置試管的微孔構(gòu)成的微孔板(31)，有由加熱與制冷器件及其相聯(lián)接的溫度傳感器構(gòu)成的溫度控制器(32)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的壓電基因診斷實(shí)時定量分析儀，其特征在于所說的定位液流模塊有由驅(qū)動機(jī)驅(qū)動的機(jī)械臂(41)及其相連的吸針(42)，吸針、蠕動泵(43)、壓電基因診斷芯片檢測模塊(50)、廢液儲存瓶(47)依次連通，壓電基因診斷芯片檢測模塊的進(jìn)口和出口分別有液位傳感器(44、45)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的壓電基因診斷實(shí)時定量分析儀，其特征在于所說的壓電基因診斷芯片檢測模塊(50)有微體積流通型檢測池(52)和封裝在其中的由壓電基因傳感器陣列構(gòu)成的壓電基因診斷芯片(51)，有在檢測池上的半導(dǎo)體加熱與制冷器件及其相聯(lián)接的溫度控制器(53)。
全文摘要
本發(fā)明的壓電基因診斷實(shí)時定量分析方法與儀器屬于基因的體外檢測方法和實(shí)施該方法的儀器。旨在解決已有技術(shù)準(zhǔn)確性差、操作繁雜等問題。本方法是采用壓電基因診斷芯片和頻率檢測儀,利用多重PCR技術(shù)進(jìn)行雜交—延伸—變性的溫度循環(huán)擴(kuò)增靶基因,監(jiān)測并獲得頻率變化與靶基因濃度的的線性關(guān)系,再用外標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。本儀器包含殼體、電源及其相聯(lián)接的電路和主板模塊、分析軟件、樣品制備模塊、定位液流模塊、壓電基因診斷芯片檢測模塊。適于臨床疾病診斷及分子機(jī)理的研究、監(jiān)測流行病和傳染病擴(kuò)散、有害微生物的發(fā)生和擴(kuò)散等。
文檔編號G01N33/53GK1325028SQ0110861
公開日2001年12月5日 申請日期2001年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月10日
發(fā)明者莫志宏, 吳中福, 靳萍, 田學(xué)隆, 郭剛 申請人:重慶大學(xué)