專利名稱：一種核/殼型超順磁性復(fù)合微粒及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核/殼型超順磁性復(fù)合微粒及其制備方法與應(yīng)用。具體來說，本發(fā)明涉及一種可標(biāo)記核酸、抗原、抗體、酶、多肽、多糖、親和素或鏈親和素、細(xì)胞等生物及非生物材料的核/殼型超順磁性復(fù)合微粒及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明的核/殼型超順磁性復(fù)合微?？勺鳛闃?biāo)記物應(yīng)用于多種生物及非生物分子的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
納米級(jí)磁性微粒如四氧化三鐵等具有超順磁性和磁響應(yīng)性，這使其分離過程可以通過一個(gè)釹鐵硼永磁材料提供的磁場(chǎng)反復(fù)操作而不聚集，目前包覆合成高分子、生物大分子和無機(jī)材料的超順磁性納米微粒已廣泛地應(yīng)用于親和層析、細(xì)胞分選，核酸與蛋白質(zhì)的分離與純化，靶向治療等生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。同樣，由于巰基化的寡核苷酸探針或抗體很容易被修飾于納米金、銀表面，納米金、銀在核酸及免疫檢測(cè)等領(lǐng)域的應(yīng)用也廣為人知。美國西北大學(xué)的Mirkin等人自1996年以來，在用納米金微粒作為核酸檢測(cè)中的報(bào)告基團(tuán)方面做了大量研究，并應(yīng)用于DNA芯片檢測(cè)技術(shù)中。武漢大學(xué)龐代文等在CN1339609 A中公開了納米微粒標(biāo)記基因探針及其制備方法和應(yīng)用，據(jù)稱這種探針尤其適用于低集成度診斷型基因芯片領(lǐng)域。但目前還未見有將納米級(jí)磁性微粒和金、銀微粒這兩種功能材料的特性相結(jié)合的產(chǎn)品。
崔亞麗等人曾發(fā)表“核/殼型Fe3O4/Au超順磁性微粒的制備及機(jī)理”(《中國科學(xué)(B輯)》，2001.8，第31卷第4期，第319～324頁)的研究論文，其中對(duì)核/殼型Fe3O4/Au超順磁性微粒及其制備機(jī)理作了探討，但對(duì)核/殼型超順磁性微粒僅只提及Fe3O4/Au復(fù)合微粒，而且并未詳細(xì)公開該材料的具體特征及其制備時(shí)的具體反應(yīng)條件，而且也未提及該材料可實(shí)際應(yīng)用的生物活性物質(zhì)表面修飾。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可標(biāo)記核酸、抗原、抗體、酶、多肽、多糖、親和素或鏈親和素、細(xì)胞之類生物材料并可實(shí)際應(yīng)用于生物活性物質(zhì)表面修飾的核/殼型超順磁性復(fù)合微粒，并提供一種制備該復(fù)合微粒的方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的是將上述復(fù)合微粒作為報(bào)告基團(tuán)應(yīng)用于寡核苷酸芯片、核酸檢測(cè)、抗原-抗體免疫學(xué)檢測(cè)及其它生物材料檢測(cè)中。
上述所要解決的技術(shù)問題通過本發(fā)明提供的核/殼型超順磁性復(fù)合微粒得以實(shí)現(xiàn)，該復(fù)合微粒由核心部分和包覆于核心部分表面上的外殼部分組成，所述核心部分由磁性材料構(gòu)成，所述外殼部分由貴金屬材料構(gòu)成，其特征在于，所述微粒的平均直徑為0.05～50μm，以其總重量為準(zhǔn)計(jì)，所述核心部分占30～70％，所述外殼部分占30～70％，所述核心部分由Fe3O4、γ-Fe2O3或鐵的其他氧化物磁性微粒構(gòu)成，或者由三價(jià)鐵與二價(jià)錳、鎳、鋅或銅類似金屬的正鐵酸鹽磁性微粒構(gòu)成，所述外殼部分由單質(zhì)金或銀構(gòu)成，所述復(fù)合微粒在水中具有良好的懸浮穩(wěn)定性，而且對(duì)外磁場(chǎng)具有良好磁響應(yīng)性。
上述所要解決的技術(shù)問題還借助本發(fā)明提供的核/殼型超順磁性復(fù)合微粒制備得以實(shí)現(xiàn)，該方法包括下列步驟a.用化學(xué)共沉淀法制備所述核心部分磁性微粒；b.用化學(xué)還原法沉積金或銀，使之包覆磁性微粒，其中所用還原劑選自鹽酸羥胺或檸檬酸三鈉。
優(yōu)選的是，本發(fā)明方法包括下列步驟a.在攪拌下將Fe(II)鹽、Mn(II)鹽、Ni(II)鹽、Zn(II)鹽或Cu(II)鹽中一種鹽的水溶液或其混合物與Fe(III)鹽水溶液以1∶2～1∶4的摩爾比混合均勻后，加入濃度為1～6mol/L的氫氧化鈉水溶液或濃度為30％(重量)的氨水，調(diào)節(jié)混合物的pH為10～13，20℃下快速攪拌20～60分鐘，然后升溫至60～70℃，并繼續(xù)攪拌孵育30～60分鐘，在外磁場(chǎng)中分離出平均粒徑為15～30nm的晶態(tài)超順磁性微粒沉淀物，并用二次蒸餾水反復(fù)洗滌直至得到中性的磁性微粒，再用二次蒸餾水將磁性微粒稀釋定容成磁性流體，其中固形物的含量為5～20mg/ml，再將其稀釋后作為種子用于磁性復(fù)合微粒的制備；b.在步驟a所得磁性納米粒子的懸浮液中，加入濃度為0.01～1％的Au(III)鹽溶液或濃度為0.01～1％的Ag(I)鹽溶液50～500ml，振搖30分鐘，使Au(III)或Ag(I)離子在磁性納米粒子表面充分吸附，然后加入15～40ml濃度為40mmol/L的還原劑鹽酸羥胺或檸檬酸三鈉，作用5～40分鐘后，再加1～10ml濃度為1％的Au(III)鹽溶液或濃度為1％的Ag(I)鹽溶液，振搖10分鐘，被還原的納米級(jí)金或銀包覆于磁性納米微粒表面上，形成核/殼結(jié)構(gòu)的超順磁性復(fù)合微粒，磁性分離，二次蒸餾水反復(fù)洗滌。
更優(yōu)選的是，在步驟a的反應(yīng)介質(zhì)中添加表面活性劑聚乙二醇，并控制pH值在7左右，以使所產(chǎn)生磁性納米微粒的平均直徑為15～30nm。
本發(fā)明核/殼型超順磁性復(fù)合微?？捎脕順?biāo)記核酸、寡核苷酸探針、抗原、抗體、酶、多肽、多糖、親和素或鏈親和素、細(xì)胞等生物及非生物材料。
因此，本發(fā)明的另一主題是上述核/殼型超順磁性復(fù)合微粒在標(biāo)記核酸、寡核苷酸探針、抗原、抗體、酶、多肽、多糖、親和素、鏈親和素、細(xì)胞等生物及非生物材料方面的應(yīng)用。
經(jīng)本發(fā)明核/殼型超順磁性復(fù)合微粒標(biāo)記過的核酸、寡核苷酸探針、抗原、抗體、酶、多肽、多糖、親和素或鏈親和素、細(xì)胞等生物及非生物材料后，可用于對(duì)核酸、蛋白、多糖等生物分子及其它非生物分子的檢測(cè)。
故此，本發(fā)明的又一主題是上述核/殼型超順磁性復(fù)合微粒在生物及非生物分子檢測(cè)中的應(yīng)用。
本發(fā)明超順磁性復(fù)合微粒兼具超順磁性微粒在磁場(chǎng)作用下易于分離和金、銀表面極易與巰基化寡核苷酸、蛋白質(zhì)、多糖等生物活性物質(zhì)結(jié)合而易被修飾的優(yōu)點(diǎn)，使其非常適用于核酸與蛋白質(zhì)的分離，核酸雜交與檢測(cè)，及抗原-抗體免疫學(xué)檢測(cè)等生物體系的檢測(cè)中。尤其適用于生物芯片的目視化檢測(cè)。因該復(fù)合微粒兼具超順磁性和金、銀的顯色特性，故可使以該微粒為標(biāo)記物的生物檢測(cè)體系不需經(jīng)離心及其它的酶處理步驟，只需通過一步簡(jiǎn)單的磁性分離，就可對(duì)捕獲至復(fù)合微粒表面的反應(yīng)物進(jìn)行富集、分離和純化，從而增加了檢測(cè)的靈敏度和特異性，縮短了檢測(cè)時(shí)間；此外還可達(dá)到檢測(cè)結(jié)果的目視化，使檢測(cè)過程更為便捷，同時(shí)擺脫了昂貴檢測(cè)儀器的束縛。
具體實(shí)施例方式
以下各實(shí)施例僅作為實(shí)施本發(fā)明的示例，用以進(jìn)一步闡明本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1本實(shí)施例旨在闡明本發(fā)明核/殼型Fe3O4/Au超順磁性復(fù)合微粒制備的可實(shí)施性。
1.超順磁性Fe3O4微粒的合成在攪拌下，將摩爾比為1∶2的FeCl2/FeCl3混合物加入6mol/L的NaOH溶液中，20℃下攪拌混合溶液約1小時(shí)后，將溫度升至約70℃，攪拌約1小時(shí)，借助外加磁場(chǎng)分離出所生成的超順磁性Fe3O4微粒，用二次蒸餾水反復(fù)洗滌，直至洗滌水呈中性，制得中性的Fe3O4微粒。分選出粒徑為15～30nm的超順磁性Fe3O4微粒，用二次蒸餾水將磁性微粒懸浮液中固形物含量調(diào)整為5.6mg/ml。再稀釋10倍后作為種子用于Fe3O4/Au復(fù)合微粒的制備。
2.核/殼型Fe3O4/Au超順磁性復(fù)合微粒的制備取25ml含F(xiàn)e3O4約1.7mmol的Fe3O4懸浮液，磁場(chǎng)中分離30分鐘后，棄上清液，加入120ml濃度為0.3mmol/L的HAuCl4水溶液，振搖30分鐘后，加入5ml濃度為80mmol/L的NH2OH·HCl水溶液(計(jì)含鹽酸羥胺40mmol)，10分鐘后再加5ml濃度為30mmol/L的HAuCl4水溶液，振搖10分鐘后，逐漸形成核/殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4/Au磁性復(fù)合微粒。磁性分離，雙蒸水洗滌5次，定容至25ml。
實(shí)施例2本實(shí)施例旨在證明本發(fā)明核/殼型Fe3O4/Au超順磁性復(fù)合微粒表面可通過常規(guī)方法用鏈親和素進(jìn)行修飾。
用0.1mol/L濃度的K2CO3水溶液將Fe3O4/Au磁性復(fù)合微粒懸浮液的pH值調(diào)至6.0～7.0，在電磁攪拌器攪拌下，將1mg鏈親和素溶于0.1mol/L且pH為6.0～7.0的PBS制成的濃度為0.02％(質(zhì)量-體積百分濃度)的鏈親和素溶液，在大約5分鐘內(nèi)加入上面實(shí)施例1中所得磁性復(fù)合微粒懸浮液中。在磁子攪拌器攪拌下加入5％的牛血清白蛋白(BSA)作為穩(wěn)定劑，使其終濃度為1％。用磁式分離器對(duì)反應(yīng)后的混合物進(jìn)行分離，將分離得到的包覆鏈親和素的Fe3O4/Au超順磁性復(fù)合微粒用0.1mol/L的PBS清洗并稀釋后儲(chǔ)存于4℃冰箱中備用。
實(shí)施例3本實(shí)施例旨在證明本發(fā)明核/殼型超順磁性復(fù)合微粒表面可用常規(guī)方法偶聯(lián)寡核苷酸探針。
將5ml 15nM核/殼型超順磁性復(fù)合微粒懸浮液和加入烷巰基寡核苷酸探針混合，使探針終濃度為5μM，作用16小時(shí)，然后將混合溶液置于含0.1M NaCl的10mM磷酸鹽緩沖(pH＝7.0)，并保持40小時(shí)，用磁式分離器對(duì)反應(yīng)后的混合物進(jìn)行分離，用含0.1M NaCl的10mM磷酸鹽緩沖液(pH＝7.0)清洗，保存于含0.3M NaCl的10mM磷酸鹽緩沖液(pH＝7.0)中。
實(shí)施例4本實(shí)施例用來闡明本發(fā)明核/殼型超順磁性復(fù)合微粒表面可用常規(guī)方法來偶聯(lián)抗體。
取0.5ml核/殼型超順磁性復(fù)合微粒懸浮液，磁性分離棄上清，加入0.5ml 0.05M的Tris-HCl(pH＝7.6)，作用5分鐘，磁性分離棄上清。將抗體原液用0.05M Tris-HCl(pH＝7.6)稀釋成0.2mg/ml，然后取200μl加入復(fù)合微粒中，混勻，反應(yīng)30分鐘，間歇振蕩。用磁式分離器對(duì)反應(yīng)后的混合物進(jìn)行分離，將分離得到的包被抗體的超順磁性復(fù)合微粒用0.02M的TBS(pH＝8.2)清洗。
權(quán)利要求
1.一種可標(biāo)記核酸、抗原、抗體、酶、多肽、多糖、親和素、鏈親和素或者細(xì)胞之類生物及非生物材料的核/殼型超順磁性復(fù)合微粒，該復(fù)合微粒由核心部分和包覆于核心部分表面上的外殼部分組成，所述核心部分由磁性材料構(gòu)成，所述外殼部分由貴金屬材料構(gòu)成，其特征在于，所述微粒的平均直徑為0.05～50μm，以其總重量為準(zhǔn)計(jì)，所述核心部分占30～70％，所述外殼部分占30～70％，其中所述核心部分由Fe3O4、γ-Fe2O3或鐵的其他氧化物磁性微粒構(gòu)成，或者由三價(jià)鐵與二價(jià)錳、鎳、鋅或銅的正鐵酸鹽磁性微粒構(gòu)成，所述外殼部分由單質(zhì)金或銀構(gòu)成，所述復(fù)合微粒在水中具有良好的懸浮穩(wěn)定性，而且對(duì)外磁場(chǎng)具有良好磁響應(yīng)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述核/殼型超順磁性復(fù)合微粒的制備方法，其特征在于，該方法包括下列步驟a.用化學(xué)共沉淀法制備所述核心部分磁性微粒；b.用化學(xué)還原法沉積金或銀，使之包覆磁性微粒，其中還原劑可用鹽酸羥胺或檸檬酸三鈉。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述核/殼型超順磁性復(fù)合微粒制備方法，其特征在于，該方法包括下列步驟a.在攪拌下將Fe(II)鹽、Mn(II)鹽、Ni(II)鹽、Zn (II)鹽或Cu(II)鹽中一種鹽的水溶液或其混合物與Fe(III)鹽水溶液以1∶2～1∶4的摩爾比混合均勻后，加入濃度為1～6mol/L的氫氧化鈉水溶液或濃度為30％(重量)的氨水，調(diào)節(jié)混合物的pH為10～13，20℃下快速攪拌20～60分鐘，然后升溫至60～70℃，并繼續(xù)攪拌孵育30～60分鐘，在外磁場(chǎng)中分離出平均粒徑為15～30nm的晶態(tài)超順磁性微粒沉淀物，并用二次蒸餾水反復(fù)洗滌直至得到中性的磁性微粒，再用二次蒸餾水將磁性微粒稀釋定容成磁性流體，其中固形物的含量為5～20mg/ml，再將其稀釋后作為種子用于磁性復(fù)合微粒的制備；b.在步驟a所得磁性納米粒子的懸浮液中，加入濃度為0.01～1％的Au(III)鹽溶液或濃度為0.01～1％的Ag(I)鹽溶液50～500ml，振搖30分鐘，使Au(III)或Ag(I)離子在磁性納米粒子表面充分吸附，然后加入15～40ml濃度為40mmol/L的還原劑鹽酸羥胺或檸檬酸三鈉，作用5～40分鐘后，再加1～10ml濃度為1％的Au(III)鹽溶液或濃度為1％的Ag(I)鹽溶液，振搖10分鐘，被還原的納米級(jí)金或銀包覆于磁性納米微粒表面上，形成核/殼結(jié)構(gòu)的超順磁性復(fù)合微粒，磁性分離，二次蒸餾水反復(fù)洗滌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，其中在步驟a的反應(yīng)介質(zhì)中還可以添加表面活性劑聚乙二醇，并控制pH值在7左右，以使所產(chǎn)生磁性納米微粒的平均直徑為15～30nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述核/殼型超順磁性復(fù)合微粒在標(biāo)記核酸、寡核苷酸探針、抗原、抗體、酶、多肽、多糖、親和素、鏈親和素、細(xì)胞等生物及非生物材料方面的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述核/殼型超順磁性復(fù)合微粒在生物及非生物檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種核/殼型超順磁性復(fù)合微粒及其制備方法與該復(fù)合微粒的應(yīng)用。該復(fù)合微粒由核心部分和包覆于核心部分表面上的外殼部分組成，以其總重量為準(zhǔn)計(jì)，核心部分占30～70％，外殼部分占30～70％。核心部分是由Fe
文檔編號(hào)G01N33/543GK1542449SQ0312406
公開日2004年11月3日 申請(qǐng)日期2003年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月30日
發(fā)明者崔亞麗, 陳超, 王瓊, 惠文利 申請(qǐng)人:陜西西大北美基因股份有限公司