一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明為一種腺嘌呤鄰位增強(qiáng)催化活性且在高溫下具有高催化活性的新型嗜熱四元g四鏈體dna酶及其制備方法。

二、

背景技術(shù)：

由于蛋白質(zhì)對(duì)溫度敏感，穩(wěn)定性差，蛋白酶在應(yīng)用上受到限制。尋找、發(fā)現(xiàn)能夠在極端環(huán)境如高溫等條件下具有高催化能力、高穩(wěn)定性的酶具有重要意義。目前，大多數(shù)人工合成的具有催化活性的納米粒子，如au-sio2等，已顯示比蛋白酶更好的穩(wěn)定性。但這類(lèi)材料合成過(guò)程復(fù)雜，形貌要求嚴(yán)格，容易聚集。近年來(lái)，具有催化活性的dna模擬酶受到廣泛關(guān)注。它可由富含g堿基的dna序列形成分子內(nèi)g四鏈體后，簡(jiǎn)單地結(jié)合血紅素(hemin)生成，但催化活性較低。通過(guò)加入外源性促進(jìn)劑或在dna序列的末端修飾胞嘧啶等基團(tuán)可有效地提高其催化活性。然而，分子內(nèi)g四鏈體熱穩(wěn)定性差，形成的dna酶無(wú)法在高溫下發(fā)揮其催化功能。由四條鏈形成的四元g四鏈體具有很好的熱穩(wěn)定性，但由于g平面的堆積作用，抑制了hemin和四元g四鏈體的結(jié)合，導(dǎo)致其催化活性低。因而，dna模擬酶在高溫下的催化作用鮮有報(bào)道。

本發(fā)明在富含g堿基的dna序列的末端修飾腺嘌呤，利用銨離子先生成四元g四鏈體結(jié)構(gòu)，與hemin結(jié)合形成四元g四鏈體dna酶。鄰位上的腺嘌呤能夠顯著提高dna酶的催化活性，同時(shí)保留了四元g四鏈體的熱穩(wěn)定性。這種dna酶合成方法簡(jiǎn)單、催化活性高、熱穩(wěn)定性好、便于保存，在工業(yè)應(yīng)用上具有很大的應(yīng)用前景。

三、

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的內(nèi)容是：在富含g堿基的dna序列的兩端修飾腺嘌呤，在含150mm銨離子的緩沖液中通過(guò)95℃退火5min形成四元g四鏈體結(jié)構(gòu)，然后將該結(jié)構(gòu)和血紅素混合，形成嗜熱四元g四鏈體dna酶。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

(1)如圖1所示，在富含4，5，6或7個(gè)g的dna序列兩端修飾a堿基，將其在含150mm銨離子的緩沖液中95℃退火5分鐘，冷卻至室溫，形成四元g四鏈體結(jié)構(gòu)。

(2)將形成的四元g四鏈體和hemin混合，在室溫下溫育1小時(shí)，形成嗜熱四元g四鏈體dna酶(圖2)。

(3)通過(guò)程序調(diào)控反應(yīng)液的溫度(25-95℃)，利用dna酶催化h2o2-abts(2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)反應(yīng)，用分光光度法監(jiān)測(cè)其不同溫度下的催化活性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)：

本發(fā)明將腺嘌呤修飾在富g堿基序列的末端，形成的四元g四鏈體結(jié)合hemin構(gòu)建嗜熱四元g四鏈體dna酶，鄰位上的腺嘌呤能夠顯著提高dna酶的催化活性，同時(shí)又保留了四元g四鏈體結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性。相對(duì)于現(xiàn)有dna酶，具有以下特點(diǎn)：

(1)該dna酶具有合成過(guò)程簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、熱穩(wěn)定性好、易于保存的優(yōu)點(diǎn)。

(2)該dna酶在寬范圍的溫度下具有高的催化活性，尤其是在高于75℃的溫度下。

(3)75℃下10小時(shí)，能夠保持50％以上的活性，18小時(shí)后該酶顯示接近室溫的活性；95℃下5分鐘，活性沒(méi)有變化，1.5小時(shí)后能夠保持50％以上的活性，4小時(shí)后該酶顯示接近室溫的活性。

四、附圖說(shuō)明

圖1.用末端修飾腺嘌呤的富g堿基序列(5個(gè)g為例)構(gòu)建四元g四鏈體結(jié)構(gòu)的示意圖

圖2.嗜熱四元g四鏈體dna酶的形成以及催化反應(yīng)示意圖

五、具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：結(jié)合附圖1，說(shuō)明四元g四鏈體結(jié)構(gòu)的形成

兩端修飾腺嘌呤的富含g堿基的dna序列，在含有150mm銨離子的tris-hcl緩沖液中(0.01m緩沖液，ph7.0)95℃退火，5分鐘后冷卻至室溫，形成四元g四鏈體結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例2：結(jié)合附圖2，說(shuō)明嗜熱四元g四鏈體dna酶的形成及其在高溫下催化h2o2-abts的反應(yīng)。

(1)酶溶液的制備：將形成的四元g四鏈體結(jié)構(gòu)和hemin混合在含0.05％tritonx-100和1％dmso的0.01mtris-hcl緩沖液(ph7.0)中，最終濃度分別為0.86μm和1.72μm，室溫溫育1小時(shí)。

(2)控制酶溶液的溫度在25-95℃之間，加入1.28mmh2o2和1.28mmabts反應(yīng)5分鐘，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)其酶活性，研究酶的耐高溫性能。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種腺嘌呤鄰位增強(qiáng)催化活性且在高溫下具有高催化活性的新型嗜熱四元G四鏈體DNA酶。首先在富含G堿基的DNA序列的兩端修飾腺嘌呤，在含150mM銨離子的緩沖液中，95℃退火5min，形成四元G四鏈體結(jié)構(gòu)。然后將該結(jié)構(gòu)和血紅素混合，形成DNA酶。通過(guò)程序控制反應(yīng)體系的溫度(25?95℃)，監(jiān)測(cè)其催化活性，證明該酶在高溫下的催化性能：75℃下10小時(shí)，能夠保持50％以上的活性，18小時(shí)后該酶顯示接近室溫的活性；95℃下5分鐘，活性沒(méi)有變化，1.5小時(shí)后能夠保持50％以上的活性，4小時(shí)后該酶顯示接近室溫的活性。該嗜熱四元G四鏈體DNA酶制備簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，熱穩(wěn)定性好，便于儲(chǔ)存，具有一定的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：周俊;鞠熀先;郭悅?cè)A;陳杰林
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：2017.06.21
技術(shù)公布日：2017.09.01