專利名稱：核酸三鏈體和四鏈體形成的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明背景本發(fā)明涉及核酸多鏈體，更具體而言，涉及把它們生成三鏈體和四鏈體的方法，以及在分析中利用它們檢測(cè)特異核酸的方法。
2.相關(guān)技術(shù)描述互補(bǔ)堿基序列的兩條單鏈核酸分子能夠相互特異性結(jié)合，既為研究又為診斷工具提供了強(qiáng)大的基礎(chǔ)。對(duì)單鏈分子與雙鏈靶結(jié)合的能力以及雙鏈分子與雙鏈靶結(jié)合的能力的探索一直比這種“常規(guī)雜交”的探索不完全。與雙鏈靶結(jié)合的能力比常規(guī)雜交具有潛在的優(yōu)勢(shì)。這些優(yōu)勢(shì)可部分源自下列事實(shí)雙鏈靶不會(huì)變性，使得雜交條件“更溫和”，為靶提供較少傾向于成為完全的無(wú)規(guī)卷曲。它們可部分源自下列事實(shí)堿基配對(duì)機(jī)制將至少部分不同于常規(guī)雜交，使得對(duì)于更有利的動(dòng)力學(xué)和在雜交反應(yīng)混合物中所需探針量的降低具有可能性。
生成多鏈體的現(xiàn)有技術(shù)包括1)三鏈體的形成作為部分同源重組過(guò)程，這是一個(gè)由細(xì)菌蛋白R(shí)ecA和其他生物中有相似功能的蛋白所介導(dǎo)的過(guò)程；2)在原位雜交過(guò)程中3-鏈結(jié)構(gòu)的生成(例如，Bresser等的美國(guó)專利5,707,801)；以及3)依賴于Hoogstein型鍵合的3-鏈或4-鏈的復(fù)合體。
這些現(xiàn)有技術(shù)未充分開(kāi)發(fā)形成多鏈體的潛力。RecA-介導(dǎo)的過(guò)程需要蛋白。原位雜交過(guò)程是基于下列原理胞內(nèi)雙鏈靶會(huì)局部打開(kāi)其雙鏈結(jié)構(gòu)，提供將依據(jù)常規(guī)雜交原理雜交的單鏈靶。據(jù)報(bào)道，依賴于Hoogstein型聚體的復(fù)合體受限于不是真正雜聚體的結(jié)構(gòu)。而是它們要求給定的鏈應(yīng)為多嘌呤或多嘧啶或與其很接近。參見(jiàn)，例如，F(xiàn)loris等，“陽(yáng)離子對(duì)嘌呤-嘌呤-嘧啶三重螺旋在混合價(jià)鹽溶液中形成的影響(Effect of cation on purine-purine-pyrimidine triple helix formation inmixed-valence salt solutions)”，260，Eur.J.Biochem.801-809(1988)。
如同與三鏈體核酸的情形一樣，有關(guān)四鏈體核酸的常規(guī)知識(shí)一直是這種特有的結(jié)構(gòu)僅存在于相對(duì)極端條件下，針對(duì)相對(duì)窄的核酸種類。具體而言，Sen等(Nature 334364-366(1988))公開(kāi)了富含鳥(niǎo)嘌呤的寡核苷酸在體外可自發(fā)自我裝配成四鏈螺旋。Sen等(Biochemistry 3165-70(1992))公開(kāi)了這些四鏈復(fù)合體可進(jìn)一步結(jié)合成由8、12或16寡聚體組成的超結(jié)構(gòu)。
Marsh等(Biochemistry 3310718-10724(1994)和Nucleic AcidsResearch 23696-700(1995))公開(kāi)了一些富含鳥(niǎo)嘌呤寡核苷酸也可以補(bǔ)償、平行比對(duì)的方式組裝，形成長(zhǎng)的“G-絲”。這些高級(jí)結(jié)構(gòu)由G-四聯(lián)體所穩(wěn)定，所述G-四聯(lián)體由四個(gè)在平面上排列并通過(guò)Hoogsteen堿基配對(duì)結(jié)合在一起的鳥(niǎo)嘌呤殘基組成。根據(jù)Sen等(Biochemistry 3165-70(1992))，寡聚體內(nèi)至少三個(gè)鄰近的鳥(niǎo)嘌呤對(duì)這些高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成是至關(guān)重要的。
已有提示四鏈DNA在各種生物過(guò)程中發(fā)揮作用，如抑制HIV-1整合酶(Mazumder等，Biochemistry 3513762-13771(1996)，在減數(shù)分裂過(guò)程中染色體結(jié)合的形成(Sen等，Nature 334364-366(1988))，以及端粒維持(Williamson等，Cell 59871-880(1989)；Baran等，NucleicAcids Research 25297-303(1997))。
另已有提示控制富含鳥(niǎo)嘌呤四鏈體的生產(chǎn)可能是控制這種生物過(guò)程的關(guān)鍵。例如，授予Hardin等的美國(guó)專利6,017,709提示端粒酶活性可通過(guò)抑制鳥(niǎo)嘌呤四聯(lián)體形成的藥物而得以控制。
授予Pitner等的美國(guó)專利5,888,739公開(kāi)了基于G-四聯(lián)體的四鏈體可在分析中用于檢測(cè)核酸。在與互補(bǔ)寡核苷酸雜交后，G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)解疊或線性化，由此增加供體和受體在不同部分的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)之間的距離，導(dǎo)致它們相互作用增加以及從結(jié)構(gòu)發(fā)出的信號(hào)(例如，熒光)可檢測(cè)發(fā)生變化。
授予Agrawal等的美國(guó)專利5,912,332公開(kāi)了合成寡核苷酸的純化方法，其中所述合成寡核苷酸特異性與期望的全長(zhǎng)寡核苷酸雜交，同時(shí)形成多聚體聚合體，如四鏈體DNA。多聚體聚合體含有待純化的寡核苷酸，然后利用大小排阻層析技術(shù)分離。
盡管有上述進(jìn)展，但是對(duì)四鏈體核酸的潛力既沒(méi)有充分地得到理解也沒(méi)有完全地加以開(kāi)發(fā)。
有關(guān)用雙鏈靶進(jìn)行雜交型試驗(yàn)的問(wèn)題在于檢測(cè)它們的方法。熒光染料數(shù)十年來(lái)一直用于檢測(cè)和定量核酸。以其最基本的形式，基于熒光強(qiáng)度的分析通常包括將靶與含熒光團(tuán)的探針接觸，從結(jié)合探針中除去任何未結(jié)合的探針，以及檢測(cè)清洗樣品中的熒光。在這種基本分析基礎(chǔ)上，勻相分析的改進(jìn)在于其不需要清洗步驟或者提供非液相支持物。
例如，授予Livak等的美國(guó)專利5,538,848和授予Maggio的美國(guó)專利4,220,450公開(kāi)了在溶液中利用寡核苷酸探針來(lái)基于勻相熒光分析核苷酸序列。然而，這些專利需要利用猝滅劑與支持劑組合，從而區(qū)分由雜交探針和未雜交探針?biāo)a(chǎn)生的信號(hào)。Livak等在其公開(kāi)方法中還需要利用酶。猝滅劑和酶給方法增添了復(fù)雜性和花費(fèi)。
授予Kidwell的美國(guó)專利5,332,659公開(kāi)了利用含有至少兩個(gè)熒光團(tuán)部分的探針檢測(cè)溶液中核苷酸序列的方法。熒光團(tuán)的選擇必須是當(dāng)相互之間足夠接近時(shí)可以電子上相互作用以改變它們波譜的波長(zhǎng)依賴性。未雜交探針比與靶序列雜交的探針更具柔性，結(jié)果，探針未雜交比探針雜交時(shí)，各探針上的兩個(gè)熒光團(tuán)部分更可能相互靠近。因此，與游離探針相關(guān)的輻射波長(zhǎng)的變化可作為樣品中游離探針量的指標(biāo)而加以監(jiān)控。
授予Wu等的美國(guó)專利5,846,729也公開(kāi)了基于勻相熒光的分析用于檢測(cè)核酸。
除了前述檢測(cè)熒光強(qiáng)度的進(jìn)展以外，一些文獻(xiàn)還極力稱贊熒光偏振分析的優(yōu)點(diǎn)。然而，基于偏振分析存在顯著的缺陷。偏振的變化程度作為結(jié)合的函數(shù)是不可預(yù)測(cè)的，以及對(duì)數(shù)據(jù)的解釋以使不一致數(shù)據(jù)符合理論預(yù)計(jì)，可能要求比分析方法中所期望的更多努力，尤其是當(dāng)所述方法務(wù)必自動(dòng)化時(shí)。還存在一些限制，來(lái)自其運(yùn)動(dòng)在熒光偏振分析中得以評(píng)估的分子的分子量。
本發(fā)明將會(huì)看到，在多種重要的實(shí)施方案中，為了檢測(cè)三鏈體和四鏈體而利用熒光分子的特性。
所有在此引用的文獻(xiàn)以其全文引作參考。
發(fā)明簡(jiǎn)述產(chǎn)生多鏈體的方法在一總的方面，本發(fā)明為一種產(chǎn)生核酸多鏈體的方法，所述方法包括下列步驟1)產(chǎn)生含有水、沃森-克里克雙鏈體、足夠數(shù)目的單鏈混合堿基序列分子的混合物以形成多鏈體，所述多鏈體包括沃森-克里克雙鏈體以及提高多鏈體形成速率或量的加速劑，所述多鏈體為三鏈體或四鏈體，其中一種或多種所述單鏈分子加以選擇，以致如果在多鏈體中，它們分別與多鏈體的其他所有鏈通過(guò)遵守堿基配對(duì)法則而相關(guān)，所述法則或者是沃森-克里克堿基配對(duì)法則或者是勻相結(jié)合堿基配對(duì)法則；以及2)將所述混合物溫育，以使多鏈體形成，所述多鏈體的各條鏈通過(guò)堿基配對(duì)法則與多鏈體的其他所有鏈相關(guān)；條件是，在多鏈體內(nèi)，步驟(1)中加入的沃森-克里克雙鏈體為G-C含量在10％和90％之間的雜多聚體。
在方法的一個(gè)特定方面，所產(chǎn)生的多鏈體為三鏈體，在步驟(1)中，單鏈分子的足夠數(shù)目為1，以及在步驟(2)中，形成三鏈體。在方法的特定實(shí)施方案中，在三鏈體中，單鏈分子通過(guò)沃森-克里克堿基配對(duì)法則與雙鏈體的一條鏈相關(guān)，并且通過(guò)同源結(jié)合堿基配對(duì)法則與雙鏈的第二條鏈相關(guān)。在另一特定的實(shí)施方案中，雙鏈體基本上保持其雙螺旋結(jié)構(gòu)，以及單鏈分子位于雙螺旋結(jié)構(gòu)的溝中。所有這種三鏈體也是本發(fā)明的方面。
在方法的另一特定方面，所產(chǎn)生的多鏈體為四鏈體，在步驟(1)中，沃森-克里克雙鏈體為第一沃森-克里克雙鏈體，以及在步驟(1)中，單鏈分子的足夠數(shù)目為2，這些單鏈分子在第二沃森-克里克雙鏈體中，以及在步驟(2)中，四鏈體從所述第一和第二雙鏈體中形成。優(yōu)選地，步驟(1)利用兩個(gè)已在第二沃森-克里克雙鏈體中的單鏈分子。
檢測(cè)三鏈體的方法通過(guò)加入其中三鏈體得以檢測(cè)的附加步驟(3)，產(chǎn)生三鏈體的方法可為適用于檢測(cè)三鏈體的方法。
檢測(cè)四鏈體的方法通過(guò)加入其中四鏈體得以檢測(cè)的附加步驟(3)，產(chǎn)生四鏈體的方法可為適用于檢測(cè)四鏈體的方法。
三鏈體在另一總的方面，本發(fā)明為三鏈體(三鏈體復(fù)合體)，其含有單鏈探針與雙鏈核酸靶結(jié)合，其中所述探針含有雜多聚體核酸或雜聚體核酸類似物，以及所述三鏈體的所有堿基三聯(lián)體選自A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和C-G-C。
四鏈體在另一方面，本發(fā)明為四鏈體的多鏈體結(jié)構(gòu)，所述四鏈體包括含有第一核堿基序列的第一條鏈；含有第二核堿基序列的第二條鏈，其中所述第二條鏈與所述第一條鏈通過(guò)沃森-克里克鍵結(jié)合；含有第三核堿基序列的第三條鏈；以及含有第四核堿基序列的第四條鏈，其中所述第四條鏈與所述第二條鏈和所述第三條鏈通過(guò)沃森-克里克鍵結(jié)合。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明將結(jié)合下列附圖描述，其中同樣的參考號(hào)指定同樣的元件，以及其中

圖1、2A和2B表示以溫度、GC含量以及堿基對(duì)匹配程度為函數(shù)的熒光強(qiáng)度。
圖3、4、5A、5B、5C和5D表示以波長(zhǎng)、堿基對(duì)匹配程度以及陽(yáng)離子為函數(shù)的熒光強(qiáng)度。
圖6A、6B和6C表示以激光發(fā)射規(guī)程和陽(yáng)離子為函數(shù)的熒光強(qiáng)度。
圖7A、7B、7C、8A、8B、9A、9B、9C和10表示以堿基對(duì)匹配程度和陽(yáng)離子為函數(shù)的四鏈體熒光強(qiáng)度。
圖11表示在含有乙醇的溶液中以堿基對(duì)匹配程度為函數(shù)的熒光強(qiáng)度。
圖12A、12B、12C和12D表示當(dāng)陽(yáng)離子DNA嵌入劑YOYO-1存在時(shí)以dsDNA:ssDNA復(fù)合體中完全堿基對(duì)匹配和不完全堿基對(duì)匹配的波長(zhǎng)為函數(shù)的熒光強(qiáng)度。
發(fā)明詳述術(shù)語(yǔ)及定義形成各自核苷酸部分的堿基的單字母代碼為A腺嘌呤；T胸腺嘧啶；G鳥(niǎo)嘌呤；C胞嘧啶；U鳥(niǎo)嘧啶。這些字母也用于代表它們各自的核苷酸。
雙鏈體的G-C含量為G-C堿基對(duì)的數(shù)除以G-C堿基對(duì)的數(shù)加上A-T(或A-U)的數(shù)的和再乘以100，以百分比表示(例如20％)。
加速劑在此理解成一種“增加所述三鏈體或四鏈體形成的速率或量”的試劑。速率可由少至兩個(gè)測(cè)定所獲得，各測(cè)定在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行。量是指三鏈體或四鏈體所形成的數(shù)。
術(shù)語(yǔ)“加速劑”與術(shù)語(yǔ)“促進(jìn)劑”交互使用。
術(shù)語(yǔ)核酸、三鏈體、四鏈體等意指包括能形成類似結(jié)構(gòu)如沃森-克里克雙鏈體的DNA、RNA及其類似物的分子，以及其中形成的三鏈體和四鏈體。
“核堿基”指堿基A、U、G、C、T及那些符合沃森-克里克堿基配對(duì)法則的類似物。
A、U、G、C和T的類似物是那些符合沃森-克里克堿基配對(duì)法則的類似物。
沃森-克里克雙鏈體是2-鏈分子或分子區(qū)段，其中兩條鏈?zhǔn)欠雌叫械?，它們?’→3’方向相反。雙鏈體的總體結(jié)構(gòu)為雙螺旋結(jié)構(gòu)。所述鏈通過(guò)氫鍵和疏水性相互作用而結(jié)合在一起。堿基對(duì)互補(bǔ)性為A與T通過(guò)兩個(gè)氫鍵配對(duì)(或者，在RNA的情形下，A與U配對(duì))，而G與C通過(guò)三個(gè)氫鍵配對(duì)。結(jié)果，堿基配對(duì)法則是A與T配對(duì)，A與U配對(duì)以及G與C配對(duì)。
3-鏈核酸分子不必是三鏈體，以及3-鏈分子的區(qū)段也不必為三鏈體。也許與一個(gè)以上的其他鏈結(jié)合的鏈沒(méi)有位于任何鏈內(nèi)的區(qū)域中。簡(jiǎn)單的例子為Y型分子，其中鏈1和2形成莖，鏈1和3形成左上枝，而鏈2形成單鏈右上枝。
三鏈體的實(shí)例為3-鏈核酸分子或分子區(qū)段，其中一條鏈(任意命名為鏈1)按照沃森-克里克堿基配對(duì)法則(A-T，A-U和G-C)既與鏈2又與鏈3配對(duì)。鏈1和2形成沃森-克里克雙鏈體或接近沃森-克里克雙鏈體的結(jié)構(gòu)。鏈3位于此雙鏈體的大溝中。這種三鏈體的一實(shí)例由V.B.Zhurkin等，J.Mol.Biol.，(1994)第239卷，第181-200頁(yè)(尤其參見(jiàn)該參考文獻(xiàn)的圖2)的詳細(xì)描述，此論文在此引作參考。作為這種三鏈體穩(wěn)定作用的部分，鏈3通過(guò)如下的堿基配對(duì)法則與其他兩條鏈鍵合鏈3上的A既與鏈1上的A配對(duì)又與鏈2上的T配對(duì)；鏈3上的G既與鏈1上的G配對(duì)又與鏈2上的C配對(duì)；鏈3上的C既與鏈1上的C配對(duì)又與鏈2上的G配對(duì)；以及鏈3上的T既與鏈1上的T配對(duì)又與鏈2上的A配對(duì)。
不管考慮Zhurkin模型的哪些變體(C或C+或C’，T或T’)，都滿足這些堿基配對(duì)法則。
術(shù)語(yǔ)“堿基配對(duì)法則”是當(dāng)一個(gè)核酸分子與另一核酸分子相互之間特異性結(jié)合時(shí)，限定這兩個(gè)核酸分子之間特異性的規(guī)則。實(shí)例是沃森-克里克堿基配對(duì)法則(G-C，和A-T或A-U)和同源結(jié)合堿基配對(duì)法則(A-A，T-T，G-G，C-C，U-U)。
雙鏈體的“解縮合”定義成雙鏈體的總螺旋重復(fù)長(zhǎng)度的增加。例如，雙鏈體的B構(gòu)象具有10個(gè)堿基對(duì)的總螺旋重復(fù)長(zhǎng)度；106°的解縮合導(dǎo)致重復(fù)長(zhǎng)度為13個(gè)堿基對(duì)。
PNA代表DNA和RNA的聚酰胺類似物(參見(jiàn)例如，授予Nielsen等的美國(guó)專利5,539,082)。
本發(fā)明的特定實(shí)施方案以及替代法如發(fā)明概述章節(jié)中所述的發(fā)明具有目的特異實(shí)施方案和優(yōu)選實(shí)施方案。這些實(shí)施方案通過(guò)本申請(qǐng)加以描述。然而，為方便起見(jiàn)，其中許多實(shí)施方案總結(jié)在此章節(jié)中。同樣，如發(fā)明概述章節(jié)中所述的發(fā)明可以替代方式來(lái)形容，表示本發(fā)明的一些變化而保留涉及主要發(fā)明的實(shí)質(zhì)重疊。本發(fā)明的這種替代法也包括在此章節(jié)中。
(A)制備多鏈體的方法三鏈體或四鏈體的形成方法一般描述在發(fā)明概述章節(jié)，可任選將一種或多種下列特征摻入到所述方法中來(lái)進(jìn)行在多鏈體中，步驟(1)中所加入的沃森-克里克雙鏈體為G-C含量介于25％和75％之間的雜多聚體；在多鏈體中，步驟(1)中所加入的沃森-克里克雙鏈體為G-C含量介于10％和90％之間的雜多聚體，以及其中嘌呤-嘧啶二聚體和嘧啶-嘌呤二聚體的組合頻率超過(guò)25％(二聚體的識(shí)別起始于序列的5’端并且每次行進(jìn)一個(gè)堿基，直到抵達(dá)3’端；例如，序列5’-AAAGGGT具有一個(gè)嘌呤-嘧啶二聚體(GT)以及沒(méi)有嘧啶-嘌呤二聚體-它們的組合頻率等于1/6)；利用細(xì)胞中沒(méi)有(和病毒中沒(méi)有)的核酸鏈和/或雙鏈體進(jìn)行步驟(1)和/或(2)在沒(méi)有蛋白(如recA或類似功能的蛋白)的幫助下進(jìn)行步驟(2)；在步驟(1)；添加水從而以體積計(jì)其占到混合物終體積的至少50％(更優(yōu)選至少80％的終體積，最優(yōu)選在步驟(1)中水是加入到混合物中的唯一液體)；在步驟(1)，不添加任何蛋白；在水溶液的冷凍溫度或高于此溫度并且不高于85℃(更優(yōu)選介于5-30℃，最優(yōu)選介于15-25℃)進(jìn)行步驟(2)；在步驟(1)，添加陰離子或更優(yōu)選陽(yáng)離子作為加速劑(單價(jià)、二價(jià)或多價(jià)；例如金屬陽(yáng)離子或陽(yáng)離子型肽)；其中所述陽(yáng)離子是選自下列成員的至少一種堿金屬陽(yáng)離子、堿土金屬陽(yáng)離子、過(guò)渡金屬陽(yáng)離子、Co(NH3)6+3、三價(jià)亞精胺和四價(jià)精胺；其中所述陽(yáng)離子為濃度50mM-125mM的Na+；其中所述陽(yáng)離子為選自濃度10mM-45mM的Mn+2、濃度10mM-45mM的Mg+2以及濃度20mM的Ni+2；在步驟(1)中添加嵌入劑作為加速劑(尤其是熒光嵌入劑；優(yōu)選為雙嵌入劑)；在步驟(1)中所述嵌入劑為選自下列成員的嵌入熒光團(tuán)YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3、TOTO-3、POPO-1、BOBO-1、POPO-3、BOBO-3、LOLO-1、JOJO-1、花菁二聚體、YO-PRO-1、TO-PRO-1、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5、PO-PRO-1、BO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-3、LO-PRO-1、JO-PRO-1、花菁單體、溴化乙錠、乙錠同型二聚體-1、乙錠同型二聚體-2、乙錠衍生物、吖啶、吖啶橙、吖啶衍生物、乙錠吖啶異型二聚體、單疊氮化乙錠、碘化丙錠、SYTO染料、SYBR綠1、SYBR染料、皮可綠(Pico Green)、SYTOX染料以及7-氨基放線菌素D；在步驟(1)，所述加速劑為非嵌入熒光團(tuán)(尤其為一種成員，選自生物素、若丹明、Alexa染料、BODIPY染料、生物素結(jié)合物、硫醇活性探針、熒光素和衍生物(包括“籠”型探針)、Oregon綠、若丹明綠、QSY染料))以及所述強(qiáng)度與三鏈體或四鏈體的形成反相關(guān)；在步驟(1)，所述加速劑束縛于所述第一條鏈、所述第二條鏈、所述第三條鏈以及所述第四條鏈中的至少一種；在步驟(1)，添加一種加速劑，其是與沃森-克里克雙鏈體的小溝(或者兩個(gè)沃森-克里克雙鏈體中的至少一種)結(jié)合的嵌入劑；在步驟(1)，添加在25℃為液體的加速劑(尤其是一種溶于水中的有機(jī)液體，如二甲基甲酰胺、乙醇和甘油)；在步驟(1)，添加一種以上的加速劑；
在步驟(1)，添加有關(guān)沃森-克里克雙鏈體的縮合劑或解縮合劑的加速劑；在步驟(1)，添加A、T、U、C或G的類似物的加速劑；在步驟(1)，添加選自凝集素和多糖的加速劑；在步驟(1)和(2)，用pH為約5-約9的緩沖劑處理混合物；在至少一個(gè)C-G-C或G-C-G堿基三聯(lián)體中的一個(gè)胞嘧啶為正電荷的；在各C-G-C和G-C-G堿基三聯(lián)體中的一個(gè)胞嘧啶為正電荷的；在步驟(2)，溫育時(shí)間不超過(guò)大約兩小時(shí)(更優(yōu)選不超過(guò)1小時(shí)；以及在任一時(shí)間內(nèi)，優(yōu)選至少25％，更優(yōu)選至少50％的可能的多鏈體已經(jīng)形成)；所述至少一種加速劑是小溝核酸結(jié)合分子，其以非嵌入方式結(jié)合并且以至少103M-1的締合常數(shù)結(jié)合；其中多鏈體為部分電路。(或者，本發(fā)明為包含多鏈體結(jié)構(gòu)的電路。)對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，上述特定條件也適用于下列制備四鏈體的方法將是一目了然的。
以其他表達(dá)形式，形成四鏈體的方法包括(1)提供雜交介質(zhì)，所述介質(zhì)含有第一條鏈、第二條鏈、第三條鏈、第四條鏈、水、緩沖液以及至少一種加速劑；以及(2)溫育所述雜交介質(zhì)一段時(shí)間，其足以使所述第二條鏈與所述第四條鏈雜交從而提供所述多鏈體結(jié)構(gòu)，其中所述多鏈體結(jié)構(gòu)包括含有第一核堿基序列的第一條鏈；含有第二核堿基序列的第二條鏈，其中所述第二條鏈與所述第一條鏈通過(guò)沃森-克里克鍵結(jié)合；含有第三核堿基序列的第三條鏈；含有第四核堿基序列的第四條鏈，其中所述第四條鏈與所述第二條鏈和所述第三條鏈通過(guò)沃森-克里克鍵結(jié)合。
在形成四鏈體方法的特定實(shí)施方案中，下列特征單獨(dú)或組合使用(下列描述利用制備四鏈體方法的術(shù)語(yǔ)，規(guī)定了四條單獨(dú)的鏈，但它們也適用于將沃森-克里克雙鏈體規(guī)定為起始材料中的一種或兩種的方法)所述第一條鏈和所述第二條鏈中的至少一條進(jìn)一步含有藥劑，并且所述第二條鏈與所述第四條鏈的雜交將所述藥劑放置在所述第三條鏈、所述第四條鏈上或者與所述第三條鏈和所述第四條鏈中的至少一條結(jié)合的另一分子上的靶的有效距離內(nèi)；所述藥劑選自預(yù)定結(jié)合臨床上相關(guān)基因的基因啟動(dòng)子序列的核酸，預(yù)定結(jié)合臨床上相關(guān)基因的核酸以及預(yù)定結(jié)合病原體復(fù)制子位點(diǎn)的核酸；所述第三條鏈和所述第四條鏈在所述第一條鏈和所述第二條鏈之前提供在所述雜交介質(zhì)中，以及所述第一條鏈和所述第二條鏈在通過(guò)與所述雜交介質(zhì)接觸再水合之前以脫水形式提供；所述第一條鏈和所述第二條鏈中的至少一條用非嵌入熒光團(tuán)進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記，以及所述強(qiáng)度與所述結(jié)合親和力反相關(guān)；至少一種加速劑為嵌入熒光團(tuán)，以及含有所述多鏈體結(jié)構(gòu)的檢測(cè)介質(zhì)中的熒光強(qiáng)度與所述第二條鏈對(duì)所述第四條鏈的結(jié)合親和力正相關(guān)；所述第二條鏈與所述第四條鏈雜交，其檢測(cè)為熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光或電子信號(hào)的變化；所述信號(hào)的強(qiáng)度與所述第二條鏈和所述第四條鏈之間的結(jié)合親和力相關(guān)；所述第二條鏈和所述第四條鏈的雜交使得與所述第三條鏈和所述第四條鏈中的至少一條有關(guān)的活性失活。
(B)檢測(cè)三鏈體的方法檢測(cè)三鏈體的方法一般描述在發(fā)明概述章節(jié)中，可任選通過(guò)將一種或多種下列特征摻入到所述方法中來(lái)進(jìn)行
以勻相分析實(shí)施所述方法，以便在步驟(3)過(guò)程中或之前，將不含部分三鏈體的單鏈分子置于器皿或容器中，與含有三鏈體的分開(kāi)；利用檢測(cè)方法來(lái)區(qū)分完全堿基配對(duì)法則匹配、單堿基錯(cuò)配(或缺失)以及2-堿基錯(cuò)配(或缺失)，區(qū)分雙鏈體和三鏈體中的單鏈分子(所述方法優(yōu)選包括用含有已知錯(cuò)配的分子校正該方法)；利用嵌入劑結(jié)合的程度(例如由熒光增加所指示)作為三鏈體形成的標(biāo)示；以此，所述嵌入熒光團(tuán)所發(fā)熒光的波長(zhǎng)在嵌合后位移到第二波長(zhǎng)處，所述波長(zhǎng)和所述第二波長(zhǎng)之間的差異表明所述探針和所述靶之間的復(fù)合體是否是雙鏈體或三鏈體以及所述靶是否是DNA或RNA；探針用非嵌入熒光團(tuán)共價(jià)標(biāo)記，以及所述強(qiáng)度與所述結(jié)合親和力反相關(guān)(尤其其中所述非嵌入熒光團(tuán)選自生物素、若丹明和熒光素)；利用熒光團(tuán)標(biāo)記的單鏈分子作為單鏈分子；方法為勻相分析，其進(jìn)行無(wú)需在所述靶序列(即在雙鏈體中)或所述探針(即單鏈分子)上提供信號(hào)猝滅劑，和/或無(wú)需事先將所述靶序列變性和/或無(wú)需將所述靶序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述方法為勻相分析，其進(jìn)行無(wú)需在所述靶序列或所述探針上提供信號(hào)猝滅劑；探針具有部分帶電荷或未帶電荷的主鏈；探針包含PNA序列和/或是由平行合成制備的ssPNA；探針和所述靶序列是同樣長(zhǎng)度；探針的長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸；熒光激發(fā)輻射是從氬離子激光器以波長(zhǎng)約200nm到約1000nm發(fā)射出的；測(cè)試樣品的體積為約20μl，含有約10飛摩爾(fmol)的靶序列和約10飛摩爾的探針；所述樣品中靶序列的濃度不超過(guò)5×10-10M；樣品中探針的濃度不超過(guò)5×10-10M；方法在生物芯片上進(jìn)行；將嵌入熒光團(tuán)以不含所述探針和不含所述靶序列的形式加入到介質(zhì)中；嵌入熒光團(tuán)選自YOYO-1、TOTO-1、溴化乙錠、乙錠同型二聚體-1、乙錠同型二聚體-2和吖啶。
在其他表達(dá)方面，本發(fā)明為檢測(cè)方法，其包括提供靶雙鏈核酸或含有靶序列的核酸類似物，其中所述靶序列含有至少一個(gè)嘌呤堿基以及至少一個(gè)嘧啶堿基；提供含有核酸序列或核酸類似物序列的探針；提供加速劑；向介質(zhì)中加入所述探針、所述靶序列和所述加速劑以提供含有三鏈體復(fù)合體的測(cè)試樣品，所述復(fù)合體含有結(jié)合到所述靶序列上的所述探針，其中所述復(fù)合體的所有堿基三聯(lián)體選自A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和C-G-C；用激發(fā)輻射照射所述測(cè)試樣品以使測(cè)試樣品發(fā)射熒光輻射；檢測(cè)所述熒光輻射的強(qiáng)度，其中所述強(qiáng)度與所述探針和所述靶序列之間的結(jié)合親和力相關(guān)；以及從所述強(qiáng)度中確定所述探針和所述靶序列之間的匹配程度。
在另一其他表達(dá)的相關(guān)方面，所述方法包括提供靶核酸或含有靶序列的核酸類似物，其中所述靶序列含有至少一個(gè)嘌呤堿基以及至少一個(gè)嘧啶堿基；提供含有核酸序列或核酸類似物序列的雙鏈探針；提供雜交加速劑；向介質(zhì)中加入所述探針、所述靶和所述雜交加速劑以提供含有沃森-克里克三鏈體的測(cè)試樣品，所述三鏈體含有結(jié)合到所述靶序列上的所述探針；用激發(fā)輻射照射所述測(cè)試樣品以使測(cè)試樣品發(fā)射熒光輻射；檢測(cè)所述熒光輻射的強(qiáng)度，其中所述強(qiáng)度與所述探針和所述靶序列之間的結(jié)合親和力相關(guān)；以及從所述強(qiáng)度中確定所述探針和所述靶序列之間的匹配程度；
其中所述方法為勻相分析，其進(jìn)行無(wú)需在所述靶序列或所述探針上提供信號(hào)猝滅劑。
(C)檢測(cè)四鏈體的方法檢測(cè)四鏈體的方法一般描述在發(fā)明概述章節(jié)中，可任選通過(guò)將一種或多種下列特征摻入到所述方法中來(lái)進(jìn)行以勻相分析實(shí)施所述方法，以便在步驟(3)過(guò)程中或之前，將不含部分四鏈體的核酸分子置于器皿或容器中，與含有四鏈體的核酸分子分開(kāi)；方法為勻相分析，其進(jìn)行無(wú)需在所述靶序列或所述探針(即第二沃森-克里克雙鏈體)上提供信號(hào)猝滅劑，和/或無(wú)需事先將所述靶序列變性和/或無(wú)需將所述靶序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增；利用檢測(cè)方法來(lái)區(qū)分完全堿基配對(duì)法則匹配、單堿基錯(cuò)配(或缺失)以及2-堿基錯(cuò)配(或缺失)，區(qū)分第一和第二沃森-克里克雙鏈體(優(yōu)選采用含有已知錯(cuò)配的分子校正所述方法)；利用嵌入劑結(jié)合的程度作為四鏈體形成的標(biāo)志(尤其通過(guò)利用熒光嵌入劑和利用熒光增加作為指示劑)；將嵌入熒光團(tuán)以不含所述探針和不含所述靶序列的形式加入到介質(zhì)中；嵌入熒光團(tuán)選自YOYO-1、TOTO-1、溴化乙錠、乙錠同型二聚體-1、乙錠同型二聚體-2和吖啶；所述嵌入熒光團(tuán)所發(fā)熒光的波長(zhǎng)在嵌合后位移到第二波長(zhǎng)處，所述波長(zhǎng)和所述第二波長(zhǎng)之間的差異表明所述探針和所述靶之間的復(fù)合體是否是雙鏈體或三鏈體以及所述靶是否是DNA或RNA；探針用非嵌入熒光團(tuán)共價(jià)標(biāo)記，以及所述強(qiáng)度與所述結(jié)合親和力反相關(guān)(尤其其中所述非嵌入熒光團(tuán)選自生物素、若丹明和熒光素)；利用熒光團(tuán)標(biāo)記的單鏈分子作為部分第二沃森-克里克雙鏈體；方法進(jìn)一步含有對(duì)結(jié)合親和力進(jìn)行定量；探針具有部分帶電荷或未帶電的主鏈；探針包含PNA序列和/或是由平行合成制備的ssPNA；
探針和所述靶序列是同樣長(zhǎng)度；探針的長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸(堿基對(duì))；熒光激發(fā)輻射是從氬離子激光器以波長(zhǎng)約200nm到約1000nm發(fā)射出的；測(cè)試樣品的體積為約20μl，含有約10飛摩爾的靶序列和約10飛摩爾的探針；所述樣品中靶序列的濃度不超過(guò)5×10-10M；樣品中探針的濃度不超過(guò)5×10-10M；所述第一條鏈和所述第二條鏈與所述第三條鏈和所述第四條鏈的比為約10∶1；所述第一條鏈、所述第二條鏈、所述第三條鏈和所述第四條鏈的濃度分別不超過(guò)5×10-10M；方法在生物芯片上進(jìn)行。
在其他表達(dá)的相關(guān)方面，所述方法包括提供靶核酸或含有靶序列的核酸類似物，其中所述靶序列含有至少一個(gè)嘌呤堿基以及至少一個(gè)嘧啶堿基；提供含有核酸序列或核酸類似物序列的雙鏈探針；提供雜交加速劑；向介質(zhì)中加入所述探針、所述靶和所述雜交加速劑以提供含有沃森-克里克四鏈體的測(cè)試樣品，所述四鏈體含有結(jié)合到所述靶序列上的所述探針；用激發(fā)輻射照射所述測(cè)試樣品以使測(cè)試樣品發(fā)射熒光輻射；檢測(cè)所述熒光輻射的強(qiáng)度，其中所述強(qiáng)度與所述探針和所述靶序列之間的結(jié)合親和力相關(guān)；以及從所述強(qiáng)度中確定所述探針和所述靶序列之間的匹配程度；其中所述方法為勻相分析，其進(jìn)行無(wú)需在所述靶序列或所述探針上提供信號(hào)猝滅劑。
(D)三鏈體三鏈體一般描述在發(fā)明概述章節(jié)中，可任選具有一種或多種下列特征各條鏈為G-C含量介于25％-75％之間的雜多聚體；各條鏈為G-C含量介于10％-90％之間的雜多聚體，以及其中嘌呤-嘧啶二聚體和嘧啶-嘌呤二聚體的組合頻率超過(guò)25％；其不在細(xì)胞中(以及不在病毒中)；其在pH大于7.6(但小于pH9)時(shí)穩(wěn)定；其在pH大于7.6(以及優(yōu)選小于pH9)的介質(zhì)中；單鏈核酸或核酸類似物的長(zhǎng)度為5-30個(gè)堿基，以及雙鏈核酸靶的長(zhǎng)度為8-3.3×109個(gè)堿基對(duì)；靶序列為雜多聚體，并以任何順序含有25％-75％的嘌呤堿基以及75％-25％的嘧啶堿基(優(yōu)選其中嘌呤-嘧啶二聚體的頻率加上嘧啶-嘌呤二聚體的頻率超過(guò)25％)；探針(即單鏈分子)與雙鏈核酸切割劑共價(jià)結(jié)合；探針與化療劑共價(jià)結(jié)合；探針與標(biāo)記共價(jià)結(jié)合(例如多分子信號(hào)復(fù)合體、氧還對(duì)、化學(xué)發(fā)光劑、電化學(xué)發(fā)光劑，或在優(yōu)選實(shí)施方案中為熒光團(tuán)，在復(fù)合體的熒光強(qiáng)度與探針和靶序列之間的結(jié)合親和力相關(guān)的情形下尤其如此)；單鏈核酸分子的堿基配對(duì)法則涉及雙鏈體的一條鏈，為沃森-克里克堿基配對(duì)法則G-C和A-T或A-U，以及涉及雙鏈體的另一條鏈為A-A和T-T或U-U；雙鏈體基本上維持其沃森-克里克雙螺旋結(jié)構(gòu)，以及單鏈分子位于雙螺旋的溝中；加速劑在部分雙鏈體和部分單鏈核酸分子之間形成鍵；加速劑共價(jià)連接到單鏈核酸分子上；沃森-克里克雙鏈體的兩條鏈為DNA(特別是其中三鏈體的所有鏈為DNA)；加速劑與沃森-克里克雙鏈體中的堿基結(jié)合，所述堿基不是一種與單鏈核酸分子中的堿基結(jié)合的堿基；加速劑與沃森-克里克雙鏈體中的堿基結(jié)合，所述堿基為一種三鏈體中的堿基；加速劑與沃森-克里克雙鏈體的磷酸骨架結(jié)合；加速劑與沃森-克里克雙鏈體上的一種以上的位點(diǎn)、堿基上的各位點(diǎn)或所述雙鏈體的磷酸骨架上的位置結(jié)合；加速劑與沃森-克里克雙鏈體上的一個(gè)位點(diǎn)、堿基或所述雙鏈體磷酸骨架上的所述位點(diǎn)結(jié)合；加速劑與沃森-克里克雙鏈體中的堿基結(jié)合以及與單鏈核酸分子中的堿基結(jié)合；加速劑與單鏈核酸分子中的堿基結(jié)合。
(E)四鏈體四鏈體一般描述在發(fā)明概述章節(jié)中，可任選具有一種或多種下列特征所述四條鏈分別為G-C含量介于10％-90％之間的雜多聚體；第二和第四條鏈以平行3’到5’的方向排列，并且這2條鏈之間根據(jù)同源堿基配對(duì)法則結(jié)合；第一和第三條鏈以平行5’到3’的方向排列，并且這2條鏈之間根據(jù)同源堿基配對(duì)法則結(jié)合；第二和第四條鏈以平行3’到5’的方向排列，并且所述第二和第四條鏈之間根據(jù)同源堿基配對(duì)法則結(jié)合，以及第一和第三條鏈以平行5’到3’的方向排列，并且所述第一和第三條鏈之間根據(jù)同源堿基配對(duì)法則結(jié)合；第二和第四條鏈以平行3’到5’的方向排列，并且這2條鏈之間根據(jù)沃森-克里克堿基配對(duì)法則結(jié)合；第一和第三條鏈以平行5’到3’的方向排列，并且這2條鏈之間根據(jù)沃森-克里克堿基配對(duì)法則結(jié)合；第二和第四條鏈以平行3’到5’的方向排列，并且所述第二和第四條鏈之間根據(jù)沃森-克里克堿基配對(duì)法則結(jié)合，以及第一和第三條鏈以平行5’到3’的方向排列，并且所述第一和第三條鏈之間根據(jù)沃森-克里克堿基配對(duì)法則結(jié)合；
第一和第四條鏈分別以反平行5’到3’和3’到5’的方向排列，并且這2條鏈之間根據(jù)沃森-克里克堿基配對(duì)法則結(jié)合；第二和第三條鏈分別以反平行3’到5’和5’到3’的方向排列，并且這2條鏈之間根據(jù)沃森-克里克堿基配對(duì)法則結(jié)合；第一和第四條鏈分別以反平行5’到3’和3’到5’的方向排列，并且所述第一和第四條鏈之間根據(jù)沃森-克里克堿基配對(duì)法則結(jié)合，以及第二和第三條鏈分別以反平行3’到5’和5’到3’的方向排列，并且所述第二和第三條鏈之間根據(jù)沃森-克里克堿基配對(duì)法則結(jié)合；第一和第四條鏈分別以反平行5’到3’和3’到5’的方向排列，并且這2條鏈之間根據(jù)同源堿基配對(duì)法則結(jié)合；第二和第三條鏈分別以反平行3’到5’和5’到3’的方向排列，并且這2條鏈之間根據(jù)同源堿基配對(duì)法則結(jié)合；第一和第四條鏈分別以反平行5’到3’和3’到5’的方向排列，并且所述第一和第四條鏈之間根據(jù)同源堿基配對(duì)法則結(jié)合，以及第二和第三條鏈分別以反平行3’到5’和5’到3’的方向排列，并且所述第二和第三條鏈之間根據(jù)同源堿基配對(duì)法則結(jié)合；所述第一條鏈的各個(gè)互作堿基既與所述第三條鏈上的相鄰堿基又與所述第四條鏈上的堿基特異性相互作用，所述第四條鏈上的堿基是與所述第三條鏈堿基結(jié)合的堿基；所述第二條鏈的各個(gè)互作堿基既與所述第四條鏈上的相鄰堿基又與所述第三條鏈上的堿基特異性相互作用，所述第三條鏈上的堿基是與所述第四條鏈堿基結(jié)合的堿基；其是分離、純化、人工或合成的四鏈體；各條鏈為G-C含量介于25％-75％之間的雜多聚體；各條鏈為G-C含量介于10％-90％之間的雜多聚體，以及其中嘌呤-嘧啶二聚體和嘧啶-嘌呤二聚體的組合頻率超過(guò)25％；其不在細(xì)胞中(以及不在病毒中)；所述鏈各自獨(dú)立地包括雜聚體核酸或雜多聚體核酸類似物；所述鏈各自獨(dú)立地包括DNA或RNA；所述鏈各自獨(dú)立地包括含有未帶電荷或部分帶電荷的主鏈的雜多聚體核酸類似物；所述第二條鏈或所述第四條鏈之一包括DNA，而所述第二條鏈或所述第四條鏈的另一條包括RNA、mRNA、hnRNA、rRNA、tRNA或cDNA；所述第二條鏈和所述第四條鏈相互平行同源；將所述第一條鏈和所述第二條鏈的大溝置于所述第三條鏈和第四條鏈的小溝中；所述第二條鏈和所述第四條鏈相互平行互補(bǔ)；將所述第一條鏈和所述第二條鏈的大溝置于所述第三條鏈和第四條鏈的小溝中；各個(gè)核堿基與不超過(guò)其他兩個(gè)核堿基結(jié)合；沒(méi)有鏈與另一條鏈相鄰；多鏈體結(jié)構(gòu)基本上不含有Hoogsteen鍵合；多鏈體結(jié)構(gòu)基本上不含有G-G四聯(lián)體；第一條鏈和所述第二條鏈的長(zhǎng)度為5-50個(gè)堿基對(duì)；第三條鏈和所述第四條鏈為基因組DNA；第三條鏈和所述第四條鏈包括基因組DNA中的單元型；第三條鏈和第四條鏈為PCR擴(kuò)增產(chǎn)品；其中所述多鏈體結(jié)構(gòu)不含有固相支持物；多鏈體結(jié)構(gòu)與固相支持物結(jié)合(其中固相支持物或是導(dǎo)電性的或不是導(dǎo)電性的)；其中多鏈體結(jié)構(gòu)進(jìn)一步包括與所述第一條鏈、所述第二條鏈、所述第三條鏈和所述第四條鏈中的至少一條結(jié)合治療劑、預(yù)防劑或診斷劑；其中第一條鏈和所述第二條鏈的長(zhǎng)度各為5-30個(gè)堿基，以及所述第三條鏈和所述第四條鏈的長(zhǎng)度各為8-3.3×109個(gè)堿基對(duì)；其中第四條序列以任何順序含有25％-75％的嘌呤堿基和75％-25％的嘧啶堿基(優(yōu)選其中嘌呤-嘧啶二聚體的頻率加上嘧啶-嘌呤二聚體的頻率超過(guò)25％)；第一和第二沃森-克里克雙鏈體(參見(jiàn)發(fā)明概述章節(jié)中的四鏈體的制備方法)分別具有介于30-70％的G-C含量；第一沃森-克里克雙鏈體中的兩條鏈為DNA(特別是其中四鏈體的所有鏈為DNA)；加速劑與第一沃森-克里克雙鏈體中的堿基結(jié)合，所述堿基為一種與第二雙鏈體中的堿基結(jié)合的堿基；加速劑與第一或第二沃森-克里克雙鏈體中的堿基結(jié)合，所述堿基不是部分四鏈體；加速劑與第一或第二沃森-克里克雙鏈體中的磷酸骨架結(jié)合；加速劑與第一或第二沃森-克里克雙鏈體上的一個(gè)以上的位點(diǎn)、堿基或磷酸骨架上的各個(gè)位點(diǎn)結(jié)合；加速劑與沃森-克里克雙鏈體上的一個(gè)位點(diǎn)、堿基或磷酸骨架上的所述位點(diǎn)結(jié)合；加速劑與第一沃森-克里克雙鏈體中的堿基結(jié)合以及與第二沃森-克里克雙鏈體中的堿基結(jié)合；加速劑與第一和/或第二沃森-克里克雙鏈體的小溝結(jié)合；加速劑在部分第一沃森-克里克雙鏈體和部分第二沃森-克里克雙鏈體之間形成鍵。
發(fā)明的其他方面本發(fā)明提供三鏈體復(fù)合體，其包括與雙鏈核酸靶結(jié)合的單鏈探針，其中所述探針含有雜多聚體核酸或雜多聚體核酸類似物，以及所述復(fù)合體的所有堿基三聯(lián)體選自A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和C-G-C。
與現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)的某些Hoogsteen三鏈體不同，本發(fā)明的三鏈體在pH值高于7.6時(shí)仍是穩(wěn)定的。此外，本發(fā)明三鏈體不需要如某些現(xiàn)有技術(shù)三鏈體中存在的同型嘧啶序列或同型嘌呤序列。例如，靶序列可以任何順序含有25％-75％的嘌呤堿基和75％-25％的嘧啶堿基。
優(yōu)選地，三鏈體的單鏈核酸或核酸類似物的長(zhǎng)度為5-30個(gè)堿基以及雙鏈核酸靶的長(zhǎng)度為8-3.3×109個(gè)堿基對(duì)。
根據(jù)本發(fā)明的三鏈體形成適用于各種應(yīng)用。例如，與雙鏈核酸切割劑共價(jià)結(jié)合的探針可用于特異性切割雙鏈核酸的靶序列。與化療劑共價(jià)結(jié)合的探針可用于特異性處理雙鏈核酸的靶序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供快速、靈敏、環(huán)保和安全的方法，用于分析雙鏈靶和單鏈探針之間的結(jié)合，其中靶包括核酸序列或核酸類似物序列以及探針包括核酸序列或核酸類似物序列。
與某些現(xiàn)有技術(shù)分析不同，本發(fā)明不僅檢測(cè)特異探針-靶結(jié)合的存在，而且提供有關(guān)探針和靶之間相互作用本質(zhì)的定性和定量信息。因此，本發(fā)明使操作者能夠區(qū)分在探針和雙鏈靶的鏈中的堿基序列之間出現(xiàn)的完全匹配、一個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配、兩個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配、三個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配、一個(gè)堿基對(duì)缺失、兩個(gè)堿基對(duì)缺失和三個(gè)堿基對(duì)缺失。
本發(fā)明的實(shí)施方案包括根據(jù)其他探針與相同靶結(jié)合后所顯示的同樣類型的信號(hào)來(lái)校正第一探針-靶混合物的測(cè)定信號(hào)(例如熒光強(qiáng)度)，其中其他探針各自與第一探針有至少一個(gè)堿基的區(qū)分。
形成校正曲線，其中測(cè)定信號(hào)(例如熒光強(qiáng)度)的大小是靶和探針之間結(jié)合親和力的函數(shù)。由于靶和多個(gè)不同探針之間的結(jié)合親和力隨著錯(cuò)配堿基數(shù)、錯(cuò)配的性質(zhì)(A-G對(duì)A-C對(duì)T-G對(duì)T-C等)、三鏈體內(nèi)錯(cuò)配位置等而變化，因此本發(fā)明的分析可用于測(cè)定靶的序列。
在實(shí)施方案中，所測(cè)定的信號(hào)可以是測(cè)試樣品中所含熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度。在這樣的實(shí)施方案中，探針和靶之間的結(jié)合親和力可以與強(qiáng)度正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，這依賴于熒光團(tuán)是否通過(guò)信號(hào)猝滅或信號(hào)放大對(duì)雜交發(fā)信號(hào)。在選擇的條件下，由嵌入劑所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度可以與探針-靶結(jié)合親和力正相關(guān)，而在利用非嵌入熒光團(tuán)共價(jià)結(jié)合探針的優(yōu)選實(shí)施方案中，強(qiáng)度可以與探針-靶結(jié)合親和力反相關(guān)。隨著探針和靶之間的匹配程度增加，優(yōu)選包括0-2個(gè)錯(cuò)配和/或缺失的范圍內(nèi)，更優(yōu)選包括0-3個(gè)錯(cuò)配和/或缺失的范圍內(nèi)，非嵌入熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度降低。
本發(fā)明能夠定量探針和靶之間的結(jié)合親和力。這種信息對(duì)各種用途是有價(jià)值的，包括設(shè)計(jì)具有優(yōu)化結(jié)合特征的反義藥物。
與現(xiàn)有技術(shù)方法不同，本發(fā)明分析優(yōu)選是勻相的。該分析的進(jìn)行無(wú)需在檢測(cè)測(cè)定信號(hào)大小之前從游離探針和靶中分離出探針-靶復(fù)合體。該分析也無(wú)需凝膠分離步驟，由此使得測(cè)試通量大幅提高。定量分析簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確。結(jié)果，結(jié)合分析節(jié)省大量時(shí)間和花費(fèi)，并且可容易加以自動(dòng)化。另外，其還使得結(jié)合變量快速確定，這些變量如緩沖液、pH、離子濃度、溫度、溫育時(shí)間、探針和靶序列的相對(duì)濃度、嵌入劑濃度、靶序列長(zhǎng)度、探針序列長(zhǎng)度以及可能的必要輔助因子。
分析可在例如不可滲透表面或生物芯片上的孔內(nèi)的溶液中進(jìn)行。
此外，本發(fā)明分析的進(jìn)行優(yōu)選無(wú)需在靶或探針上提供信號(hào)猝滅劑。
盡管本發(fā)明人事先已公開(kāi)了熒光強(qiáng)度分析雜交的優(yōu)點(diǎn)(參見(jiàn)例如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?9/224,505，1998年12月31日提交)，但是根據(jù)本發(fā)明的分析特異性檢測(cè)探針和雙鏈靶的三鏈體，由此排除使靶變性的需要。當(dāng)核酸(和核酸類似物)探針已知與某些有限種類的靶形成三鏈體時(shí)(參見(jiàn)例如Floris等，同上，Dervan等，同上，Egholm等，365 Nature566(1993)，以及Tomac等，118 J.Am.Chem.Soc.5544(1996))，令人驚異的是本發(fā)明人已經(jīng)能夠特異性分析單鏈核酸(例如ssDNA和RNA)探針和雙鏈核酸(例如dsDNA)靶之間形成的三鏈體，其中探針和靶之間的相互作用是基于沃森-克里克堿基配對(duì)(至少在A結(jié)合T(或U，在RNA的情形下)以及G結(jié)合C的意義上)，而非很有限的例如Dervan等的三鏈體雜交的Hoogsteen模型。在此使用的術(shù)語(yǔ)“沃森-克里克三鏈體”通過(guò)將單鏈探針和雙鏈靶之間的堿基配對(duì)的性質(zhì)限制于A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和/或C-G-C(包括C+-G-C，和/或任何其他堿基的離子化物種)旨在明確這些差異。這些三員組下文表示沃森-克里克堿基三聯(lián)體，并且所得的結(jié)構(gòu)表示沃森-克里克三鏈體。
用于本發(fā)明分析的適當(dāng)?shù)奶结槹ɡ鐂sDNA、RNA、PNA和其他不帶電荷或部分帶電荷的主鏈的核酸類似物。優(yōu)選任意長(zhǎng)度為8-20個(gè)堿基的探針序列，因?yàn)檫@是原核生物和真核生物中所發(fā)現(xiàn)的最小的獨(dú)特DNA序列的范圍。特別優(yōu)選探針為12-18個(gè)堿基，因?yàn)檫@是人基因組中獨(dú)特序列的最小長(zhǎng)度。在實(shí)施方案中，5-30個(gè)堿基的探針是最優(yōu)選的。然而，多個(gè)較短探針可用來(lái)檢測(cè)其中具有多個(gè)非獨(dú)特靶序列的核苷酸序列，它們結(jié)合以獨(dú)特地識(shí)別核苷酸序列。探針長(zhǎng)度可加以選擇來(lái)匹配靶的長(zhǎng)度。
本發(fā)明人能夠特異性分析各種在單鏈核酸(例如ssDNA、RNA、ssPNA和其他DNA或RNA的類似物)探針和雙鏈核酸(例如dsDNA)靶之間以沃森-克里克堿基對(duì)依賴方式形成的三鏈體，他們已發(fā)現(xiàn)了這個(gè)意外的進(jìn)展。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)三鏈體形成和/或穩(wěn)定由在測(cè)樣品中含有嵌入劑而得以增強(qiáng)。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)沃森-克里克三鏈體形成和/或穩(wěn)定由在測(cè)樣品中含有陽(yáng)離子而得以增強(qiáng)。合適的陽(yáng)離子包括例如，單價(jià)陽(yáng)離子，如Na+(優(yōu)選濃度為50-125mM)，K+及其他堿金屬離子；二價(jià)陽(yáng)離子，如堿土金屬離子(例如Mg+2和Ca+2)和二價(jià)過(guò)渡金屬離子(例如Mn+2、Ni+2、Cd+2、Co+2和Zn+2)；以及正電荷至少為3的陽(yáng)離子，如Co(NH3)6+3，三價(jià)亞精胺和四價(jià)精胺。Mn+2優(yōu)選以10-30mM的濃度提供。Mg+2優(yōu)選以15-20mM的濃度提供。Ni+2優(yōu)選以約20mM的濃度提供。在實(shí)施方案中，Mg+2和Mn+2組合各自分別以10mM、15mM或20mM(即各為10-20mM)的濃度提供。
陽(yáng)離子向形成三鏈體的介質(zhì)中所加入的量依賴于許多因素，包括陽(yáng)離子的性質(zhì)、探針濃度、靶濃度、其他陽(yáng)離子的存在以及探針和靶的堿基含量。優(yōu)選的陽(yáng)離子濃度和混合物可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)而發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明不要求采用放射性探針，其使用是危險(xiǎn)、煩瑣和耗時(shí)的，并且需要不斷地再生。本發(fā)明的探針優(yōu)選使用安全，并且常年穩(wěn)定。因此，探針可以大量制備或預(yù)訂和儲(chǔ)存。
在實(shí)施方案中，探針標(biāo)記有多分子信號(hào)復(fù)合體或氧化對(duì)，或者標(biāo)記有引發(fā)化學(xué)發(fā)光或電化學(xué)發(fā)光特性的標(biāo)記物。
優(yōu)選地，探針或靶(優(yōu)選探針)具有與其共價(jià)結(jié)合的熒光標(biāo)記。該標(biāo)記優(yōu)選地是非嵌入熒光團(tuán)。在這樣的實(shí)施方案中，熒光團(tuán)優(yōu)選地在任意末端與探針結(jié)合。優(yōu)選的熒光標(biāo)記包括生物素、若丹明和熒光素，和其它當(dāng)用激發(fā)能照射時(shí)發(fā)熒光的標(biāo)記。
選擇激發(fā)波長(zhǎng)(通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)和/或常識(shí))，以對(duì)應(yīng)于在用熒光團(tuán)的激發(fā)最大值，優(yōu)選地是200-1000nm。優(yōu)先選擇熒光團(tuán)具有200-1000nm的輻射波長(zhǎng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氬離子激光器用來(lái)照射熒光團(tuán)，光的波長(zhǎng)范圍是400-540nm，并在500-750nm的范圍內(nèi)檢測(cè)熒光輻射。
本發(fā)明分析可以在各種溫度下進(jìn)行，如5-85℃。現(xiàn)有技術(shù)的某些分析需要提高的溫度、增加成本和延遲測(cè)定。另一方面，本發(fā)明在室溫或低于室溫(例如低于25℃)下進(jìn)行。
本發(fā)明的可靠性不依賴于所述靶中的鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶的含量。因?yàn)镚-C堿基對(duì)形成了三個(gè)氫鍵，而A-T堿基對(duì)僅形成了兩個(gè)氫鍵，具有更高的G或C含量的靶和探針序列更穩(wěn)定，具有更高的解鏈溫度。結(jié)果，提高雜交探針和靶區(qū)域的GC含量在完全匹配的雜合體所含的之上，堿基對(duì)錯(cuò)配可以抵銷與錯(cuò)配探針相關(guān)的結(jié)合弱化。當(dāng)采用嵌入熒光團(tuán)時(shí)，含有每一種可能的探針和靶之間堿基對(duì)錯(cuò)配的三鏈體證實(shí)比完全匹配的三鏈體更不穩(wěn)定，總是導(dǎo)致熒光強(qiáng)度低于完全互補(bǔ)的雜合體。
本發(fā)明分析是極其靈敏的，從而排除了對(duì)靶進(jìn)行PCR擴(kuò)增的需要。例如，可以分析具有約20微升體積的測(cè)試樣品，其含有約10fmol的靶和約10fmol的探針。本發(fā)明的實(shí)施方案是靈敏的，足以測(cè)定濃度為5×10-9M、優(yōu)選不超過(guò)5×10-10M的靶。本發(fā)明的實(shí)施方案是靈敏的，足以利用濃度為5×10-9M、優(yōu)選不超過(guò)5×10-10M的探針。不用說(shuō)，前面的值并非提示該方法不能檢測(cè)更高的濃度。
其中形成三鏈體的介質(zhì)可以是任何已知適用于保護(hù)核苷酸的常規(guī)介質(zhì)。參見(jiàn)例如Sambrook等，“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloningA Lab Manual)”，第2卷(1989)。例如，液體介質(zhì)可以包括核苷酸、水、緩沖液和標(biāo)準(zhǔn)的鹽濃度。當(dāng)二價(jià)陽(yáng)離子專門(mén)用于促進(jìn)三鏈體形成時(shí)，螯合劑如EDTA或EGTA不應(yīng)該包括在反應(yīng)混合物中。
互補(bǔ)堿基間的特異性結(jié)合發(fā)生在溫度、鹽濃度、靜電強(qiáng)度和緩沖液組成的變化的各種條件下。這些條件和利用它們的方法的例子是本領(lǐng)域已知的。
與許多Hoogsteen類型的三鏈體不同，它們?cè)趐H值高于約7.6時(shí)是不穩(wěn)定或不存在的，本發(fā)明的沃森-克里克三鏈體在大范圍的pH水平下是穩(wěn)定的，優(yōu)選從約pH5到約pH9。
優(yōu)選地，三鏈體是在約5℃到約25℃的溫度下反應(yīng)約1小時(shí)或更少的時(shí)間形成的。更長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間是不需要的，但在大多數(shù)情況中，溫育長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)不會(huì)對(duì)三鏈體有不利影響。本發(fā)明的沃森-克里克三鏈體的快速結(jié)合時(shí)間與基于Hoogsteen三鏈體的分析需要更長(zhǎng)的結(jié)合時(shí)間形成對(duì)照。
盡管不需要，但是通過(guò)利用除陽(yáng)離子以外的某些試劑可以促進(jìn)三鏈體在溶液中的形成。這些試劑的優(yōu)選例子包括單鏈結(jié)合蛋白，例如，Rec A蛋白質(zhì)、T4基因32蛋白質(zhì)、大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)、大或小核酸溝結(jié)合蛋白質(zhì)、紫羅堿和嵌入物質(zhì)如溴化乙錠、放線菌素D、補(bǔ)骨脂內(nèi)酯和當(dāng)歸根素。這樣的促進(jìn)劑可證明在極端操作條件，例如異常pH水平或極端高溫下是有用的。
本發(fā)明的分析可以用于例如鑒定折疊的核苷酸序列中可接近的區(qū)域、確定雜交復(fù)合體中錯(cuò)配堿基對(duì)的數(shù)目，以及對(duì)基因組作圖。
本發(fā)明人在此有時(shí)可以提示沃森-克里克三鏈體由探針和雙鏈體靶雜交產(chǎn)生。熒光團(tuán)束縛于探針，在與雙鏈體靶接觸后就產(chǎn)生猝滅的熒光輻射，所述雙鏈體靶含有沃森-克里克互補(bǔ)堿基的鏈，這說(shuō)明發(fā)生了某種結(jié)合事件，此時(shí)本發(fā)明人仍不確信沃森-克里克三鏈體中發(fā)生的事情是否可最好描述成在傳統(tǒng)意義上與沃森-克里克雙鏈體形成相關(guān)的雜交。當(dāng)沃森-克里克三鏈體的形成在此有時(shí)可稱作雜交事件時(shí)，這也僅為了方便起見(jiàn)，對(duì)于沃森-克里克三鏈體的形成如何最好地加以表征，并不意在限制本發(fā)明范圍。
與上述
背景技術(shù)：
章節(jié)中所討論的四鏈體不同，根據(jù)傳統(tǒng)的沃森-克里克結(jié)合法則，本發(fā)明的優(yōu)選多鏈體結(jié)構(gòu)含有至少四條結(jié)合在一起的核酸。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“沃森-克里克鍵合”意要定義在核酸(和/或核酸類似物)鏈的相反對(duì)之間通過(guò)匹配的相對(duì)堿基的特異結(jié)合。本文有時(shí)將沃森-克里克四鏈體的形成稱為雜交事件，對(duì)于沃森-克里克四鏈體的形成如何可以最好地表征，那僅僅為了方便，并不意在限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明的多鏈體結(jié)構(gòu)優(yōu)選四鏈體。多鏈體的每條鏈獨(dú)立地含有核酸或核酸類似物。適當(dāng)?shù)暮怂岚ɡ鏒NA或RNA。優(yōu)選的核酸類似物含有不帶電荷或部分帶電荷的主鏈(即帶有電荷的主鏈，所述電荷與天然DNA主鏈一樣不是陰性的)。
在某些實(shí)施方案中，四鏈體有四條鏈，其第二和第四條鏈中的一條含有DNA，而第二和第四條鏈中的另一條含有RNA、mRNA、hnRNA、rRNA、tRNA或cDNA。
在某些實(shí)施方案中，第二條鏈和第四條鏈?zhǔn)窍嗷テ叫型吹?。在這些實(shí)施方案中，將第一和第二條鏈的大溝放置在第三和第四條鏈的小溝中。
在其它實(shí)施方案中，第二和第四條鏈?zhǔn)窍嗷テ叫谢パa(bǔ)的。在這些實(shí)施方案中，具有“嵌套互補(bǔ)性”，將第一和第二條鏈的大溝放置在第三和第四條鏈的小溝中。
在某些實(shí)施方案中，每個(gè)核堿基結(jié)合到不超過(guò)兩個(gè)其他核堿基上。在其中一些實(shí)施方案中，第二條鏈的堿基特異性結(jié)合(通過(guò)沃森-克里克法則)到第一條鏈的匹配堿基，和結(jié)合到第四條鏈的匹配堿基，以及第四條鏈的堿基特異性結(jié)合(通過(guò)沃森-克里克法則)到第三條鏈的匹配堿基，和結(jié)合到第二條鏈的匹配堿基，其中第一和第三條鏈的堿基結(jié)合到不超過(guò)一個(gè)其它的各個(gè)堿基。所以，除了傳統(tǒng)的沃森-克里克堿基對(duì)以外，這樣的實(shí)施方案包括下面的沃森-克里克堿基三聯(lián)體A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和/或C-G-C(包括C+-G-C，和/或其它離子化的堿基物種)。
在某些實(shí)施方案中，相信第一和第三條鏈的相對(duì)堿基除了下列結(jié)合以外還相互結(jié)合(a)在第一和第二條鏈的相對(duì)堿基之間的結(jié)合；(b)在第三和第四條鏈的相對(duì)堿基之間的結(jié)合；和(c)在第二和第四條鏈的相對(duì)堿基之間的結(jié)合。
在本發(fā)明的多鏈體結(jié)構(gòu)的某些實(shí)施方案中，沒(méi)有鏈?zhǔn)桥c另一條鏈鄰接的。也就是說(shuō)，存在至少四條獨(dú)立的鏈。雖然折疊的構(gòu)型等(例如發(fā)夾轉(zhuǎn)角等)在本發(fā)明的范圍內(nèi)，但是單鏈的折疊部分不使鏈計(jì)數(shù)一次以上，接近四條單獨(dú)鏈的最小值。
本發(fā)明的多鏈體結(jié)構(gòu)優(yōu)選地不依賴于Hoogsteen鍵合或G-G四聯(lián)體來(lái)維持多鏈體結(jié)構(gòu)，盡管可能存在不顯著量的Hoogsteen鍵合和/或G-G四聯(lián)體。即，本發(fā)明的多鏈體結(jié)構(gòu)優(yōu)選基本上無(wú)Hoogsteen鍵合，并且基本上無(wú)G-G四聯(lián)體。
在某些實(shí)施方案中，多鏈體的第一和第二條鏈長(zhǎng)度為5-50個(gè)堿基(更優(yōu)選地長(zhǎng)度是5-30個(gè)堿基)，以及第三和第四條鏈長(zhǎng)度為8-3.3×109個(gè)堿基對(duì)。例如，第一和第二條鏈可以構(gòu)成雙鏈探針，而第三和第四條鏈可以構(gòu)成雙鏈靶，如基因組DNA，其可以含有單元型。
在實(shí)施方案中，第三條鏈和第四條鏈?zhǔn)荘CR擴(kuò)增產(chǎn)物。
本發(fā)明的多鏈體可以在體外或體內(nèi)存在于溶液中，存在于固相支持物上。固相支持物可以是電傳導(dǎo)(例如電極)或非傳導(dǎo)的。
本發(fā)明的四鏈體形成適用于各種用途。例如，共價(jià)結(jié)合到雙鏈核酸切割劑上的雙鏈探針可以用于特異性切割雙鏈核酸的靶序列。共價(jià)結(jié)合到化療劑的雙鏈探針可以用于特異性處理雙鏈核酸的靶序列。所以，本發(fā)明包括多鏈體結(jié)構(gòu)，其進(jìn)一步包括與第一、第二、第三和第四條鏈中的至少一條結(jié)合的治療劑、預(yù)防劑或診斷劑。
另外，本發(fā)明的多鏈體適用于納米工程，如用來(lái)提供分子水平(即納米級(jí))上的電路。關(guān)于納米工程與核酸的更多細(xì)節(jié)可以在授予Sen等的美國(guó)專利號(hào)5,948,897中找到，文獻(xiàn)在此引入?yún)⒖肌?br> 本發(fā)明的多鏈體結(jié)構(gòu)可以通過(guò)一種方法來(lái)提供，該方法包括提供含有第一條鏈、第二條鏈、第三條鏈、第四條鏈、水、緩沖液和促進(jìn)劑的雜交介質(zhì)，并且溫育雜交介質(zhì)，溫育時(shí)間能有效使第二條鏈與第四條鏈雜交。
雜交介質(zhì)可以包括任何已知適用于保護(hù)核苷酸的常規(guī)介質(zhì)。參見(jiàn)例如Sambrook等，“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，第2卷(1989)。例如，介質(zhì)可以包括核苷酸、水、緩沖液和標(biāo)準(zhǔn)的鹽濃度。當(dāng)二價(jià)陽(yáng)離子專門(mén)用于促進(jìn)四鏈體形成時(shí)，螯合劑如EDTA或EGTA不應(yīng)該包括在反應(yīng)混合物中。
互補(bǔ)堿基間的特異性結(jié)合發(fā)生在溫度、鹽濃度、靜電強(qiáng)度和緩沖液組成的變化的各種條件下。這些條件和利用它們的方法的例子是本領(lǐng)域已知的。
與許多Hoogsteen類型的多鏈體不同，它們?cè)趐H值高于約7.6時(shí)是不穩(wěn)定或不存在的，本發(fā)明的沃森-克里克多鏈體在大范圍的pH水平下是穩(wěn)定的，優(yōu)選從約pH5到約pH9。
另外，本發(fā)明的多鏈體不需要如某些現(xiàn)有技術(shù)的四鏈體中存在的同型嘧啶序列或同型嘌呤序列。例如，靶序列可以任何順序含有25％-75％的嘌呤堿基和75％-25％的嘧啶堿基。
優(yōu)選地，多鏈體是在約5℃到約25℃的溫度下反應(yīng)約2小時(shí)或更少的時(shí)間形成的。即使在室溫下，溫育時(shí)間優(yōu)選少于5分鐘。更長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間是不需要的，但在大多數(shù)情況中，溫育長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)不會(huì)對(duì)四鏈體產(chǎn)生不利影響。本發(fā)明的沃森-克里克四鏈體的快速結(jié)合時(shí)間與Hoogsteen四鏈體的更長(zhǎng)的結(jié)合時(shí)間形成對(duì)照。
在雜交介質(zhì)中的促進(jìn)劑優(yōu)選地是嵌入劑或陽(yáng)離子。嵌入劑可以是例如熒光團(tuán)，如選自YOYO-1、TOTO-1、溴化乙錠、乙錠同型二聚體-1、乙錠同型二聚體-2和吖啶的成員。
合適的陽(yáng)離子包括例如，單價(jià)陽(yáng)離子，如Na+(優(yōu)選濃度為50mM-125mM)、K+和其它堿金屬離子；二價(jià)陽(yáng)離子，如堿土金屬離子(例如Mg+2和Ca+2)和二價(jià)過(guò)渡金屬離子(例如Mn2+、Ni+2、Cd+2、Co+2和Zn+2)；和具有至少三價(jià)正電荷的陽(yáng)離子，如Co(NH3)6+3，三價(jià)亞精胺和四價(jià)精胺。Mn+2優(yōu)選以濃度10mM-45mM提供。Mg+2優(yōu)選以濃度10mM-45mM提供。Ni+2優(yōu)選以濃度約20mM提供。在實(shí)施方案中，Mg+2和Mn+2組合在一起以濃度各為10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM或40mM(即各為10-40mM)提供。
陽(yáng)離子向形成多鏈體的介質(zhì)中的加入量依賴于許多因素，包括陽(yáng)離子的性質(zhì)、探針的濃度、靶的濃度、其他陽(yáng)離子的存在和探針和靶的堿基含量。優(yōu)選的陽(yáng)離子濃度和混合物通常可通過(guò)實(shí)驗(yàn)找到。
雖然不需要，其它促進(jìn)劑包括例如，單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)如Rec A蛋白質(zhì)、T4基因32蛋白質(zhì)、大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)、大或小核酸溝結(jié)合蛋白質(zhì)、紫羅堿和其它嵌入物質(zhì)如放線菌素D、補(bǔ)骨脂內(nèi)酯和當(dāng)歸根素。這樣的促進(jìn)劑可以證明在極端操作條件，例如在異常pH水平或極端高溫下是有用的。
本發(fā)明還賦予一種方法，其中第二條鏈與第四條鏈的雜交使與第三條鏈和第四條鏈中的至少一條相關(guān)的活性失活。所以，第一條鏈和第二條鏈中的至少一條進(jìn)一步包括藥劑，其中第二條鏈與第四條鏈的雜交將藥劑放置于第三條鏈、第四條鏈或與第三條鏈和第四條鏈中的至少一條相關(guān)的另一種分子上的靶的有效距離內(nèi)。藥劑優(yōu)先選自預(yù)定與臨床相關(guān)基因的啟動(dòng)子序列結(jié)合的核酸、預(yù)定與臨床相關(guān)基因結(jié)合的核酸或預(yù)定與病原體的復(fù)制子的位點(diǎn)結(jié)合的核酸。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了快速、靈敏、環(huán)保和安全的方法，用于測(cè)定單鏈或雙鏈靶和雙鏈探針之間的結(jié)合，其中所述靶包括核酸序列或核酸類似物序列，以及所述探針包括核酸序列或核酸類似物序列。
本發(fā)明的分析可以用于例如鑒定折疊的核苷酸序列中可接近的區(qū)域、確定雜交復(fù)合體中錯(cuò)配堿基對(duì)的數(shù)目，以及對(duì)基因組作圖。
本發(fā)明不僅檢測(cè)特異性探針-靶結(jié)合的存在，而且提供關(guān)于探針和靶之間相互作用性質(zhì)的定性和定量信息。所以，本發(fā)明使專業(yè)人員能夠區(qū)別完全匹配、一個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配、兩個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配、三個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配、一個(gè)堿基對(duì)缺失、兩個(gè)堿基對(duì)缺失和三個(gè)堿基對(duì)缺失，這些錯(cuò)配和缺失是在雙鏈探針中的序列和在雙鏈靶中的序列之間發(fā)生的。
本發(fā)明的實(shí)施方案包括根據(jù)與相同的靶結(jié)合的其它探針?biāo)@示的相同類型的信號(hào)來(lái)校正第一探針-靶混合物的測(cè)定信號(hào)(例如熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光或電特性)，其中其它各個(gè)探針與第一探針至少有一個(gè)堿基的不同。
可以產(chǎn)生校正曲線，其中測(cè)量信號(hào)大小(例如熒光強(qiáng)度)是靶和探針之間結(jié)合親和力的函數(shù)。當(dāng)靶和多個(gè)不同探針之間的結(jié)合親和力隨著錯(cuò)配堿基的數(shù)目、錯(cuò)配的性質(zhì)(A-G對(duì)A-C對(duì)T-G對(duì)T-C等)、四鏈體內(nèi)錯(cuò)配的位置等而變化時(shí)，本發(fā)明的分析可以用于對(duì)靶進(jìn)行測(cè)序。
在實(shí)施方案中，測(cè)量的信號(hào)可以是測(cè)試樣品中所含熒光團(tuán)的熒光輻射強(qiáng)度。在這樣的實(shí)施方案中，根據(jù)熒光團(tuán)是否通過(guò)信號(hào)猝滅或信號(hào)放大對(duì)雜交發(fā)出信號(hào)，在探針和靶之間的結(jié)合親和力可以與輻射強(qiáng)度正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。在選定的條件下，由嵌入劑所產(chǎn)生的熒光輻射強(qiáng)度可以與探針-靶結(jié)合親和力正相關(guān)，然而優(yōu)選實(shí)施方案采用與探針共價(jià)結(jié)合的非嵌入熒光團(tuán)，其輻射強(qiáng)度可以與探針-靶結(jié)合親和力負(fù)相關(guān)。優(yōu)選在包括0-2個(gè)錯(cuò)配和/或缺失的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在包括0-3個(gè)錯(cuò)配和/或缺失的范圍內(nèi)，隨著探針和靶之間錯(cuò)配程度的提高，非嵌入熒光團(tuán)的熒光輻射強(qiáng)度下降。
本發(fā)明能夠定量測(cè)定探針和靶之間的結(jié)合親和力。這樣的信息在各種用途中有價(jià)值，包括設(shè)計(jì)具有最佳結(jié)合特性的反義藥物。
本發(fā)明的分析優(yōu)選是勻相的。在檢測(cè)測(cè)量信號(hào)的大小之前，無(wú)需從游離探針和游離靶中分離出探針-靶復(fù)合體就可以進(jìn)行分析。分析不需要凝膠分離步驟，從而允許測(cè)試通量大幅增加。定量分析是簡(jiǎn)單而準(zhǔn)確的。結(jié)果，結(jié)合分析節(jié)省了許多時(shí)間和費(fèi)用，并可以容易地自動(dòng)化。另外，它能使結(jié)合變量如緩沖液、pH、離子濃度、溫度、溫育時(shí)間、探針和靶序列的相對(duì)濃度、嵌入劑濃度、靶序列的長(zhǎng)度、探針序列的長(zhǎng)度和可能的必要輔助因子(即促進(jìn)劑)得以快速地確定。
分析可以在例如不可滲透的表面或在生物芯片上的孔或微型通道內(nèi)的溶液中進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，在第一和第二條鏈之前將第三和第四條鏈提供在雜交介質(zhì)中，而第一和第二條鏈在通過(guò)與雜交介質(zhì)接觸再水合之前以去水合形式提供。
另外，本發(fā)明的分析優(yōu)選地是無(wú)需在靶或探針上提供信號(hào)猝滅劑而進(jìn)行的。
雖然本發(fā)明人已經(jīng)在前面公開(kāi)了熒光強(qiáng)度分析雜交的優(yōu)點(diǎn)(參見(jiàn)例如，1998年12月31日遞交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?9/224,505)，本發(fā)明分析的某些實(shí)施方案特異性檢測(cè)了探針和雙鏈靶的四鏈體，所以排除對(duì)靶進(jìn)行變性的需要。令人驚奇的是，本發(fā)明人已經(jīng)能夠特異性測(cè)定在雙鏈探針和雙鏈靶之間形成的四鏈體，其中探針和靶之間的相互作用基于沃森-克里克堿基配對(duì)(至少在A結(jié)合T(或U，在RNA的情況中)和G結(jié)合C的意義上)，而不是很有限的如Pitner等，同上的四鏈體雜交的Hoogsteen模型。
用于本發(fā)明分析中的合適的探針包括例如dsDNA、dsRNA、DNA:RNA雜合體、dsPNA、PNA:DNA雜合體，和不帶電荷或帶部分電荷的主鏈的其它雙鏈核酸類似物。具有8-20個(gè)堿基任意長(zhǎng)度的探針序列是優(yōu)選的，因?yàn)檫@是原核生物和真核生物中找到的最小的獨(dú)特DNA序列的范圍。探針為12-18個(gè)堿基是特別優(yōu)選的，因?yàn)檫@是人基因組中獨(dú)特序列的最小長(zhǎng)度。在實(shí)施方案中，5-30個(gè)堿基的探針是最優(yōu)選的。但是，可以利用多個(gè)更短的探針來(lái)檢測(cè)其中具有多個(gè)非獨(dú)特靶序列的核苷酸序列，將它們組合來(lái)獨(dú)特地鑒定所述核苷酸序列?？蛇x擇探針的長(zhǎng)度來(lái)匹配靶的長(zhǎng)度。
本發(fā)明不需要使用放射性探針，它們?cè)谑褂弥惺俏ｋU(xiǎn)、麻煩和耗時(shí)的，并需要不斷地再生。本發(fā)明的探針優(yōu)選使用時(shí)是安全的，并且常年穩(wěn)定。因此，探針可以大量制造或定購(gòu)和儲(chǔ)存。
在實(shí)施方案中，用多分子的信號(hào)復(fù)合體或氧化還原對(duì)，或用引發(fā)化學(xué)發(fā)光或電化學(xué)發(fā)光特性的標(biāo)記來(lái)標(biāo)記探針。
當(dāng)熒光嵌入劑不存在于雜交介質(zhì)中時(shí)，優(yōu)選地，探針或靶(優(yōu)選探針)具有與其共價(jià)結(jié)合的熒光標(biāo)記。該標(biāo)記優(yōu)選是非嵌入熒光團(tuán)或嵌入熒光團(tuán)。在這樣的實(shí)施方案中，熒光團(tuán)優(yōu)選在任意末端與探針結(jié)合。優(yōu)選的熒光標(biāo)記包括生物素、若丹明、吖啶和熒光素，以及其它當(dāng)用激發(fā)能照射時(shí)發(fā)熒光的標(biāo)記。
選擇激發(fā)波長(zhǎng)(通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)和/或常識(shí))，以對(duì)應(yīng)子在用熒光團(tuán)的激發(fā)最大值，并優(yōu)選為200-1000nm。優(yōu)選地，選擇熒光團(tuán)具有200-1000nm的輻射波長(zhǎng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用氬離子激光器照射熒光團(tuán)，光的波長(zhǎng)范圍是400-540nm，以及在500-750nm的范圍內(nèi)檢測(cè)熒光輻射。
本發(fā)明分析可以在各種溫度下進(jìn)行，如5-85℃?，F(xiàn)有技術(shù)的某些分析需要提高的溫度、增加成本和延遲測(cè)定。另一方面，本發(fā)明可在室溫或低于室溫(例如低于25℃)下進(jìn)行。
本發(fā)明的可靠性不依賴于所述靶中的鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶的含量。因?yàn)镚-C堿基對(duì)形成了三個(gè)氫鍵，而A-T堿基對(duì)僅形成了兩個(gè)氫鍵，具有更高的G或C含量的靶和探針序列更穩(wěn)定，具有更高的解鏈溫度。結(jié)果，提高雜交探針和靶區(qū)域的GC含量在完全匹配的雜合體所含的之上，堿基對(duì)錯(cuò)配可以抵銷與錯(cuò)配探針相關(guān)的結(jié)合弱化。
本發(fā)明分析是極其靈敏的，從而排除了對(duì)靶進(jìn)行PCR擴(kuò)增的需要。例如，可以分析具有約20微升體積的測(cè)試樣品，其含有約10fmol的靶和約10fmol的探針。本發(fā)明的實(shí)施方案是靈敏的，足以測(cè)定濃度為5×10-9M、優(yōu)選不超過(guò)5×10-10M的靶。本發(fā)明的實(shí)施方案是靈敏的，足以利用濃度為5×10-9M、優(yōu)選不超過(guò)5×10-10M的探針。不用說(shuō)，前面的值并非暗示該方法不能檢測(cè)更高的濃度。
探針(例如第一和第二條鏈)與靶(例如第三和第四條鏈)的比例是30∶1到1∶1，優(yōu)選約10∶1。
實(shí)施例將顯示，YOYO-1為一已知的位于小溝的雙鏈體DNA嵌入劑，其可促進(jìn)DNA寡核苷酸與雙鏈體靶的三鏈體締合或結(jié)合并對(duì)所述締合或結(jié)合發(fā)出信號(hào)，其指示互補(bǔ)性程度，基于寡核苷酸上的堿基和雙鏈體靶中的互補(bǔ)序列的堿基之間的沃森-克里克堿基對(duì)識(shí)別而加以確定。
所觀察的三鏈體結(jié)合不可能是同型嘧啶三鏈體基元的形式，在文獻(xiàn)中有明確鑒定，這是由于復(fù)合體對(duì)酸條件要求高。同樣，如果把我們典型的野生型GC含量33％的15聚體寡核苷酸評(píng)價(jià)成雙鏈體靶中“富含嘌呤的鏈”的結(jié)合伙伴，正如同型嘌呤三鏈體基元所要求的，則我們的寡核苷酸在富含嘌呤的靶雙鏈體鏈上的寡核苷酸序列或假設(shè)的結(jié)合位點(diǎn)中將有9個(gè)堿基的錯(cuò)配。
YOYO-1嵌入劑根據(jù)NMR光譜學(xué)研究已由Johansen和Jacobsen(1998)報(bào)道為位于雙鏈體DNA的小溝。其還報(bào)道，YOYO-1的作用是局部將雙鏈體DNA的B構(gòu)象解縮合106°，導(dǎo)致13個(gè)堿基對(duì)的總螺旋重復(fù)而非在B構(gòu)象螺旋重復(fù)中通常所發(fā)現(xiàn)的10個(gè)堿基對(duì)。
作為熒光團(tuán)，YOYO-1的輻射通過(guò)向含有雙鏈體靶的介質(zhì)中加入互補(bǔ)寡核苷酸而得以大大增強(qiáng)。與寡核苷酸和雙鏈體的相互作用相關(guān)的輻射增強(qiáng)可歸功于存在于雙鏈體小溝中并在寡核苷酸與雙鏈體接觸后更強(qiáng)力發(fā)射光的YOYO-1，或歸功于當(dāng)其各個(gè)堿基相互接觸時(shí)，在由雙鏈體中的寡核苷酸和互補(bǔ)鏈所產(chǎn)生的溝中，找到第二個(gè)易于接受的位置定位自身的YOYO-1。也有可能兩個(gè)事件同時(shí)發(fā)生。諸如X-射線結(jié)晶學(xué)和NMR光譜學(xué)的深入研究將確立YOYO-1與天然三鏈體可能的位置以及相互作用。
Johansen和Jacobsen(1998)的結(jié)論是雙鏈體DNA解縮合106°是由YOYO-1生色團(tuán)的雙嵌入所引起的，同時(shí)聚丙烯胺接頭鏈維持在雙鏈體的小溝中。這可能是部分機(jī)制，由此靶解縮合106°，這將是以兩個(gè)方向從YOYO-1相互作用的部位中表現(xiàn)出的松弛。位于雙鏈體主鏈之間小溝中的YOYO-1的+4陽(yáng)離子性質(zhì)造成緊鄰YOYO-1結(jié)合部位的磷酸根陰離子電荷之間排斥的松弛，導(dǎo)致骨架鏈在鄰近YOYO-1處相互靠得更近，這也是有可能的。如果第二YOYO-1將其定位在靠近雙鏈體小溝中存在的YOYO-1，通過(guò)位于由寡核苷酸和互補(bǔ)鏈在小溝中相互接觸時(shí)所產(chǎn)生的溝，此YOYO-1也會(huì)用于降低寡核苷酸主鏈和主鏈的互補(bǔ)序列區(qū)之間的陰離子排斥。
我們還觀察到縮合雙鏈體DNA的試劑具有促進(jìn)三鏈體形成的能力。除了單價(jià)、二價(jià)和多價(jià)陽(yáng)離子縮合雙鏈體DNA的眾所周知的能力以外，我們的結(jié)果還提示陽(yáng)離子形成橋，所述橋使得寡核苷酸中的堿基和雙鏈體互補(bǔ)鏈中的堿基之間的結(jié)合成為可能。我們呈現(xiàn)它首先通過(guò)形成由陽(yáng)離子促進(jìn)的三鏈體，然后破壞橋連結(jié)構(gòu)。介質(zhì)中含有陽(yáng)離子和三鏈體，對(duì)其持續(xù)發(fā)射激光的結(jié)果是所有三鏈體結(jié)構(gòu)的快速消失。
我們利用由YOYO-1促進(jìn)的三鏈體的經(jīng)驗(yàn)在于，它們?cè)谑覝叵氯菀仔纬?，并且形成后持續(xù)許多小時(shí)。隨著時(shí)間的推延，錯(cuò)配的寡核苷酸繼續(xù)同樣低水平的熒光團(tuán)輻射，顯示同樣水平的三鏈體形成。另一方面，陽(yáng)離子似乎導(dǎo)致短暫的條件，有助于三鏈體或四鏈體的形成。陽(yáng)離子包括諸如YOYO-1的嵌入劑，諸如MgCl2的金屬中心陽(yáng)離子或諸如亞精胺的陽(yáng)離子肽，所有這些陽(yáng)離子通過(guò)與陰離子電荷相互作用而作用于構(gòu)象，導(dǎo)致雙鏈體DNA靶的構(gòu)象的修飾。這些結(jié)果隨著陽(yáng)離子物種、若干物種的濃度或存在不同濃度的物種而變化。
我們已顯示了適當(dāng)濃度的有機(jī)溶劑允許修飾靶雙鏈體DNA，這使得三鏈體得以形成。
許多三鏈體和四鏈體形成的短暫性質(zhì)與有機(jī)體的要求相一致，這些要求為涉及從雙鏈體DNA獲取序列信息的許多過(guò)程應(yīng)是可逆的，其是受激的和終止的。然而，這樣的信息是足夠穩(wěn)定的，以便診斷和其他分析可以它們作為基礎(chǔ)。
所以，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論通過(guò)什么途徑，它是雙鏈體DNA的縮合或解縮合，這使得寡核苷酸和互補(bǔ)序列之間的識(shí)別成為可能，足以實(shí)現(xiàn)寡核苷酸上的至少一個(gè)堿基與雙鏈體靶的互補(bǔ)鏈中的堿基接觸。當(dāng)螺旋重復(fù)的大小被縮合或解縮合修飾時(shí)，很可能有眾多的位置改變，所述位置通常由序列中的相鄰堿基對(duì)所享有。在修飾的螺旋中重新排列堆積的堿基對(duì)極有可能從存在于未修飾的雙螺旋的堿基堆積的電子軌道中允許有足夠的變化，從而讓第三條鏈與互補(bǔ)鏈開(kāi)始結(jié)合。
由縮合或解縮合帶來(lái)的雙鏈體修飾可以相當(dāng)勻相的方式發(fā)生，dsDNA中及其附近的所有陰離子電荷一般同時(shí)受到影響，或者修飾可以局部化。在后一種情形下，一系列變化大的修飾將出現(xiàn)在逐漸遠(yuǎn)離修飾位點(diǎn)的DNA堿基對(duì)和主鏈中。在任一情形下，可創(chuàng)造條件以使得寡核苷酸上的堿基與雙鏈體互補(bǔ)鏈中的堿基之間結(jié)合事件生成三鏈體配對(duì)。一旦這樣的結(jié)合已經(jīng)啟動(dòng)，可以理解寡核苷酸上兩個(gè)側(cè)翼堿基序列如何擺動(dòng)到與雙鏈體互補(bǔ)鏈的側(cè)翼序列中的堿基結(jié)合的位置上。
當(dāng)我們的實(shí)驗(yàn)在由YOYO-1促進(jìn)的三鏈體中顯示出極大的穩(wěn)定性時(shí)，其他許多試劑對(duì)雙鏈體DNA的構(gòu)象具有影響，這些影響導(dǎo)致天然三鏈體短暫形成。這些三重螺旋結(jié)構(gòu)繼續(xù)發(fā)展成對(duì)三鏈體維持較不利的構(gòu)象，導(dǎo)致三鏈體結(jié)構(gòu)喪失。
任何能夠起到修飾靶dsDNA的構(gòu)象作用的因素必須對(duì)其隨著時(shí)間的影響加以監(jiān)控，從而建立在選定的溫度、pH等條件下適合的濃度和溫育時(shí)間。本申請(qǐng)教導(dǎo)許多評(píng)價(jià)這種試劑的方法，所述方法可由本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員采用或修改以實(shí)施本文所教導(dǎo)的技術(shù)方案。
參照下列實(shí)施例，本發(fā)明將更詳細(xì)加以說(shuō)明，但應(yīng)理解本發(fā)明不視為受限于此。
實(shí)施例參照下列實(shí)施例，本發(fā)明將更詳細(xì)加以描述，但應(yīng)理解本發(fā)明不視為受限于此。
實(shí)施例1實(shí)施例1顯示，當(dāng)存在陽(yáng)離子DNA嵌入劑YOYO-1(MolecularProbes，Eugene，OR，USA)時(shí)，本發(fā)明的分析可區(qū)分完全互補(bǔ)dsDNA:ssDNA復(fù)合體與含有1bp、2bp和3bp錯(cuò)配或缺失的dsDNA:ssDNA復(fù)合體。NMR光譜對(duì)YOYO-1和dsDNA之間相互作用機(jī)制的分析已顯示，YOYO-1的嵌入導(dǎo)致dsDNA螺旋的局部解縮合106°，產(chǎn)生13個(gè)堿基對(duì)的總螺旋重復(fù)，與非縮合B構(gòu)象dsDNA中通常10個(gè)堿基對(duì)螺旋重復(fù)相反[J.Biomolec.Struct.and Dynamics 16，205-222(1998)]。
互補(bǔ)有義和反義50聚體ssDNA靶序列衍生自人囊腫性纖維化基因的外顯子10[Nature 380，207(1996)]，經(jīng)DNA合成儀(Expedite 8909，PerSeptive Biosystems)上合成并通過(guò)HPLC純化。將等摩爾量的互補(bǔ)寡核苷酸在95℃加熱10分鐘，并且隨著溫度在1.5小時(shí)冷卻至21℃逐漸退火。把dsDNA寡核苷酸以濃度1pmole/μl溶解在ddH2O中。
野生型靶DNA的有義鏈的序列(SEQ ID NO1)為5’-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTCCTA TGA TGA ATA TA-3’。
野生型靶DNA的反義鏈的序列(SEQ ID NO1)為5’-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA TGA TAT TTTCTT TAA TGG TGC CA-3’。
SED ID NO2為50聚體的突變dsDNA靶序列，與野生型靶DNA(SEQ ID NO1)相同，除了在氨基酸位置507上有一個(gè)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在該位置上野生型有義鏈序列CAT變?yōu)镃GT。
SEQ ID NO2的有義鏈的序列為5’-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CGT CTT TGG TGT TTCCTA TGA TGA ATA TA-3’。
SEQ ID NO2的反義鏈的序列為5’-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGACGA TAT TTTCTT TAA TGG TGC CA-3’。
SED ID NO3為50聚體的突變dsDNA靶序列，與野生型靶DNA(SEQ ID NO1)相同，除了在氨基酸位置506和507上有兩個(gè)連續(xù)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在這兩個(gè)位置上野生型有義鏈序列CAT變?yōu)锳CT。
SEQ ID NO3的有義鏈的序列為5’-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT ACT CTT TGG TGT TTCCTA TGA TGA ATA TA-3’。
SEQ ID NO3的反義鏈的序列為5’-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGAGTA TAT TTTCTT TAA TGG TGC CA-3’。
SED ID NO4為50聚體的突變dsDNA靶序列，與野生型靶DNA(SEQ ID NO1)相同，除了在氨基酸位置506和507上有三個(gè)連續(xù)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在這些位置上野生型有義鏈序列CAT變?yōu)锳CG。
SEQ ID NO4的有義鏈的序列為5’-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TATACGCTT TGG TGT TTCCTA TGA TGA ATA TA-3’。
SEQ ID NO4的反義鏈的序列為5’-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGCGTA TAT TTTCTT TAA TGG TGC CA-3’。
SED ID NO5為47聚體的突變dsDNA靶序列，與野生型靶DNA(SEQ ID NO1)相同，除了在氨基酸位置507和508上有三個(gè)連續(xù)堿基對(duì)缺失(用三個(gè)點(diǎn)表示)以外，在這些位置上野生型有義鏈序列CTT缺失。
SEQ ID NO5的有義鏈的序列為5’-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT ... TGG TGT TTCCTA TGA TGA ATA TA-3’。
SEQ ID NO5的反義鏈的序列為5’-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CA ... A TGA TAT TTTCTT TAA TGG TGC CA-3’。
探針1號(hào)為15聚體ssDNA探針，設(shè)計(jì)成與50聚體野生型靶DNA(SEQ ID NO1)的有義鏈的15個(gè)核苷酸區(qū)段完全互補(bǔ)，在氨基酸位置505-510重疊[Nature 380，207(1996)]。探針的手性與靶中的有義鏈的手性相反或反平行。探針1號(hào)在DNA合成儀上合成，由HPLC純化，并以濃度為1pmol/μl溶解在ddH2O中。
探針1號(hào)的序列為5’-CAC CAA AGA TGA TAT-3’。
雜交反應(yīng)混合物(120μl)含有下列物質(zhì)6pmol的靶dsDNA、6pmol的ssDNA探針、0.5×TBE和500nM的DNA嵌入劑YOYO-1(MolecularProbes，Eugene，OR，USA)。將反應(yīng)混合物在室溫(21℃)下溫育5分鐘，放置于石英比色杯中，用波長(zhǎng)488nm的氬離子激光束照射，并且在加熱的室中，隨著時(shí)間溫度升高，對(duì)熒光輻射進(jìn)行反復(fù)監(jiān)測(cè)。通過(guò)直接置于各樣品中的軟件控制的溫度探針，對(duì)樣品同時(shí)進(jìn)行溫度測(cè)定。以各個(gè)分析樣品的溫度函數(shù)，對(duì)最大的熒光強(qiáng)度作圖。
圖1表明，當(dāng)野生型50聚體非變性dsDNA靶序列(SEQ ID NO1)與15聚體ssDNA探針1號(hào)在30-85℃下反應(yīng)時(shí)，取得了最高的熒光強(qiáng)度。在溫度低于50聚體野生型dsDNA的Tm 65℃時(shí)，dsDNA:ssDNA復(fù)合體形成，由DNA嵌入劑YOYO-1增強(qiáng)。隨著溫度升高到65℃以上，dsDNA:ssDNA復(fù)合體轉(zhuǎn)化成ssDNA:ssDNA復(fù)合體。顯然，YOYO-1能夠嵌入并在兩種類型的復(fù)合體中有效發(fā)熒光。
對(duì)比之下，不完全互補(bǔ)的探針和靶組合生成1bp錯(cuò)配(SEQ IDNO2+探針1號(hào))、連續(xù)2bp錯(cuò)配(SEQ ID NO3+探針1號(hào))、連續(xù)3bp錯(cuò)配(SEQ ID NO4+探針1號(hào))和3bp缺失(SEQ ID NO5+探針1號(hào))導(dǎo)致熒光強(qiáng)度分別比用完全匹配序列所觀察到的在30℃下低57％、94％、97％和98％，而在65℃下低47％、79％、92％和91％(圖1)。含有50聚體dsDNA靶加上500nM YOYO-1的對(duì)照樣品顯示出熒光水平為或低于用3bp錯(cuò)配的復(fù)合體在30℃下所觀察到的熒光水平(數(shù)據(jù)未顯示)。由ssDNA探針1號(hào)加上500nM YOYO-1樣品所發(fā)射的熒光水平與單獨(dú)由YOYO-1發(fā)射的相同(數(shù)據(jù)未顯示)。隨著溫度增加高于65℃時(shí)，完全匹配和堿基對(duì)錯(cuò)配之間的區(qū)分程度降低，表明dsDNA:ssDNA結(jié)構(gòu)逐漸分解。至85℃時(shí)，由1bp錯(cuò)配、2bp錯(cuò)配、3bp錯(cuò)配和3bp缺失所實(shí)現(xiàn)的熒光強(qiáng)度比完全匹配獲得的要低40％、63％、92％和83％(圖1)。在任何給定溫度下，由各個(gè)復(fù)合體所發(fā)射的熒光的特征水平隨時(shí)間加以監(jiān)測(cè)，并且在5分鐘和24小時(shí)之間穩(wěn)定。
DNA解縮合劑YOYO-1的存在使得ssDNA探針用于辨別完全互補(bǔ)dsDNA:ssDNA復(fù)合體和那些含有1bp、2bp或3bp錯(cuò)配或缺失的復(fù)合體，無(wú)需事先對(duì)dsDNA靶進(jìn)行變性。
實(shí)施例2為了確保采用DNA解縮合劑、ssDNA探針和非變性dsDNA靶的熒光強(qiáng)度分析適用于明顯具有不同GC百分含量(以及潛在的相異退火溫度)的探針和靶DNA，將新的15聚體ssDNA探針和50聚體dsDNA靶序列如上合成、純化和退火。ssDNA探針和dsDNA靶均以濃度1pmol/μl溶解在ddH2O中。
SEQ ID NO6為從SEQ ID NO1中修飾的50聚體dsDNA靶序列，其中GC百分含量從30％變?yōu)?2％。
野生型靶DNA的有義鏈序列(SEQ ID NO6)為5’-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CTC TGG TGT GTCCTA CGA TGA CTC TG-3’。
野生型靶DNA的反義鏈序列(SEQ ID NO6)為5’-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA TGA CAGTGT CTG TCA TGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO7為50聚體突變dsDNA靶序列，與SEQ ID NO6相同，除了有一個(gè)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在此位置有義鏈序列CTC變成CTT。
突變體SEQ ID NO7的有義鏈序列為5’-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CTTTGG TGT GTCCTA CGA TGA CTC TG-3’。
突變體SEQ ID NO7的反義鏈序列為5’-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAAAGA TGA CAGTGT CTG TCA TGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO8為50聚體突變dsDNA靶序列，與SEQ ID NO6相同，除了有一個(gè)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在此位置有義鏈序列CAT變成CGT。
突變體SEQ ID NO8的有義鏈序列為5’-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CGT CTC TGG TGT GTCCTA CGA TGA CTC TG-3’。
突變體SEQ ID NO8的反義鏈序列為5’-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGACGA CAGTGT CTG TCA TGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO9為50聚體突變dsDNA靶序列，與SEQ ID NO6相同，除了有一個(gè)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在此位置有義鏈序列CAT變成CTT。
突變體SEQ ID NO9的有義鏈序列為5’-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CTT CTC TGG TGT GTCCTA CGA TGA CTC TG-3’。
突變體SEQ ID NO9的反義鏈序列為5’-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGAAGA CAGTGT CTG TCA TGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO10為50聚體突變dsDNA靶序列，與SEQ ID NO6相同，除了有一個(gè)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在此位置有義鏈序列CTC變成CCC。
突變體SEQ ID NO10的有義鏈序列為5’-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CCC TGG TGT GTCCTA CGA TGA CTC TG-3’。
突變體SEQ ID NO10的反義鏈序列為5’-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAGGGA TGA CAGTGT CTG TCA TGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO11為50聚體突變dsDNA靶序列，與SEQ ID NO6相同，除了有一個(gè)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在此位置有義鏈序列CTC變成CGC。
突變體SEQ ID NO11的有義鏈序列為5’-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CGC TGG TGT GTCCTA CGA TGA CTC TG-3’。
突變體SEQ ID NO11的反義鏈序列為5’-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAGCGA TGA CAGTGT CTG TCA TGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO12為50聚體突變dsDNA靶序列，與SEQ ID NO6相同，除了有連續(xù)兩個(gè)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在此位置有義鏈序列CAT變成ACT。
突變體SEQ ID NO12的有義鏈序列為5’-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGTACT CTC TGG TGT GTCCTA CGA TGA CTC TG-3’。
突變體SEQ ID NO12的反義鏈序列為5’-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGAGTA CAGTGT CTG TCA TGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO13為從SEQ ID NO1修飾的50聚體dsDNA靶序列，其中GC百分含量由30％變?yōu)?2％。
野生型靶DNA的有義鏈序列(SEQ ID NO13)為5’-GAG CAC CCT CCC AGG CAC GGT CGT CCC TGG TGCGAC CTC CGA CGA GCG TG-3’。
野生型靶DNA的反義鏈序列(SEQ ID NO13)為5’-CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA CGA CCGTGC CTG GGA GGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO14為50聚體突變dsDNA靶序列，與SEQ ID NO13相同，除了有一個(gè)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在此位置有義鏈序列CGT變成CAT。
突變體SEQ ID NO14的有義鏈序列為5，-GAG CAC CCT CCC AGG CAC GGT CAT CCC TGG TGCGAC CTC CGA CGA GCG TG-3’。
突變體SEQ ID NO14的反義鏈序列為5’-CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGATGA CCGTGC CTG GGA GGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO15為50聚體突變dsDNA靶序列，與SEQ ID NO13相同，除了有連續(xù)兩個(gè)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在此位置有義鏈序列CGT變成ATT。
突變體SEQ ID NO15的有義鏈序列為
5’-GAG CAC CCT CCC AGG CAC GGTATT CCC TGG TGC GACCTC CGA CGA GCG TG-3’。
突變體SEQ ID NO15的反義鏈序列為5’-CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGAATA CCGTGC CTG GGA GGG TGC TC-3’。
探針2號(hào)為15聚體ssDNA探針，設(shè)計(jì)成完全互補(bǔ)于50聚體野生型靶DNA(SEQ ID NO6)的有義鏈的15個(gè)核苷酸區(qū)段。所述探針的手性與靶中有義鏈的手性相反或反平行。
探針2號(hào)的序列為5’-CAC CAG AGA TGA CAG-3’。
探針3號(hào)為15聚體ssDNA探針，設(shè)計(jì)成完全互補(bǔ)于50聚體野生型靶DNA(SEQ ID NO13)的有義鏈的15個(gè)核苷酸區(qū)段。所述探針的手性與靶中有義鏈的手性相反或反平行。
探針3號(hào)的序列為5’-CAC CAG GGA CGA CCG-3’。
雜交分析條件與實(shí)施例1中所述的相同。
當(dāng)ssDNA探針2號(hào)(GC含量為53％)與50聚體野生型dsDNA靶(SEQ ID NO6)和突變dsDNA靶(SEQ ID NO8和SEQ ID NO12)反應(yīng)時(shí)，dsDNA:ssDNA復(fù)合體在低溫及非變性條件下形成(圖2A)。當(dāng)完全匹配的DNA復(fù)合體取得最高的熒光強(qiáng)度時(shí)，帶有1bp錯(cuò)配的不完全互補(bǔ)復(fù)合體(SEQ ID NO8+探針2號(hào))和帶有連續(xù)2bp錯(cuò)配的不完全互補(bǔ)復(fù)合體(SEQ ID NO12+探針2號(hào))在30℃下產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度分別比用完全匹配序列所觀察到的低63％和95％(圖2A)。隨著溫度升高，dsDNA:ssDNA復(fù)合體逐漸分解，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低以及完全匹配與堿基對(duì)錯(cuò)配之間的區(qū)別減少。至85℃時(shí)，在完全匹配序列和那些含有堿基對(duì)錯(cuò)配的序列之間所見(jiàn)的熒光差異很小(圖2A)。
同樣，在YOYO-1存在下，當(dāng)ssDNA探針3號(hào)(GC含量為73％)與對(duì)應(yīng)的50聚體野生型dsDNA靶(SEQ ID NO13)和突變dsDNA靶(SEQ ID NO14和SEQ ID NO15)反應(yīng)時(shí)，dsDNA:ssDNA復(fù)合體形成。1bp錯(cuò)配DNA復(fù)合體(SEQ ID NO14+探針3號(hào))和連續(xù)2bp錯(cuò)配DNA復(fù)合體(SEQ ID NO15+探針3號(hào))在30℃下的熒光強(qiáng)度分別比由完全匹配序列得到的低48％和64％(圖2B)。隨著溫度從30℃升高到85℃，所有樣品的熒光降低，這表明YOYO-1結(jié)合降低以及dsDNA:ssDNA復(fù)合體分解。
不管ssDNA探針和dsDNA靶的GC百分含量，YOYO-1能夠促進(jìn)dsDNA:ssDNA復(fù)合體在非變性條件下的形成，從而允許準(zhǔn)確辨別完全互補(bǔ)序列以及那些含有1或2bp突變的序列。
實(shí)施例3下文實(shí)施例將表明利用不同DNA縮合劑促進(jìn)和穩(wěn)定由非變性dsDNA靶和ssDNA-F探針形成的復(fù)合體進(jìn)行分析的特異性。
探針4號(hào)為15聚體的反平行ssDNA探針，與探針1號(hào)相同，除了其在5’位置有一個(gè)連接的熒光素部分以外。探針4號(hào)通過(guò)DNA合成儀合成，經(jīng)HPLC純化，并以濃度1pmol/μl溶解于ddH2O中。
探針4號(hào)的序列為5’-Flu-CAC CAA AGA TGA TAT-3’。
雜交反應(yīng)混合物(40μl)含有下面的成分0.4pmol靶dsDNA，4pmol5’-熒光素標(biāo)記的ssDNA探針4號(hào)，10mM Tris-HCl、pH 7.5和10mM-125mM NaCl。反應(yīng)混合物在室溫(21℃)下溫育1小時(shí)，無(wú)需對(duì)dsDNA靶進(jìn)行預(yù)變性。將樣品放置在石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。最大熒光強(qiáng)度出現(xiàn)在波長(zhǎng)525nm處，這是熒光素的輻射波長(zhǎng)。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光輻射強(qiáng)度繪圖。
在缺乏NaCl或存在10mM或25mM NaCl的條件下，dsDNA靶與反平行ssDNA-F探針之間沒(méi)有檢測(cè)到結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。
在存在50mM NaCl下溫育1小時(shí)后，由完全互補(bǔ)序列(SEQ IDNO1+探針4號(hào))組成的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體容易形成，導(dǎo)致熒光輻射強(qiáng)度與由對(duì)照探針4號(hào)(標(biāo)記的ssDNA-F)所發(fā)射的比較降低49％(圖3)。相比之下，含有1bp G-T錯(cuò)配的不完全互補(bǔ)dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO2+探針4號(hào))生成的熒光輻射強(qiáng)度與探針4號(hào)對(duì)照樣品所顯示的比較降低11％。
在反應(yīng)混合物中存在75mM、100mM和125mM NaCl還導(dǎo)致熒光輻射猝滅，這與在完全匹配的SEQ ID NO1靶和反平行探針4號(hào)之間形成的顯著量的復(fù)合體相一致，而當(dāng)存在1bp G-T錯(cuò)配的SEQ IDNO2靶和探針4號(hào)時(shí)，猝滅明顯較少，產(chǎn)生與存在50mM NaCl時(shí)所觀察的相似的熒光強(qiáng)度(數(shù)據(jù)未顯示)。
采用已知為DNA縮合劑的單價(jià)陽(yáng)離子，促進(jìn)在非變性dsDNA靶和熒光標(biāo)記的反平行ssDNA探針之間形成DNA復(fù)合體，從而使得完全互補(bǔ)的DNA序列與那些含有單一1bp錯(cuò)配的序列之間產(chǎn)生可靠的差異。以探針與靶為10∶1的比例室溫下在溫育1小時(shí)以內(nèi)發(fā)生反應(yīng)。用于該實(shí)施例的dsDNA靶和ssDNA探針具有33％的GC含量，并且不含有同型嘌呤或同型嘧啶延伸的DNA。盡管在15個(gè)核苷酸ssDNA探針內(nèi)插入有6個(gè)嘧啶堿基，但是dsDNA:ssDNA復(fù)合體仍然以序列特異的方式容易地形成。
實(shí)施例4為了確保在諸如陽(yáng)離子的DNA縮合劑存在下采用5’-熒光素標(biāo)記的ssDNA探針和非變性dsDNA靶的熒光強(qiáng)度分析，適用于明顯具有不同GC百分含量(以及潛在的相異退火溫度)的探針和靶DNA，將15聚體ssDNA-F探針和50聚體dsDNA靶序列(具有不同的GC百分含量)如上合成、純化和退火。ssDNA-F探針和dsDNA靶均以濃度1pmol/μl溶解在ddH2O中。
探針5號(hào)為一15聚體反平行ssDNA探針，與探針2號(hào)相同，除了其在5’位置具有一個(gè)連接的熒光素部分以外。
探針5號(hào)的序列為5’-Flu-CAC CAG AGA TGA CAG-3’。
探針6號(hào)為一15聚體反平行ssDNA探針，與探針3號(hào)相同，除了其在5’位置具有一個(gè)連接的熒光素部分以外。
探針6號(hào)的序列為5’-Flu-CAC CAG GGA CGA CCG-3’。
實(shí)施例3中進(jìn)行的分析在反應(yīng)混合物中通過(guò)加入單價(jià)陽(yáng)離子而得以促進(jìn)。利用二價(jià)陽(yáng)離子(而非單價(jià)陽(yáng)離子)促進(jìn)由具有各種不同GC百分含量的dsDNA靶和ssDNA-F探針形成復(fù)合體來(lái)進(jìn)一步檢查分析的特異性。
雜交反應(yīng)混合物(40μl)含有下面的成分0.4pmol靶dsDNA，4pmol5’-熒光素標(biāo)記的ssDNA探針，10mM Tris-HCl、pH 7.5和5mM-30mMMnCl2或5mM-30mM MgCl2或5mM-30mM NiCl2。反應(yīng)混合物在室溫(21℃)下溫育1小時(shí)，無(wú)需對(duì)dsDNA靶進(jìn)行預(yù)變性。將樣品放置在石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。最大熒光強(qiáng)度出現(xiàn)在波長(zhǎng)525nm處，這是熒光素的輻射波長(zhǎng)。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光輻射強(qiáng)度繪圖。
當(dāng)ssDNA-F探針5號(hào)(GC含量為53％)與50聚體野生型dsDNA靶(SEQ ID NO6)和突變dsDNA靶(SEQ ID NO7-SEQ ID NO12)在存在10mM MnCl2下溫育時(shí)，在室溫及非變性條件下形成dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體。當(dāng)完全匹配的DNA復(fù)合體生成的熒光強(qiáng)度下降最大(溫育1小時(shí)后降低43％)時(shí)，含有1bp T-G錯(cuò)配的較不穩(wěn)定的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO7+探針5號(hào))溫育1小時(shí)后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比單獨(dú)采用探針5號(hào)所觀察的要低20％(圖4)。造成1bpG-T錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO8+探針5號(hào))、1bp T-T錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO9+探針5號(hào))、1bp C-A錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO10+探針5號(hào))以及連續(xù)2bpA-G和C-T錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO12+探針5號(hào))都比完全匹配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO6+探針5號(hào))不穩(wěn)定，生成的熒光強(qiáng)度介于單獨(dú)探針5號(hào)和完全匹配的DNA復(fù)合體所觀察的之間(數(shù)據(jù)未顯示)。除了1bp T-T錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體，其是最不穩(wěn)定的(1小時(shí)后熒光強(qiáng)度僅降低5％)，其他所有錯(cuò)配的DNA復(fù)合體生成非常相似的熒光強(qiáng)度。只有含1bp G-A錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO11+探針5號(hào))產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度低于完全匹配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(數(shù)據(jù)未顯示)。
當(dāng)ssDNA-F探針6號(hào)(GC含量為73％)與對(duì)應(yīng)的50-聚體野生型dsDNA靶(SEQ ID NO13)和突變dsDNA靶(SEQ ID NO14)反應(yīng)1小時(shí)后，包含20mM MgCl2或20mM MnCl2或20mM NiCl2也促進(jìn)形成了dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(數(shù)據(jù)未顯示)。正如所預(yù)料，完全匹配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體生成的熒光強(qiáng)度降低最大，而較不穩(wěn)定的1bpA-C錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO14+探針6號(hào))產(chǎn)生的熒光水平介于中間。
在存在10mM MnCl2條件下1小時(shí)以內(nèi)容易形成完全匹配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(GC含量為33％)(SEQ ID NO1+探針4號(hào))，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度比單獨(dú)由探針4號(hào)發(fā)射的降低57％(數(shù)據(jù)未顯示)。這些反應(yīng)條件對(duì)于含有1bp G-T錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ IDNO2+探針4號(hào))是高度不利的，造成熒光比單獨(dú)由探針4號(hào)所觀察的增加(數(shù)據(jù)未顯示)。
不管dsDNA靶和ssDNA探針的GC百分含量，在非變性條件下，加入諸如Mn+2、Mg+2或Ni+2的二價(jià)陽(yáng)離子促進(jìn)形成dsDNA:ssDNA復(fù)合體，從而允許準(zhǔn)確區(qū)分完全互補(bǔ)的序列和那些含有1bp突變的序列。
實(shí)施例5在一種單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子存在下，對(duì)實(shí)施例3和4中形成的dsDNA:ssDNA復(fù)合體進(jìn)行分析。下文的實(shí)施例將證實(shí)，當(dāng)二價(jià)陽(yáng)離子組合用作復(fù)合體形成的促進(jìn)劑時(shí)，本發(fā)明區(qū)分dsDNA:ssDNA復(fù)合體中的完全匹配和1bp錯(cuò)配的分析是可靠的。
雜交反應(yīng)混合物(40μl)含有下面的成分0.4pmol靶dsDNA，4pmol5’-熒光素標(biāo)記的ssDNA探針，10mM Tris-HCl、pH 7.5和MnCl2和MgCl2各為5mM-20mM。反應(yīng)混合物在室溫(21℃)下溫育1小時(shí)，無(wú)需對(duì)dsDNA靶進(jìn)行預(yù)變性。將樣品放置在石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光強(qiáng)度繪圖。
當(dāng)反平行ssDNA-F探針6號(hào)(GC含量為73％)與50聚體野生型dsDNA靶(SEQ ID NO13)在存在20mM MgCl2和20mM MnCl2下溫育1小時(shí)后，有效形成完全互補(bǔ)的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體，生成的熒光與單獨(dú)由探針6號(hào)所發(fā)射的比較降低46％(圖5A)。這些反應(yīng)條件對(duì)于含有1bp A-C錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO14+探針6號(hào))是高度不利的，導(dǎo)致熒光比單獨(dú)由探針6號(hào)所觀察的減少3％(圖5A)。當(dāng)相同樣品在存在10mM MgCl2和10mM MnCl2或15mM MgCl2和15mM MnCl2條件下溫育1小時(shí)后獲得類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。加入5mM MgCl2和5mM MnCl2不足以使得反平行ssDNA-F探針6號(hào)和所有測(cè)試dsDNA靶在溫育1小時(shí)后相互之間形成復(fù)合體(數(shù)據(jù)未顯示)。
當(dāng)反平行ssDNA-F探針4號(hào)(GC含量為33％)與野生型dsDNA靶(SEQ ID NO1)或突變dsDNA靶(SEQ ID NO2和SEQ ID NO3)在存在10mM MgCl2和10mM MnCl2下溫育時(shí)，觀察到形成最低的DNA復(fù)合體(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，在存在15mM MgCl2和15mM MnCl2下溫育1小時(shí)促進(jìn)了完全匹配的dsDNA:ssDNA-F(SEQ ID NO1+探針4號(hào))復(fù)合體的形成，正如與由探針4號(hào)所獲得的比較，觀察到的熒光強(qiáng)度降低49％所表明(圖5B)。造成1bp G-T錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO2+探針4號(hào))或造成3bp缺失的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO3+探針4號(hào))在存在15mM MgCl2和15mM MnCl2下很不穩(wěn)定，產(chǎn)生的熒光與單獨(dú)由探針4號(hào)所發(fā)射的比較，分別降低2％和增加5％(圖5B)。用20mM MgCl2和20mM MnCl2處理1小時(shí)，導(dǎo)致完全匹配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體以及含有1bp G-T錯(cuò)配或3bp缺失的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體的熒光強(qiáng)度與單獨(dú)由探針4號(hào)所發(fā)射的比較，分別減少68％、48％和6％(數(shù)據(jù)未顯示)。
如圖5C所示，在存在10mM MgCl2和10mM MnCl2下，GC含量為53％并含有完全互補(bǔ)序列的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ IDNO6+探針5號(hào))或GC含量為53％并含有1bp T-G錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO7+探針5號(hào))在溫育1小時(shí)后所生成的熒光強(qiáng)度分別比單獨(dú)由反平行探針5號(hào)所發(fā)射的要低68％和20％。
當(dāng)反平行ssDNA-F探針5號(hào)(GC含量為53％)與50聚體野生型dsDNA靶(SEQ ID NO6)在存在15mM MgCl2和15mM MnCl2下溫育1小時(shí)后，非常有效生成完全互補(bǔ)的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體，生成的熒光與單獨(dú)由探針5號(hào)所獲得的比較降低74％(圖5D)。相比之下，含有1bp T-G錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO7+探針5號(hào))在存在15mM MgCl2和15mM MnCl2下非常不穩(wěn)定，產(chǎn)生的熒光在溫育1小時(shí)后與單獨(dú)由探針5號(hào)所發(fā)射的比較降低15％(圖5D)。同樣，造成1bp G-T錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO8+探針5號(hào))、1bp C-A錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO10+探針5號(hào))、1bp G-A錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO11+探針5號(hào))和連續(xù)2bp A-G和C-T錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ IDNO12+探針5號(hào))都比完全匹配的DNA復(fù)合體更不穩(wěn)定(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)探針5號(hào)(GC含量為53％)與dsDNA靶SEQ ID NO3(GC含量為33％)反應(yīng)時(shí)，觀察的熒光與單獨(dú)由探針5號(hào)所獲得的比較增加3％(圖5D)，這表明沒(méi)有DNA復(fù)合體形成?？紤]到此探針和靶結(jié)合會(huì)導(dǎo)致5bp錯(cuò)配，此結(jié)果是可預(yù)料的。
實(shí)施例3、4和5共同表明，加入諸如單價(jià)陽(yáng)離子或二價(jià)陽(yáng)離子的縮合劑(獨(dú)自或組合)促進(jìn)了dsDNA靶和熒光標(biāo)記的ssDNA探針之間的DNA復(fù)合體形成，顯著具有不同的GC百分含量，從而允許準(zhǔn)確和可靠地區(qū)分完全互補(bǔ)序列和那些含有各種各樣的1bp突變的序列。
實(shí)施例6由YOYO-1促進(jìn)的dsDNA:ssDNA復(fù)合體室溫下在溫育5分鐘內(nèi)容易形成，并且以同樣水平的強(qiáng)度產(chǎn)生熒光輻射數(shù)小時(shí)。含有堿基對(duì)錯(cuò)配的復(fù)合體同樣發(fā)射持久的熒光信號(hào)，這表明隨著時(shí)間的推延復(fù)合體形成的水平相同。為了檢查在諸如陽(yáng)離子的縮合劑存在下dsDNA:ssDNA復(fù)合體的形成速率、穩(wěn)定性和解離速率，進(jìn)行了時(shí)間過(guò)程試驗(yàn)。
雜交反應(yīng)混合物(40μl)含有下面的成分0.4pmol非變性靶dsDNA，4pmol 5’-熒光素標(biāo)記的ssDNA探針，10mM Tris-HCl、pH 7.5和10mM MnCl2和10mM MgCl2。反應(yīng)混合物在室溫(21℃)下溫育1分鐘至2小時(shí)的各種不同期間。溫育后，將樣品放置在石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。在所示的時(shí)間，隨后的多激光照射之后，對(duì)相同樣品進(jìn)一步進(jìn)行熒光測(cè)定(圖6)。對(duì)各個(gè)分析樣品以時(shí)間為函數(shù)將熒光強(qiáng)度繪圖。
由含有4pmol探針5號(hào)加上10mM MnCl2和10mM MgCl2的對(duì)照樣品在缺乏靶dsDNA下所發(fā)射的熒光在僅溫育5分鐘內(nèi)顯著降低了3倍(數(shù)據(jù)未顯示)，然后在接著的數(shù)小時(shí)內(nèi)以更緩慢的速率穩(wěn)定地下降(圖6A)。這種效果我們稱為“陽(yáng)離子猝滅”。這種熒光抑制與ssDNA-F探針和特異陽(yáng)離子的溫育期間增加相關(guān)，通常發(fā)生在二價(jià)陽(yáng)離子存在下，而不發(fā)生在單價(jià)陽(yáng)離子存在下(數(shù)據(jù)未顯示)。此觀察使得在與試驗(yàn)的測(cè)試樣品反應(yīng)十分相同的條件下，溫育試驗(yàn)中的對(duì)照樣品明顯重要。在溫育的不同期間之后，對(duì)各ssDNA-F對(duì)照樣品進(jìn)行多激光發(fā)射，抑制了進(jìn)一步猝滅熒光團(tuán)，導(dǎo)致其后熒光水平的穩(wěn)定(圖6A)。此結(jié)果是完全未預(yù)料的。
當(dāng)反平行ssDNA-F探針5號(hào)與50聚體野生型dsDNA靶(SEQ IDNO6)在存在10mM MnCl2和10mM MgCl2下溫育時(shí)，15分鐘后dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體形成明顯，導(dǎo)致熒光降低，其比對(duì)照探針5號(hào)的漸進(jìn)式陽(yáng)離子猝滅高出6％(圖6B)。在存在10mM MnCl2和10mMMgCl2下，與單獨(dú)由陽(yáng)離子猝滅的探針5號(hào)所取得的比較，SEQ ID NO6與探針5號(hào)溫育30和60分鐘之后生成的熒光分別降低76％和61％，這極其表明復(fù)合體形成(圖6B)。在存在10mM MnCl2和10mM MgCl2下溫育90和120分鐘之后，信號(hào)顯示沒(méi)有復(fù)合體形成(圖6B)。90和120分鐘處的熒光輻射水平完全可歸功于陽(yáng)離子猝滅效果(比較圖6A和6B)。
相比之下，含有1bp T-G錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ IDNO7+探針5號(hào))以較慢的速率形成，并且一旦在10mM MnCl2和10mMMgCl2存在下形成非常不穩(wěn)定。1bp T-G錯(cuò)配的復(fù)合體在溫育30分鐘后首先被觀察到，并且在溫育60分鐘后似乎已得以消除(圖6C)。再次，探針?lè)雌叫杏陔p鏈體中的互補(bǔ)鏈(圖6C)。
在10mM MnCl2和10mM MgCl2存在下，溫育30或60分鐘之后形成的多激光照射完全互補(bǔ)的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO6+探針5號(hào))導(dǎo)致熒光輻射與以對(duì)含有反平行ssDNA探針的DNA復(fù)合體特有的速率破壞這些復(fù)合體相一致(圖6B)。在30分鐘處對(duì)完全互補(bǔ)的復(fù)合體發(fā)射激光，隨后在45分鐘處進(jìn)行測(cè)定時(shí)，發(fā)射強(qiáng)度水平為1869，這證明復(fù)合體降解的快速性(數(shù)據(jù)未顯示)。熒光輻射在多激光發(fā)射后的水平返回到單獨(dú)由未復(fù)合的探針5號(hào)對(duì)照所觀察到的陽(yáng)離子猝滅值(比較圖6A和6B)。唯一例外是溫育15分鐘后形成的和其后反復(fù)照射的完全匹配的復(fù)合體(圖6B)。在這種情況下，熒光輻射與復(fù)合體的破壞不相一致(圖6B)，即使進(jìn)一步陽(yáng)離子猝滅探針5號(hào)，當(dāng)15分鐘溫育后多照射時(shí)，也完全受到抑制(圖6A)。含有1bp T-G錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO7+探針5號(hào))同樣被多激光發(fā)射明顯破壞(圖6C)。
進(jìn)行一個(gè)實(shí)驗(yàn)以確定多激光發(fā)射對(duì)復(fù)合體影響的原理。當(dāng)新鮮陽(yáng)離子加入到已兩次被激光發(fā)射的反應(yīng)混合物時(shí)，發(fā)現(xiàn)由ssDNA-F探針?biāo)l(fā)射的熒光中陽(yáng)離子猝滅的抑制不可以逆轉(zhuǎn)，并且進(jìn)一步陽(yáng)離子猝滅不發(fā)生在進(jìn)一步溫育之時(shí)，這有力地提示由于仍然未知的機(jī)制，ssDNA-F探針被多照射所失活(數(shù)據(jù)未顯示)。同樣，在對(duì)新鮮探針增加的熒光輻射規(guī)格化之后，將新鮮ssDNA-F探針加入到已兩次被激光發(fā)射的反應(yīng)混合物中時(shí)，進(jìn)一步溫育反應(yīng)混合物，未觀察到隨后的漸進(jìn)式陽(yáng)離子猝滅，這有力提示激光發(fā)射的陽(yáng)離子不知何故失效了(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例7實(shí)施例1-6表明以序列特異方式在dsDNA靶和ssDNA探針之間形成dsDNA:ssDNA復(fù)合體，或者由諸如YOYO-1的DNA解縮合劑或者由諸如單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子的DNA縮合劑促進(jìn)。下文實(shí)施例將研究在各種各樣的陽(yáng)離子存在下dsDNA:dsDNA復(fù)合體的形成速率、穩(wěn)定性和解離速率。這些實(shí)施例將顯示陽(yáng)離子物種、各個(gè)陽(yáng)離子濃度以及不同濃度下不同陽(yáng)離子的組合對(duì)dsDNA:dsDNA復(fù)合體的形成速率、穩(wěn)定性和解離速率的影響。
互補(bǔ)有義和反義15聚體ssDNA探針序列在DNA合成儀上合成，并且經(jīng)HPLC純化。將等摩爾量的互補(bǔ)寡核苷酸在95℃下加熱10分鐘，并隨著溫度在1.5小時(shí)冷卻至21℃逐漸退火。把dsDNA寡核苷酸以濃度1pmole/μl溶解在ddH2O中。
探針7號(hào)為15bp dsDNA探針，在各個(gè)5’位置連接有熒光素部分，設(shè)計(jì)成與50聚體野生型靶DNA(SEQ ID NO6)的15bp區(qū)段完全同源。探針7號(hào)的反義鏈與探針5號(hào)相同。
探針7號(hào)的有義鏈序列為5’-Flu-CTG TCA TCT CTG GTG-3’。
探針7號(hào)的反義鏈序列為5’-Flu-CAC CAG AGA TGA CAG-3’。
雜交反應(yīng)混合物(40μl)含有下面的成分0.4pmol非變性靶dsDNA，4pmo1 5’-熒光素標(biāo)記的dsDNA探針，10mM Tris-HCl、pH 7.5，70mM至90mM KCl以及0mM至20mM NaCl。反應(yīng)混合物在室溫(21℃)下溫育1分鐘至2小時(shí)的各種期間。溫育后，將樣品放置在石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射一次，并且檢測(cè)熒光輻射。對(duì)各個(gè)分析樣品以時(shí)間為函數(shù)將熒光強(qiáng)度繪圖。
由含有4pmol探針7號(hào)加上90mM KCl的對(duì)照樣品在缺乏靶dsDNA下所發(fā)射的熒光在120分鐘溫育的全過(guò)程中保持相對(duì)恒定，這表明在單價(jià)KCl存在下未發(fā)生陽(yáng)離子猝滅dsDNA-F探針(圖7A)。當(dāng)dsDNA-F探針7號(hào)與50聚體野生型dsDNA靶(SEQ ID NO6)和突變dsDNA靶(SEQ ID NO7)在90mM KCl存在下溫育時(shí)，室溫及非變性條件下僅在溫育15分鐘內(nèi)就形成了dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體，并持續(xù)至少120分鐘(圖7A)。在90mM KCl存在下，溫育30和45分鐘之后，觀察到完全匹配的和1bp錯(cuò)配的dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體之間有最大區(qū)分，生成的熒光強(qiáng)度與單獨(dú)由探針7號(hào)所發(fā)射的相比，30分鐘后分別低27％和3％，而45分鐘后分別低34％和15％(圖7A)。
在70mM KCl和20mM NaCl存在下，含有完全匹配序列的dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO6+探針7號(hào))或含有1bp錯(cuò)配的dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO6+探針7號(hào))所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比單獨(dú)由探針7號(hào)獲得的，在30分鐘后分別低47％和19％，而在45分鐘后分別低35％和14％(圖7B)。在70mM KCl和20mM NaCl存在下，120分鐘的溫育過(guò)程中，觀察到少量的陽(yáng)離子猝滅dsDNA-F探針7號(hào)(圖7B)。這種最低的陽(yáng)離子猝滅由包含NaCl所引起，當(dāng)NaCl單獨(dú)存在時(shí)，其導(dǎo)致探針7號(hào)類似的漸進(jìn)式熒光猝滅(數(shù)據(jù)未顯示)。
80mM KCl和10mM NaCl的存在優(yōu)先促進(jìn)了野生型dsDNA靶(SEQ ID NO6)和dsDNA-F探針7號(hào)之間形成完全匹配的dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體，導(dǎo)致與由對(duì)照探針7號(hào)樣品所發(fā)射的熒光比較，在30分鐘、45分鐘和60分鐘溫育后熒光輻射分別降低18％、48％和34％(圖7C)。相比之下，在80mM KCl和10mM NaCl存在下，貫穿整個(gè)120分鐘溫育過(guò)程，1bp錯(cuò)配的dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體(SEQID NO7+探針7號(hào))的形成是非常低效率的，正如與由探針7號(hào)所顯示的比較，采用這些錯(cuò)配的復(fù)合體觀察到的熒光減少了1％至5％所表明(圖7C)。
因此，以接近生理濃度包含諸如KCl和NaCl的單價(jià)陽(yáng)離子促進(jìn)了非變性dsDNA靶和熒光標(biāo)記的dsDNA探針之間形成DNA復(fù)合體。復(fù)合體形成的依據(jù)是同源堿基對(duì)識(shí)別，以可測(cè)量的和顯著大量的復(fù)合體形成發(fā)生在完全匹配的同源雙鏈體鏈之間。室溫下以探針和靶的比為10∶1，在15分鐘至60分鐘的相對(duì)短的溫育期間內(nèi)發(fā)生反應(yīng)。該實(shí)施例中所用的dsDNA靶和dsDNA探針是同源的，GC含量為53％，并且在任何DNA鏈上不含有同型嘌呤和同型嘧啶延伸。本發(fā)明分析利用dsDNA探針，能夠識(shí)別完全匹配的dsDNA序列和那些含有一對(duì)錯(cuò)配堿基的序列。
實(shí)施例8實(shí)施例7中進(jìn)行的分析受到反應(yīng)混合物中加入的單價(jià)陽(yáng)離子的促進(jìn)。此實(shí)施例將證明dsDNA:dsDNA復(fù)合體在二價(jià)陽(yáng)離子存在下的形成速率、穩(wěn)定性和解離速率。反應(yīng)條件與實(shí)施例7中所述的相同，除了KCl和NaCl用各為30mM至40mM的MnCl2和MgCl2替換以外。
對(duì)照dsDNA-F探針7號(hào)樣品在30mM MnCl2和30mM MgCl2(圖8A)或40mM MnCl2和40mM MgCl2(圖8B)存在下，隨著溫育時(shí)間延長(zhǎng)顯示出熒光漸進(jìn)式減少。在10mM MnCl2和10mM MgCl2存在下，該陽(yáng)離子猝滅與采用ssDNA-F探針5號(hào)觀察到的類似(圖6A)。
當(dāng)dsDNA-F探針7號(hào)在30mM MnCl2和30mM MgCl2存在下與50聚體野生型dsDNA靶(SEQ ID NO6)溫育時(shí)，dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體形成是顯而易見(jiàn)的，60分鐘溫育后熒光增加，所述熒光比對(duì)照探針7號(hào)的漸進(jìn)式陽(yáng)離子猝滅高出13％(圖8A)。在30mM MnCl2和30mMMgCl2存在下，SEQ ID NO6和探針7號(hào)溫育75分鐘后，與單獨(dú)由陽(yáng)離子猝滅的探針7號(hào)所獲得的比較，生成的熒光降低81％，這極其顯示復(fù)合體形成(圖8A)。在30mM MnCl2和30mM MgCl2存在下，溫育60分鐘和75分鐘后也形成含有1bp錯(cuò)配的dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO7+探針7號(hào))，與單獨(dú)由陽(yáng)離子猝滅的探針7號(hào)所獲得的比較，生成的熒光分別降低16％和30％(圖8A)。在30mM MnCl2和30mM MgCl2存在下溫育90和120分鐘之后，信號(hào)表示沒(méi)有復(fù)合體形成(圖8A)。90分鐘后，觀察到的熒光水平完全可歸功于陽(yáng)離子猝滅效果(圖8A)。
在40mM MnCl2和40mM MgCl2存在下，含有完全匹配序列的dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO6+探針7號(hào))或含有1bp錯(cuò)配的dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO7+探針7號(hào))所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與單獨(dú)由陽(yáng)離子猝滅的探針7號(hào)所發(fā)射的相比，在60分鐘后分別低17％和高4％，在75分鐘后分別低36％和22％，以及在90分鐘后分別低57％和高0.2％(圖8B)。在40mM MnCl2和40mM MgCl2存在下溫育120分鐘之后，信號(hào)表示沒(méi)有復(fù)合體形成(圖8B)。
加入諸如MnCl2和MgCl2的二價(jià)陽(yáng)離子促進(jìn)了非變性dsDNA靶和熒光標(biāo)記的dsDNA探針之間形成DNA復(fù)合體，從而允許準(zhǔn)確區(qū)分完全匹配的同源序列和那些含有1bp突變的序列。與形成dsDNA:ssDNA復(fù)合體所需的相比較，形成dsDNA:dsDNA復(fù)合體需要約加倍濃度的MnCl2和MgCl2。在二價(jià)陽(yáng)離子存在下比在單價(jià)陽(yáng)離子存在下，dsDNA:dsDNA復(fù)合體的形成速率要慢。一旦形成，二價(jià)陽(yáng)離子誘導(dǎo)的dsDNA:dsDNA復(fù)合體似乎在較短時(shí)間段是穩(wěn)定的。
實(shí)施例9接著研究在單價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子存在下dsDNA:dsDNA復(fù)合體的形成速率、穩(wěn)定性和解離速率。雜交反應(yīng)混合物(40μl)含有下面的成分0.4pmol非變性靶dsDNA，4pmol 5’-熒光素標(biāo)記的dsDNA探針，10mMTris-HCl、pH 7.5和60mM至80mM KCl，10mM至20mM NaCl，30mMMnCl2和30mM MgCl2。反應(yīng)混合物在室溫(21℃)下溫育1分鐘至150分鐘的各種各樣期間。溫育后，將樣品放置在石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射一次，并且檢測(cè)熒光輻射。對(duì)各個(gè)分析樣品以時(shí)間為函數(shù)將熒光強(qiáng)度繪圖。
各種濃度的KCl和NaCl與在30mM MnCl2和30mM MgCl2一起存在導(dǎo)致在對(duì)照dsDNA-F探針7號(hào)的熒光中陽(yáng)離子猝滅(圖9)，其與僅含有二價(jià)陽(yáng)離子所觀察的非常類似(圖8)。包含單價(jià)陽(yáng)離子似乎不影響二價(jià)陽(yáng)離子猝滅dsDNA-F探針。
當(dāng)dsDNA-F探針7號(hào)與50聚體野生型dsDNA靶(SEQ ID NO6)和突變dsDNA靶(SEQ ID NO7)在60mM KCl、20mM NaCl、30mMMnCl2和30mM MgCl2存在下溫育時(shí)，室溫和非變性條件下僅在溫育15分鐘內(nèi)就形成了dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體，并持續(xù)至少150分鐘(圖9A)。在溫育30、45和150分鐘后，觀察到完全匹配的和1bp錯(cuò)配的dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體之間的最大區(qū)別，生成的熒光強(qiáng)度與單獨(dú)由陽(yáng)離子猝滅的探針7號(hào)所發(fā)射的相比，在30分鐘后分別低43％和16％，在45分鐘后分別低38％和16％，以及在150分鐘后分別低65％和1％(圖9A)。
在70mM KCl、20mM NaCl、30mM MnCl2和30mM MgCl2存在下，含有完全匹配序列的dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO6+探針7號(hào))或含有1bp錯(cuò)配的dsDNA:dsDA-F復(fù)合體(SEQ ID NO7+探針7號(hào))產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與單獨(dú)由陽(yáng)離子猝滅的探針7號(hào)所獲得的相比，在60分鐘后分別低17％和1％，在75分鐘后分別低48％和11％，在90分鐘后分別低22％和3％，以及在120分鐘后分別低34％和2％(圖9B)。
在溫育30分鐘和120分鐘之后，含有80mM KCl、10mM NaCl、30mM MnCl2和30mM MgCl2優(yōu)先促進(jìn)了在野生型dsDNA靶(SEQ IDNO6)和dsDNA-F探針7號(hào)之間形成完全匹配的dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體。與陽(yáng)離子猝滅的探針7號(hào)樣品比較，完全匹配的dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體產(chǎn)生的熒光輻射在溫育60分鐘、75分鐘、90分鐘和120分鐘之后分別降低了27％、43％、29％和52％(圖9C)。相比之下，1bp錯(cuò)配的dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO7+探針7號(hào))的形成在80mMKCl、10mM NaCl、30mM MgCl2和30mM MnCl2存在下溫育45分鐘至90分鐘后非常低效，正如與由陽(yáng)離子猝滅的探針7號(hào)所顯示的比較，采用這些錯(cuò)配復(fù)合體觀察到的熒光減少了2％至3％所表明(圖9C)。最低1bp錯(cuò)配的dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體形成在溫育120分鐘后發(fā)生，導(dǎo)致與由陽(yáng)離子猝滅的探針7號(hào)所發(fā)射的相比，熒光降低了14％。
單價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子的同時(shí)存在比單獨(dú)二價(jià)陽(yáng)離子以更快的速率促進(jìn)形成dsDNA:dsDNA復(fù)合體。一旦形成，由兩種陽(yáng)離子促進(jìn)的復(fù)合體比單獨(dú)由單價(jià)陽(yáng)離子或二價(jià)陽(yáng)離子促進(jìn)的復(fù)合體要持續(xù)更長(zhǎng)的時(shí)間。在單價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子均存在下，完全匹配的和1bp錯(cuò)配的dsDNA:dsDNA-F復(fù)合體之間的最大區(qū)別得以觀察更長(zhǎng)的時(shí)間間隔。因此，依據(jù)同源堿基對(duì)識(shí)別，生理濃度的KCl、NaCl和MgCl2優(yōu)先促進(jìn)了完全匹配的同源雙鏈體鏈之間形成復(fù)合體。
實(shí)施例10實(shí)施例3-6表明以序列特異方式在dsDNA靶和ssDNA探針之間形成dsDNA:ssDNA復(fù)合體由諸如單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子的DNA縮合劑促進(jìn)。下文實(shí)施例將研究在也能夠縮合DNA的多價(jià)陽(yáng)離子亞精胺(電荷為+3)的存在下dsDNA:ssDNA復(fù)合體的形成速率、穩(wěn)定性和解離速率。
雜交反應(yīng)混合物(40μl)含有下面的成分0.2pmol非變性靶dsDNA，2pmol 5’-熒光素標(biāo)記的ssDNA探針，10mM Tris-HCl、pH 7.5和1mM亞精胺。反應(yīng)混合物在室溫(21℃)下溫育1分鐘至2小時(shí)的各種期間。溫育后，將樣品放置在石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射一次，并且檢測(cè)熒光輻射。對(duì)各個(gè)分析樣品以時(shí)間為函數(shù)將熒光強(qiáng)度繪圖。
對(duì)照ssDNA-F探針5號(hào)在1mM亞精胺存在下隨著溫育時(shí)間增加顯示出熒光漸進(jìn)式減少(圖10)。這種陽(yáng)離子猝滅與當(dāng)同樣探針在10mMMnCl2和10mM MgCl2存在下溫育時(shí)所觀察到的一樣不明顯，尤其在溫育的前5分鐘內(nèi)(圖6A)。
在1mM亞精胺存在下僅溫育15和30分鐘后，顯示在dsDNA靶(SEQ ID NO6)和ssDNA-F探針5號(hào)之間形成完全互補(bǔ)的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體，與單獨(dú)由陽(yáng)離子猝滅的探針5號(hào)所獲得的比較，生成的熒光分別降低了11％和20％(圖10)。在1mM亞精胺存在下溫育45分鐘后，信號(hào)表示形成了最低的復(fù)合體(圖10)。
包括1mM亞精胺對(duì)形成含有1bp T-G錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO7+探針5號(hào))是高度不利的，正如與溫育15分鐘和30分鐘后由陽(yáng)離子猝滅的探針5號(hào)所觀察到的比較，熒光分別增加了11％和7％所表明(圖10)。包含不完全互補(bǔ)序列的最小復(fù)合體形成在1mM亞精胺存在下僅溫育75分鐘之后出現(xiàn)，而至120分鐘時(shí)消失。
在非變性條件下，加入DNA縮合劑亞精胺促進(jìn)了完全匹配序列之間快速形成dsDNA:ssDNA復(fù)合體，從而允許區(qū)分完全互補(bǔ)的序列和那些含有1bp突變的序列。
實(shí)施例11除了陽(yáng)離子以外還有許多不同介質(zhì)能夠縮合dsDNA。實(shí)施例11顯示在另一種DNA縮合劑乙醇存在下dsDNA:ssDNA復(fù)合體的形成速率、穩(wěn)定性及解離速率。
雜交反應(yīng)混合物(40μl)含有下面的成分0.2pmol非變性靶dsDNA，2pmol 5’-熒光素標(biāo)記的ssDNA探針，10mM Tris-HCl、pH 7.5和10％乙醇。反應(yīng)混合物在室溫(21℃)下溫育1分鐘至90分鐘的各種期間。溫育后，將樣品放置在石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射一次，并且檢測(cè)熒光輻射。對(duì)各個(gè)分析樣品以時(shí)間為函數(shù)將熒光強(qiáng)度繪圖。
與二價(jià)或多價(jià)陽(yáng)離子不同，加入10％乙醇不會(huì)導(dǎo)致由對(duì)照ssDNA-F探針5號(hào)所發(fā)射的熒光猝滅，但實(shí)際上導(dǎo)致探針熒光隨時(shí)間少許增加(圖11)。
10％乙醇的存在優(yōu)先促進(jìn)了野生型dsDNA靶(SEQ ID NO6)和ssDNA-F探針5號(hào)在溫育15分鐘至60分鐘后形成完全互補(bǔ)的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(圖11)。相比之下，1bp T-G錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO7+探針5號(hào))的形成在10％乙醇存在下，在此溫育時(shí)間過(guò)程中非常低效。由完全匹配的和1bp錯(cuò)配的復(fù)合體所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與由探針5號(hào)對(duì)照所發(fā)射的相比，在15分鐘后分別低11％和2％，在30分鐘后分別低12％和1％，在45分鐘后分別低25％和2％，以及在60分鐘后分別低13％和7％(圖11)。在10％乙醇存在下溫育75分鐘后未觀察到顯著的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體形成。
加入低濃度的乙醇促進(jìn)了在非變性dsDNA靶和熒光標(biāo)記的ssDNA探針之間形成DNA復(fù)合體，從而允許區(qū)分完全互補(bǔ)的序列和那些含有1bp突變的序列。
實(shí)施例12實(shí)施例12表明當(dāng)存在陽(yáng)離子DNA嵌入劑YOYO-1時(shí)，本發(fā)明分析可區(qū)分完全互補(bǔ)的dsDNA:ssDNA復(fù)合體和含有可能的各種類型的1bp錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA復(fù)合體。
互補(bǔ)有義和反義15聚體ssDNA探針在DNA合成儀上合成，經(jīng)HPLC純化后，以濃度1pmole/μl溶解在ddH2O中。探針1號(hào)為15聚體ssDNA探針，設(shè)計(jì)成與50聚體野生型靶DNA(SEQ ID NO1)的有義鏈的15個(gè)核苷酸區(qū)段完全互補(bǔ)，氨基酸位置505至510重疊[Nature380，207(1996)]。探針的手性與靶中有義鏈的手性相反或反平行。突變探針(探針8號(hào)至探針16號(hào))的序列與探針1號(hào)相同，除了有1個(gè)堿基突變(下劃線)以外。
探針1號(hào)的序列為5’-CAC CAA AGA TGA TAT-3’。
探針8號(hào)的序列為5’-CAC CAA AGAAGA TAT-3’。
探針9號(hào)的序列為5’-CACGAA AGA TGA TAT-3’。
探針10號(hào)的序列為5’-CAC CAA ACA TGA TAT-3’。
探針11號(hào)的序列為5’-CAC CATAGA TGA TAT-3’。
探針12號(hào)的序列為5’-CAC CAGAGA TGA TAT-3’。
探針13號(hào)的序列為5’-CAC CACAGA TGA TAT-3’。
探針14號(hào)的序列為5’-CAC CAA AGACGA TAT-3’。
探針15號(hào)的序列為5’-CAC CAA AAA TGA TAT-3’。
探針16號(hào)的序列為5’-CACAAA AGA TGA TAT-3’。
探針17號(hào)為15聚體ssDNA探針，設(shè)計(jì)成與50聚體野生型靶DNA(SEQ ID NO1)的反義鏈的15個(gè)核苷酸區(qū)段完全互補(bǔ)，氨基酸位置505至510重疊[Nature 380，207(1996)]。探針的手性與靶中反義鏈的手性相反或反平行。突變探針(探針18號(hào)至探針26號(hào))的序列與探針17號(hào)相同，除了有1個(gè)堿基突變(下劃線)以外。
探針17號(hào)的序列為5’-ATA TCA TCT TTG GTG-3’。
探針18號(hào)的序列為5’-ATA TCTTCT TTG GTG-3’。
探針19號(hào)的序列為5’-ATA TCA TCT TTCGTG-3’。
探針20號(hào)的序列為5’-ATA TCA TGT TTG GTG-3’。
探針21號(hào)的序列為5’-ATA TCA TCTATG GTG-3’。
探針22號(hào)的序列為5’-ATA TCA TCTCTG GTG-3’。
探針23號(hào)的序列為5’-ATA TCA TCTGTG GTG-3’。
探針24號(hào)的序列為5’-ATA TCGTCT TTG GTG-3’。
探針25號(hào)的序列為5’-ATA TCA TTT TTG GTG-3’。
探針26號(hào)的序列為5’-ATA TCA TCT TTTGTG-3’。
雜交反應(yīng)混合物(40μl)含有下面的成分2pmol靶dsDNA，2pmolssDNA探針，0.5×TBE和500nM DNA嵌入劑YOYO-1。反應(yīng)混合物在室溫(21℃)下溫育5分鐘，無(wú)需對(duì)dsDNA靶進(jìn)行預(yù)變性。將樣品放置在石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光輻射強(qiáng)度繪圖。
將50聚體野生型非變性的dsDNA靶(SEQ ID NO1)與15聚體野生型反義ssDNA探針1號(hào)以及各種各樣的15聚體1堿基突變的反義ssDNA探針(探針8號(hào)至探針16號(hào))反應(yīng)，這會(huì)生成每種可能的1bp錯(cuò)配。不出所料，最高的熒光輻射強(qiáng)度由dsDNA:ssDNA復(fù)合體生成，所述復(fù)合體的組成為完全互補(bǔ)序列(SEQ ID NO1+探針1號(hào))(圖12A和12B)。導(dǎo)致1bp A-A錯(cuò)配(SEQ ID NO1+探針8號(hào))、1bp G-G錯(cuò)配(SEQ ID NO1+探針9號(hào))、1bp C-C錯(cuò)配(SEQ ID NOl+探針10號(hào))、1bp T-T錯(cuò)配(SEQ ID NO1+探針11號(hào))、1bp T-G錯(cuò)配(SEQ ID NO1+探針12號(hào))、1bp T-C錯(cuò)配(SEQ ID NO1+探針13號(hào))、1bp A-C錯(cuò)配(SEQ ID NO1+探針14號(hào))、1bp C-A錯(cuò)配(SEQ ID NO1+探針15號(hào))和1bp G-A錯(cuò)配(SEQ ID NO1+探針16號(hào))的dsDNA:ssDNA復(fù)合體產(chǎn)生的熒光輻射強(qiáng)度與由完全匹配的dsDNA:ssDNA復(fù)合體所發(fā)射的相比分別低63％、66％、50％、47％、49％、79％、57％、51％和71％(圖12A和12B)。
三重鏈分析的評(píng)價(jià)也是通過(guò)將50聚體野生型非變性dsDNA靶(SEQ ID NO1)與15聚體野生型有義ssDNA探針17號(hào)和各種各樣的15聚體1堿基突變的有義ssDNA探針(探針18號(hào)至探針26號(hào))反應(yīng)，這會(huì)產(chǎn)生每種可能的1bp錯(cuò)配。含有有義鏈探針(圖12C和12D)的完全互補(bǔ)的dsDNA:ssDNA三重鏈復(fù)合體(SEQ ID NO1+探針17號(hào))以與含有反義鏈探針(圖12A和12B)的完全互補(bǔ)的三重鏈復(fù)合體(SEQ IDNO1+探針1號(hào))相似的效力形成。導(dǎo)致1bp T-T錯(cuò)配(SEQ ID NO1+探針18號(hào))、1bp C-C錯(cuò)配(SEQ ID NO1+探針19號(hào))、1bp G-G錯(cuò)配(SEQ ID NO1+探針20號(hào))、1bp A-A錯(cuò)配(SEQ ID NO1+探針21號(hào))、1bp C-A錯(cuò)配(SEQ ID NO1+探針22號(hào))、1bp G-A錯(cuò)配(SEQ ID NO1+探針23號(hào))、1bp G-T錯(cuò)配(SEQ ID NO1+探針24號(hào))、1bp T-G錯(cuò)配(SEQ ID NO1+探針25號(hào))和1bp T-C錯(cuò)配(SEQ ID NO1+探針26號(hào))的dsDNA:ssDNA復(fù)合體所產(chǎn)生的熒光輻射強(qiáng)度與由完全匹配的dsDNA:ssDNA復(fù)合體所發(fā)射的相比分別低63％、67％、76％、59％、54％、57％、59％、56％和82％(圖12C和12D)。
在各種各樣的1bp錯(cuò)配之間所觀察的熒光輻射強(qiáng)度中的可變性依賴于突變?nèi)劓溞蛄兄蠫C百分含量的變化，而更多依賴于特定堿基對(duì)錯(cuò)配(圖12)。圖12的結(jié)果證實(shí)了當(dāng)反義或有義ssDNA探針與非變性dsDNA靶在DNA解縮合劑YOYO-1存在下反應(yīng)時(shí)，三重鏈分析以極高的準(zhǔn)確性鑒定所有可能的1bp錯(cuò)配的可靠性。
當(dāng)本發(fā)明參照其特定的實(shí)施例已詳細(xì)加以描述后，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的情況下，本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員可作出各種各樣的變化和修改將是一目了然的。
序列表<110>英詹尼斯公司(INGENEUS CORPORATION)<120>核酸三鏈體和四鏈體形成(NUCLEIC ACID TRIPLEX AND QUADRUPLEX FORMATION)<130>SCTO33717-47<140>09/885,731<141>2001-06-20<150>09/664,827<151>2000-09-19<150>09/613,263<151>2000-07-10<150>09/468,679<151>1999-12-21<160>15<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10<400>1tggcaccatt aaagaaaata tcatctttgg tgtttcctat gatgaatata 50<210>2<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10的序列的變體
<400>2tggcaccatt aaagaaaata tcgtctttgg tgtttcctat gatgaatata 50<210>3<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10的序列的變體<400>3tggcaccatt aaagaaaata tactctttgg tgtttcctat gatgaatata 50<210>4<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10的序列的變體<400>4tggcaccatt aaagaaaata tacgctttgg tgtttcctat gatgaatata 50<210>5<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10的序列的變體<400>5tggcaccatt aaagaaaata tcattggtgt ttcctatgat gaatata 47<210>6<211>50<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10的序列的變體<400>6gagcaccatg acagacactg tcatctctgg tgtgtcctac gatgactctg 50<210>7<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10的序列的變體<400>7gagcaccatg acagacactg tcatctttgg tgtgtcctac gatgactctg 50<210>8<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10的序列的變體<400>8gagcaccatg acagacactg tcgtctctgg tgtgtcctac gatgactctg 50<210>9<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10的序列的變體<400>9gagcaccatg acagacactg tcttctctgg tgtgtcctac gatgactctg 50
<210>10<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10的序列的變體<400>10gagcaccatg acagacactg tcatccctgg tgtgtcctac gatgactctg 50<210>11<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10的序列的變體<400>11gagcaccatg acagacactg tcatcgctgg tgtgtcctac gatgactctg 50<210>12<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10的序列的變體<400>12gagcaccatg acagacactg tactctctgg tgtgtcctac gatgactctg 50<210>13<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10的序列的變體<400>13
gagcaccctc ccaggcacgg tcgtccctgg tgcgacctcc gacgagcgtg 50<210>14<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10的序列的變體<400>14gagcaccctc ccaggcacgg tcatccctgg tgcgacctcc gacgagcgtg 50<210>15<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10的序列的變體<400>15gagcaccctc ccaggcacgg tattccctgg tgcgacctcc gacgagcgtg 50
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生核酸多鏈體的方法，所述方法包括下列步驟1)產(chǎn)生含有水、沃森—克里克雙鏈體、足夠數(shù)目的單鏈混合堿基序列分子的混合物以形成多鏈體，所述多鏈體包括沃森—克里克雙鏈體以及含有提高多鏈體形成速率或量的加速劑，所述多鏈體為三鏈體或四鏈體，其中一種或多種所述單鏈分子加以選擇，以便如果在多鏈體中，它們分別與多鏈體的其他所有鏈通過(guò)堿基配對(duì)法則而相關(guān)，所述法則或者是沃森—克里克堿基配對(duì)法則或者是同源結(jié)合堿基配對(duì)法則；以及2)將所述混合物溫育以使多鏈體形成，所述多鏈體的各條鏈通過(guò)堿基配對(duì)法則與多鏈體的其他所有鏈相關(guān)；條件是，在多鏈體內(nèi)，步驟(1)中加入的沃森—克里克雙鏈體為G-C含量在10％-90％之間的雜多聚體。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所產(chǎn)生的多鏈體為三鏈體，在步驟(1)，單鏈分子的足夠數(shù)目為1，以及在步驟(2)，形成三鏈體。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中雙鏈體基本上保持其雙螺旋結(jié)構(gòu)，以及單鏈分子位于雙螺旋結(jié)構(gòu)的溝中。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中單鏈分子與雙鏈體的一條鏈根據(jù)沃森—克里克堿基配對(duì)法則相關(guān)，而與雙鏈體的第二條鏈根據(jù)同源結(jié)合堿基配對(duì)法則相關(guān)。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中雙鏈體基本上保持其雙螺旋結(jié)構(gòu)，以及單鏈分子位于雙螺旋結(jié)構(gòu)的溝中。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中在多鏈體中，步驟(1)中加入的沃森—克里克雙鏈體為G-C含量介于10％和90％之間的雜多聚體，以及其中嘌呤—嘧啶二聚體和嘧啶—嘌呤二聚體的組合頻率超過(guò)25％。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(1)和(2)利用細(xì)胞中沒(méi)有的核酸鏈和/或雙鏈體進(jìn)行。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(2)的操作無(wú)需蛋白的幫助。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(1)，添加水從而以體積計(jì)其占到混合物終體積的至少50％。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(1)，添加水從而以體積計(jì)其占到混合物終體積的至少80％。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(1)，添加水從而以體積計(jì)其為加到混合物中的全部液體。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(2)在水溶液的冷凍溫度或高于此溫度但不高于85℃下進(jìn)行。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中步驟(2)在等于或介于5-30℃下進(jìn)行。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中步驟(2)在等于或介于15-25℃下進(jìn)行。
15.權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(1)，陽(yáng)離子作為加速劑加入。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述陽(yáng)離子為Na+，以濃度50mM-125mM提供。
17.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述陽(yáng)離子選自以濃度10mM-45mM提供的Mn+2、以濃度10mM-45mM提供的Mg+2和以濃度20mM提供的Ni+2。
18.權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(1)，嵌入劑作為加速劑加入。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中嵌入劑為熒光嵌入劑。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中熒光嵌入劑選自YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3、TOTO-3、POPO-1、BOBO-1、POPO-3、BOBO-3、LOLO-1、JOJO-1、花菁二聚體、YO-PRO-1、TO-PRO-1、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5、PO-PRO-1、BO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-3、LO-PRO-1、JO-PRO-1、花菁單體、溴化乙錠、乙錠同型二聚體-1、乙錠同型二聚體-2、乙錠衍生物、吖啶、吖啶橙、吖啶衍生物、乙錠吖啶異型二聚體、單疊氮化乙錠、碘化丙錠、SYTO染料、SYBR綠1、SYBR染料、皮可綠、SYTOX染料以及7-氨基放線菌素D。
21.權(quán)利要求1所述的方法，其中加速劑為非嵌入熒光團(tuán)。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中非嵌入熒光團(tuán)選自生物素、若丹明、Alexa染料、BODIPY染料、生物素結(jié)合物、硫醇活性探針、熒光素和衍生物，所述衍生物包括但不限于籠型探針、Oregon綠、若丹明綠、QSY染料。
23.權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(1)，加速劑為嵌入劑，其結(jié)合于沃森—克里克雙鏈體的小溝和/或大溝。
24.權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(1)，25℃時(shí)的加速劑為液體。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中在步驟(1)，加速劑為一種溶于水的有機(jī)液體。
26.權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(1)，添加的加速劑為依照沃森—克里克雙鏈體的縮合劑。
27.權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(1)，添加的加速劑為依照沃森—克里克雙鏈體的解縮合劑。
28.一種檢測(cè)三鏈體的方法，所述方法包括權(quán)利要求2所述的方法，并進(jìn)一步包括其中檢測(cè)三鏈體的附加步驟(3)。
29.權(quán)利要求1所述的方法，其中所產(chǎn)生的多鏈體為四鏈體，在步驟(1)，沃森—克里克雙鏈體為第一沃森—克里克雙鏈，以及在步驟(1)，單鏈分子的足夠數(shù)目為2，這些單鏈分子位于第二沃森—克里克雙鏈體中，以及在步驟(2)，四鏈體從所述第一和第二雙鏈體中形成。優(yōu)選地，步驟(1)利用兩個(gè)已位于第二沃森—克里克雙鏈體中的單鏈分子。
30.一種檢測(cè)四鏈體的方法，所述方法包括權(quán)利要求29所述的方法，并進(jìn)一步包括其中檢測(cè)四鏈體的附加步驟(3)。
31.一種包括單鏈探針結(jié)合于雙鏈核酸靶上的三鏈體，其中所述探針包括雜多聚體核酸或雜聚體核酸類似物，以及所述三鏈體的所有堿基三聯(lián)體選自A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和C-G-C。
32.權(quán)利要求31所述的三鏈體，其中雙鏈核酸靶基本上保持其雙螺旋結(jié)構(gòu)，以及雜多聚體核酸或其類似物位于雙螺旋結(jié)構(gòu)的溝中。
33.權(quán)利要求31所述的三鏈體，其中雜多聚體核酸及其類似物的G-C含量分別介于10％-90％之間。
34.權(quán)利要求33所述的三鏈體，其中雙鏈核酸靶基本上保持其雙螺旋結(jié)構(gòu)，以及雜多聚體核酸或其類似物位于雙螺旋結(jié)構(gòu)的溝中。
35.一種四鏈體，其包括含有第一核堿基序列的第一條鏈；含有第二核堿基序列的第二條鏈，其中所述第二條鏈與所述第一條鏈通過(guò)沃森—克里克鍵結(jié)合；含有第三核堿基序列的第三條鏈；以及含有第四核堿基序列的第四條鏈，其中所述第四條鏈與所述第三條鏈通過(guò)沃森—克里克鍵結(jié)合。
36.權(quán)利要求35所述的四鏈體，其中所述四條鏈分別為G-C含量介于10％-90％之間的雜多聚體。
37.權(quán)利要求35所述的四鏈體，其中(1)第二和第四條鏈以平行3’到5’的方向排列，并且這2條鏈之間根據(jù)同源堿基配對(duì)法則結(jié)合，或(2)第一和第三條鏈以平行5’到3’的方向排列，并且這2條鏈之間根據(jù)同源堿基配對(duì)法則結(jié)合，或(3)第二和第四條鏈以平行3’到5’的方向排列，并且所述第二和第四條鏈之間根據(jù)同源堿基配對(duì)法則結(jié)合，此外第一和第三條鏈以平行5’到3’的方向排列，并且所述第一和第三條鏈之間根據(jù)同源堿基配對(duì)法則結(jié)合。
38.權(quán)利要求37所述的四鏈體，其中所述四條鏈分別為G-C含量介于10％-90％之間的雜多聚體。
39.權(quán)利要求35所述的四鏈體，其中(1)第二和第四條鏈以平行3’到5’的方向排列，并且這2條鏈之間根據(jù)沃森—克里克堿基配對(duì)法則結(jié)合，或(2)第一和第三條鏈以平行5’到3’的方向排列，并且這2條鏈之間根據(jù)沃森—克里克堿基配對(duì)法則結(jié)合，或(3)第二和第四條鏈以平行3’到5’的方向排列，并且所述第二和第四條鏈之間根據(jù)沃森—克里克堿基配對(duì)法則結(jié)合，此外第一和第三條鏈以平行5’到3’的方向排列，并且所述第一和第三條鏈之間根據(jù)沃森—克里克堿基配對(duì)法則結(jié)合。
40.權(quán)利要求39所述的四鏈體，其中所述四條鏈分別為G-C含量介于10％-90％之間的雜多聚體。
41.權(quán)利要求35所述的四鏈體，其中(1)第一和第四條鏈分別以反平行5’到3’和3’到5’的方向排列，并且這2條鏈之間根據(jù)沃森—克里克堿基配對(duì)法則結(jié)合，或(2)第二和第三條鏈分別以反平行3’到5’和5’到3’的方向排列，并且這2條鏈之間根據(jù)沃森—克里克堿基配對(duì)法則結(jié)合，或(3)第一和第四條鏈分別以反平行5’到3’和3’到5’的方向排列，并且所述第一和第四條鏈之間根據(jù)沃森—克里克堿基配對(duì)法則結(jié)合，此外第二和第三條鏈分別以反平行3’到5’和5’到3’的方向排列，并且所述第二和第三條鏈之間根據(jù)沃森—克里克堿基配對(duì)法則結(jié)合。
42.權(quán)利要求41所述的四鏈體，其中所述四條鏈分別為G-C含量介于10％-90％之間的雜多聚體。
43.權(quán)利要求35所述的四鏈體，其中(1)第一和第四條鏈分別以反平行5’到3’和3’到5’的方向排列，并且這2條鏈之間根據(jù)同源堿基配對(duì)法則結(jié)合，或(2)第二和第三條鏈分別以反平行3’到5’和5’到3’的方向排列，并且這2條鏈之間根據(jù)同源堿基配對(duì)法則結(jié)合，或(3)第一和第四條鏈分別以反平行5’到3’和3’到5’的方向排列，并且所述第一和第四條鏈之間根據(jù)同源堿基配對(duì)法則結(jié)合，此外第二和第三條鏈分別以反平行3’到5’和5’到3’的方向排列，并且所述第二和第三條鏈之間根據(jù)同源堿基配對(duì)法則結(jié)合。
44.權(quán)利要求43所述的四鏈體，其中所述四條鏈分別為G-C含量介于10％-90％之間的雜多聚體。
45.權(quán)利要求35所述的四鏈體，其中所述第一條鏈的各個(gè)互作堿基既與所述第三條鏈上的相鄰堿基又與所述第四條鏈上的堿基特異性相互作用，所述第四條鏈上的堿基與所述第三條鏈堿基結(jié)合。
46.權(quán)利要求45所述的四鏈體，其中所述四條鏈分別為G-C含量介于10％-90％之間的雜多聚體。
47.權(quán)利要求35所述的四鏈體，其中所述第二條鏈的各個(gè)互作堿基既與所述第四條鏈上的相鄰堿基又與所述第三條鏈上的堿基特異性相互作用，所述第三條鏈上的堿基與所述第四條鏈堿基結(jié)合。
48.權(quán)利要求47所述的四鏈體，其中所述四條鏈分別為G-C含量介于10％-90％之間的雜多聚體。
49.權(quán)利要求2所述的方法，其進(jìn)一步包括其中檢測(cè)三鏈體的步驟(3)。
50.權(quán)利要求29所述的方法，其進(jìn)一步包括其中檢測(cè)四鏈體的附加步驟(3)。
51.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述方法區(qū)分完全堿基配對(duì)法則匹配、單堿基錯(cuò)配或缺失以及2-堿基錯(cuò)配或缺失，并且區(qū)分三鏈體中的雙鏈體和單鏈分子。
52.權(quán)利要求50所述的方法，其中所述方法區(qū)分完全堿基配對(duì)法則匹配、單堿基錯(cuò)配或缺失以及2-堿基錯(cuò)配或缺失，并且區(qū)分第一和第二沃森—克里克雙鏈體。
53.一種檢測(cè)三鏈體的方法，所述方法包括提供靶雙鏈核酸或含有靶序列的核酸類似物，其中所述靶序列含有至少一個(gè)嘌呤堿基和至少一個(gè)嘧啶堿基；提供含有核酸序列或核酸類似物序列的探針；提供加速劑；向介質(zhì)中加入所述探針、所述靶序列和所述加速劑以提供含有三鏈體復(fù)合體的測(cè)試樣品，所述復(fù)合體含有結(jié)合到所述靶序列上的所述探針，其中所述復(fù)合體的所有堿基三聯(lián)體選自A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和C-G-C；用激發(fā)輻射照射所述測(cè)試樣品以使測(cè)試樣品發(fā)射熒光輻射；檢測(cè)所述熒光輻射的強(qiáng)度，其中所述強(qiáng)度與所述探針和所述靶序列之間的結(jié)合親和力相關(guān)；以及從所述強(qiáng)度中確定所述探針和所述靶序列之間的匹配程度；其中所述方法為勻相分析，其進(jìn)行無(wú)需在所述靶序列或所述探針上提供信號(hào)猝滅劑。
54.一種檢測(cè)三鏈體的方法，所述方法包括提供靶核酸或含有靶序列的核酸類似物，其中所述靶序列含有至少一個(gè)嘌呤堿基和至少一個(gè)嘧啶堿基；提供含有核酸序列或核酸類似物序列的雙鏈探針；提供雜交加速劑；向介質(zhì)中加入所述探針、所述靶和所述雜交加速劑以提供含有沃森—克里克三鏈體的測(cè)試樣品，所述三鏈體含有結(jié)合到所述靶序列上的所述探針；用激發(fā)輻射照射所述測(cè)試樣品以使測(cè)試樣品發(fā)射熒光輻射；檢測(cè)所述熒光輻射的強(qiáng)度，其中所述強(qiáng)度與所述探針和所述靶序列之間的結(jié)合親和力相關(guān)；以及從所述強(qiáng)度中確定所述探針和所述靶序列之間的匹配程度；其中所述方法為勻相分析，其進(jìn)行無(wú)需在所述靶序列或所述探針上提供信號(hào)猝滅劑。
55.一種檢測(cè)四鏈體的方法，所述方法包括提供靶核酸或含有靶序列的核酸類似物，其中所述靶序列含有至少一個(gè)嘌呤堿基和至少一個(gè)嘧啶堿基；提供含有核酸序列或核酸類似物序列的雙鏈探針；提供雜交加速劑；向介質(zhì)中加入所述探針、所述靶和所述雜交加速劑以提供含有沃森—克里克四鏈體的測(cè)試樣品，所述四鏈體含有結(jié)合到所述靶序列上的所述探針；用激發(fā)輻射照射所述測(cè)試樣品以使測(cè)試樣品發(fā)射熒光輻射；檢測(cè)所述熒光輻射的強(qiáng)度，其中所述強(qiáng)度與所述探針和所述靶序列之間的結(jié)合親和力相關(guān)；以及從所述強(qiáng)度中確定所述探針和所述靶序列之間的匹配程度；其中所述方法為勻相分析，其進(jìn)行無(wú)需在所述靶序列或所述探針上提供信號(hào)猝滅劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了雜多聚體三鏈體和四鏈體及其制備方法；諸如陽(yáng)離子的加速劑在產(chǎn)生它們上的應(yīng)用；熒光嵌入劑和熒光探針結(jié)合的非嵌入劑在檢測(cè)它們上的應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N21/78GK1533441SQ02812410
公開(kāi)日2004年9月29日 申請(qǐng)日期2002年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月20日
發(fā)明者格倫·H·埃里克森, 亞斯曼·I·戴克斯, 伊萬(wàn)娜·坎迪奇, 皮埃爾·皮卡德, I 戴克斯, 坎迪奇, 皮卡德, 格倫 H 埃里克森 申請(qǐng)人:英詹尼斯公司