專利名稱：一種動(dòng)物性食品中氯霉素酶免疫檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種動(dòng)物性食品中氯霉素(chlora mphenicol，CAP)酶免疫檢測試劑盒及其檢測方法，屬于酶免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氯霉素是一種廣譜抗生素，已廣泛用于動(dòng)物各種傳染性疾病的治療，但是氯霉素有嚴(yán)重的副作用，它能抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病，因此動(dòng)物性食品中的氯霉素殘留對人類的健康構(gòu)成了潛在的危害，美國和歐共體對氯霉素使用于動(dòng)物和動(dòng)物性食品中氯霉素殘留量有嚴(yán)格的限止。我國尚未制定氯霉素殘留量的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。由于氯霉素抑菌廣譜，效果好和價(jià)廉，在我國用它治療家畜、禽類疾病也較普遍，為了保障我國人民的健康和擴(kuò)大動(dòng)物性食品的貿(mào)易往來，加強(qiáng)對動(dòng)物性食品中氯霉素殘留的檢測是非常必要的。
測定氯霉素殘留的方法，主要有微生物學(xué)方法，色譜法，放射免疫法，酶免疫分析法等。國內(nèi)外文獻(xiàn)已有許多報(bào)導(dǎo)(見“中國食品衛(wèi)生雜志”2002年第14卷第2期P44-47)對檢測方法的要求是操作簡便，精確度高，特異性強(qiáng)。國外氯霉素酶免疫檢測試劑盒有若干種推向市場已見文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，但國內(nèi)尚未見有此類試劑盒面市的報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)構(gòu)簡單，操作方便，價(jià)格便宜的氯霉素酶免疫檢測試劑盒。同時(shí)提供一種樣品前處理簡單，提取后就可直接測定一次可測定大量樣本，簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、廉價(jià)的檢測氯霉素的方法。
本發(fā)明試劑盒主要由盒體(1)、酶標(biāo)板(2)、A試劑瓶(標(biāo)準(zhǔn)氯霉素試劑)(3)、B試劑瓶(稀釋液)(4)、C試劑瓶(酶標(biāo)抗原試劑)(5)、D試劑瓶(酶標(biāo)抗原稀釋液)(6)、E試劑瓶(含吐溫-20的磷酸鹽固體)(7)、F試劑瓶(鄰苯二胺OPD試劑)(8)、G試劑瓶(醋酸鈉一檸檬酸緩沖液)(9)、H試劑瓶(H2O2溶液)(10)、I試劑瓶(硫酸溶液)(11)、海綿托架(12)所組成，海綿托架(12)上制有孔和凹槽，上述A、B、C、D、E、F、G、H、I試劑瓶安放在海綿托架的孔和凹槽內(nèi)。海綿托架(12)及酶標(biāo)板(2)均安放在盒體(1)內(nèi)。酶標(biāo)板(2)有塑料支架和各自分開的帶孔穴的塑料條組成。
本發(fā)明原理是采用酶免疫吸附(ELISA)競爭法來檢測氯霉素(CAP)。
一、特異性抗體(CAP單抗)的制備1、抗原制備，以人工合成的氯霉素——牛血清白蛋白(CAP-BSA)作為免疫抗原。
2、免疫動(dòng)物采用BALB/C小鼠作為免疫動(dòng)物，免疫抗原劑量為50～100ng，皮下注射，3～4周后，腹腔注射加強(qiáng)免疫2～4次，取脾細(xì)胞。
3、細(xì)胞融合將SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞在聚乙烯醇的溶劑中進(jìn)行細(xì)胞融合，在HAT培養(yǎng)液中作選擇培養(yǎng)。
4、雜交瘤細(xì)胞克隆化采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，直至得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。
5、單克隆抗體(McAb)的保存在液氮-20℃凍存，使用時(shí)37℃水浴快速解凍。
6、McAb的生產(chǎn)和提純先小鼠腹腔注射液體石蠟，0.5ml/只，7-10天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5×105～106/只，7-10天后采集腹水。經(jīng)硫酸銨鹽析法進(jìn)行純化，小瓶分裝待用。
二、樣品處理1、牛奶樣品a.3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘去脂。
b.吸取并棄去上層脂肪層。
c.取5ml去脂牛奶加入150μl革瑞氏液I，搖勻后振蕩再加入150μl革瑞氏液II，迅速搖勻。
d.3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。
e.移去上清液，再用緩沖液將其1∶1稀釋(1份上清液+1份緩沖液)。
f.取50μl用于檢測。
2、肉樣a.用均質(zhì)器或搗碎機(jī)將去質(zhì)肉樣或腎臟進(jìn)行均質(zhì)。
b.取均質(zhì)后樣品5g，加20ml乙腈水溶液(84份乙腈+16份水)提取10分鐘。
c.3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。
d.用3ml去離子水稀釋3ml上清液，再用4.5ml乙酸乙酯提取。
e.3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。
f.將乙酸乙脂層吹干。
g.用1.5ml緩沖液將殘?jiān)芙猓偌尤?.5ml正己烷或正庚烷去脂。
h.徹底移去上層的正己烷或正庚烷層。
i.取50μl下層液用于檢測。
酶標(biāo)板有12孔、12條。酶標(biāo)板上用單克隆CAP抗體包被，每孔50-100μl，37℃，溫育2hr，用10g/L明膠封閉。包被后的每條酶標(biāo)板用鋁箔袋封好，置2-8℃冷芷保存。
用本試劑盒檢測氯霉素(CAP)的方法，是將單克隆CAP抗體包被在酶標(biāo)板(2)上，酶標(biāo)板(2)放在4℃左右冰箱過夜。再進(jìn)行試劑及酶底物混合液的配制。在A試劑(標(biāo)準(zhǔn)CAP)中加20-30mlB試劑混勻，在C試劑(酶標(biāo)抗原)中加入10-20mlD試劑(酶標(biāo)抗原稀釋液)，溶解、混勻，在2-8℃下保存，E試劑(含吐溫20的PBS固體)中加入去離子水配制成E洗滌液。先取出酶標(biāo)板，用E洗滌液洗滌2-4次，洗液不得溢出，每次間隔3-4分鐘，洗后用吸水紙拍干。然后加反應(yīng)物競爭吸附，在酶標(biāo)板小孔中加入配制好的試劑及樣品稀釋液進(jìn)行競爭免疫反應(yīng)，在1-3標(biāo)準(zhǔn)對照孔中僅加或不加酶標(biāo)抗原，加或不加標(biāo)準(zhǔn)CAP試劑，而在4-12樣品測定孔中，先后加入待測抗原和酶標(biāo)抗原，在37-38℃溫育1-1.5小時(shí)。再用E洗滌液洗板4-6次，每次間隔3-4分鐘，拍干，再加入酶底物混合液，混勻，在37-38℃避光作用15-20分鐘，顯色，最后加入I終止液(硫酸溶液)中止反應(yīng)，測定A490nm值。
C試劑(酶標(biāo)抗原試劑)為氯霉素-辣根過氧化物酶(CAP-HRP)，或酶標(biāo)羊抗兔抗體(SABC上海)，或酶標(biāo)豬抗兔抗體(Sigma，USA)，B試劑為PBST溶液(含10g/L BSA，0.01mol/L，PH7.4)，D試劑瓶(酶標(biāo)抗原稀釋液)為PBS溶液(含1％明膠，0.01mol/L，PH7.4)。
酶底物混合液，采用G試劑(醋酸鈉-檸檬酸緩沖液)和F試劑(鄰苯二胺)按G∶F＝7-9∶3-1稀釋和每ml此稀釋液加14μl H試劑(H2O2)混合配制而成，臨用前半小時(shí)內(nèi)配制。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是樣品前處理簡單，利用本試劑盒檢測CAP殘留，是簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、廉價(jià)的檢測方法。最低檢測限達(dá)50ng/kg。


圖1 試劑盒的直觀示意2 酶標(biāo)板的直觀示意中盒體(1)、酶標(biāo)板(2)，A試劑瓶(標(biāo)準(zhǔn)CAP試劑)(3)，B試劑瓶(稀釋液)(4)，C試劑瓶(酶標(biāo)抗原試劑)(5)，D試劑瓶(酶標(biāo)抗原稀釋液)(6)，E試劑瓶(含吐溫-20的磷酸鹽PBS固體)(7)，F(xiàn)試劑瓶(鄰苯二胺OPD試劑)(8)，G試劑瓶(醋酸鈉-檸檬酸緩沖液)(9)，H試劑瓶(H2O2溶液)(10)，I試劑瓶(硫酸溶液)(11)，海綿托架(12)，試劑盒應(yīng)放在2-8℃貯存，忌0℃下凍存，有效期為12個(gè)月。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1采用按照前述方法制備的單克隆CAP抗血清包被在酶標(biāo)板上，放入4℃冰箱過夜。
1、按照前述方法，進(jìn)行樣品處理。
2、試劑配制。
1)標(biāo)準(zhǔn)CAP試劑CAP加20mlB試劑(稀釋液)混勻。
2)酶標(biāo)抗原試劑C試劑加10mlD試劑(酶標(biāo)抗原稀釋液)溶解、混勻。
3)E洗滌液配制在含0.1％吐溫-20(Tween-20)的磷酸鹽(PBS)的E試劑中加入200ml蒸餾水配制E洗滌液，用于酶標(biāo)板洗滌。
4)底物混合液配制根據(jù)每次所需用量，用F試劑(鄰苯二胺)和G試劑(醋酸鈉-檸檬酸緩沖液)按G∶F＝7-9∶3-1的比例稀釋F試劑，再按每ml此稀釋液需加入14μl的雙氧水H試劑，配制成底物混合液，臨用前半小時(shí)內(nèi)配制。
3、將試劑盒平衡至室溫。
4、用E洗滌液洗酶標(biāo)板2次，洗液不得溢出；每次間隔3分鐘，放在吸水紙上拍干。
5、加反應(yīng)物進(jìn)行反應(yīng)，按下表所列，依次加入配制好的試劑及待測樣品稀釋液，1-3號孔為標(biāo)準(zhǔn)對照孔，4-12號孔為樣品測定孔，每批測定時(shí)，可以每孔置一只待測樣品，也可幾只孔置同一只待測樣品，進(jìn)行平行測定，也可用另一根酶標(biāo)板同時(shí)檢測，其1-12孔擴(kuò)大均為樣品孔，這可視具體待測樣品的數(shù)目多少而靈活決定。

按上表在4-12樣品測定孔中，先后加入待測抗原和酶標(biāo)抗原，而在1-3標(biāo)準(zhǔn)對照孔中，僅加或不加酶標(biāo)抗原。
6、反應(yīng)在37℃溫育放置1.5小時(shí)。
7、洗滌顯色用E洗滌液洗酶標(biāo)板4次，拍干，每孔加入50μl底物混合液，搖勻，在37°溫育15分鐘，顯色。
8、終止，加入I終止液(硫酸溶液)2mol/L50μl/孔。
9、測定先比較1-3號孔顏色，1號孔最深，2號孔次之，3號孔接近無色，說明標(biāo)準(zhǔn)正確。
目視法比較樣品孔與2號孔顏色，若比2號孔顏色淺，則為陽性，反之為陰性。若顏色與2號孔接近。則用酶標(biāo)儀測A490nm。
權(quán)利要求
1.一種氯霉素(CAP)酶免疫檢測試劑盒，其特征在于由盒體(1)，酶標(biāo)板(2)，A試劑瓶(標(biāo)準(zhǔn)CAP試劑)(3)，B試劑瓶(稀釋液)(4)，C試劑瓶(酶標(biāo)抗原試劑)(5)，D試劑瓶(酶標(biāo)抗原稀釋液)(6)，E試劑瓶(含吐溫-20的磷酸鹽PBS固體)(7)，F(xiàn)試劑瓶(鄰苯二胺OPD試劑)(8)，G試劑瓶(醋酸鈉-檸檬酸緩沖液)(9)，H試劑瓶(H2O2溶液)(10)，I試劑瓶(硫酸溶液)(11)，海綿托架(12)所組成，海綿托架(12)內(nèi)裝有上述A、B、C、D、E、F、G、H、I試劑瓶，海綿托架(12)及酶標(biāo)板(2)均安放在盒體(1)內(nèi)。
2.按照權(quán)利要求1所述的氯霉素(CAP)酶免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的海綿托架(12)上制有孔和凹槽。
3.按照權(quán)利要求1所述的氯霉素(CAP)酶免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)板(2)有塑料支架和各自分開的帶孔穴的塑料條組成。
4.一種用氯霉素(CAP)酶免疫檢測試劑盒檢測氯霉素的方法，先進(jìn)行樣品處理，其特征在于首先將單克隆CAP抗體包被在酶標(biāo)板上，酶標(biāo)板放在4℃冰箱過夜，再進(jìn)行試劑及酶底物混合液的配制，在A試劑(標(biāo)準(zhǔn)CAP)中加20-30mlB試劑混勻，在C試劑(酶標(biāo)抗原)中加入10-20ml D試劑，溶解混勻，在2-8℃下保存，用E試劑加入去離子水配制成E洗滌液，用E洗滌液洗酶標(biāo)板2-4次，洗液不得溢出，每次間隔3-4分鐘，洗后用吸水紙拍干，在酶標(biāo)板小孔中加入配制好的試劑及樣品稀釋液進(jìn)行競爭免疫反應(yīng)，在37-38℃溫育1～1.5h，再用E洗滌液洗板4-6次，每次間隔3-4min，拍干，再加入酶底物混合液，混勻，在37-38℃避光作用15-20分鐘，顯色，最后加入I終止液(硫酸溶液)中止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定A490nm值。
5.按照權(quán)利要求4所述的檢測氯霉素(CAP)的方法，其特征在于所述的C試劑(酶標(biāo)抗原試劑)為氯霉素-辣根過氧化物酶(CAP-HRP)或酶標(biāo)羊抗兔抗體(SABC，上海)或酶標(biāo)豬抗兔抗體(Sigma，USA)，B試劑(稀釋液)為PBST溶液(含10g/L BSA，0.01mol/L，PH7.4)，D試劑(酶標(biāo)抗原稀釋液)為PBS溶液(含1％明膠，0.01mol/L，PH7.4)。
6.按照權(quán)利要求4所述的檢測氯霉素(CAP)的方法，其特征在于所述的酶底物混合液，采用G試劑(醋酸鈉-檸檬酸緩沖液)和F試劑(鄰苯二胺)按G∶F＝7-9∶3-1，和每ml此稀釋液加14μl H試劑(H2O2)混合配制而成，臨用前半小時(shí)內(nèi)配制。
全文摘要
一種氯霉素(CAP)酶免疫檢測試劑盒及其檢測方法,屬于酶免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明配制的試劑盒,采取酶免疫吸附(ELISA)競爭法檢測CAP,利用CAP和牛血清白蛋白(BSA)偶連物作為CAP抗原免疫小鼠,獲得含有CAP抗體的單克隆CAP抗血清,經(jīng)分離、提純、稀釋后包被在酶標(biāo)板上,溫育、洗滌,加入樣品稀釋液及酶標(biāo)抗原,使兩者進(jìn)行反應(yīng)、洗滌,加酶底物顯色。本發(fā)明樣品前處理簡單,是一種簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、廉價(jià)的檢測方法,尤其適用于肉制品的CAP殘留檢測。
文檔編號G01N33/543GK1389729SQ02137940
公開日2003年1月8日 申請日期2002年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月12日
發(fā)明者胥傳來, 丁宏標(biāo), 李相前, 邵蔚藍(lán), 徐保國, 詹斌 申請人:江南大學(xué)