專利名稱：一種人工預(yù)先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種顯示髓過氧化物酶的工作液，更具體地說它是一種人工預(yù)先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液。
背景技術(shù)：
髓過氧化物酶(MPO)染色對(duì)白血病的診斷和分型具有重要意義，應(yīng)用廣泛。FAB(France America Britian協(xié)作組)分型方案中，將髓過氧化物酶(MPO)陽性率＞3％作為診斷急性髓細(xì)胞性白血病(AML)的標(biāo)準(zhǔn)。目前MPO染色方法主要有Washburn聯(lián)苯胺法及Pereira碘化鉀(KI)法兩種。
Washburn法MPO染色工作液由聯(lián)苯胺溶液及稀H2O2溶液組成。因聯(lián)苯胺具有潛在致癌作用，其方法已逐漸被淘汰。
Pereira原法中MPO染色工作液由緩沖溶液、碘化鉀(KI)及顯色劑Leishman’s染料組成，不加H2O2，但所用KI溶液需充分振搖使與空氣充分接觸，以獲取足夠的氧，因此所需的時(shí)間較長。
目前大多數(shù)學(xué)者采用改良的Pereira法，其MPO染色工作液由緩沖溶液、稀H2O2溶液、碘化鉀(KI)溶液及顯色劑組成。這種方法每次配制MPO染色工作液時(shí)需加H2O2，比較麻煩，操作步驟也復(fù)雜；同時(shí)若H2O2失效對(duì)MPO染色結(jié)果易產(chǎn)生影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述背景技術(shù)的不足之處而提供一種人工預(yù)先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液。該工作液安全、穩(wěn)定可靠、易于配制、操作簡單、是理想的MPO染色工作液。
本發(fā)明的目的是通過如下措施來達(dá)到的一種人工預(yù)先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液，它由緩沖溶液、碘化鉀溶液或含碘化鉀的緩沖溶液、顯色劑組成，所述顯色劑是經(jīng)人工預(yù)先氧化的顯色劑。
在上述技術(shù)方案中，所述人工預(yù)先氧化的顯色劑是經(jīng)雙氧水人工預(yù)先氧化成熟。
在上述技術(shù)方案中，所述的顯色劑為吡啰紅G(PyG)的甲醇溶液，吡啰紅B(PyB)的甲醇溶液或乙醇溶液。
在上述技術(shù)方案中，所述顯色劑可為下述物質(zhì)中的一種①氧蒽酮染料類，特別是由氧蒽酮為母體的堿性染料；②燦爛甲酚藍(lán)及其類似物；③以吩噻嗪為母體的堿性染料；④以吩嗪為母體的堿性染料；⑤三苯甲烷類堿性染料。
在上述技術(shù)方案中，所述顯色劑可為亞甲藍(lán)、羅丹明B、天青I、孔雀石綠、甲基綠、碘綠、乙基紫中的一種。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)每次配制MPO染色工作液時(shí)不必再加H2O2，省去了需經(jīng)常配制H2O2的麻煩，從而簡化了操作步驟，(2)消除了因H2O2失效對(duì)MPO染色結(jié)果的影響，避免了假陰性結(jié)果的發(fā)生。(3)提高了試劑的穩(wěn)定性及便于標(biāo)準(zhǔn)化，也增加了結(jié)果間的可比性。(4)試劑安全、穩(wěn)定可靠、便于標(biāo)準(zhǔn)化、易于配制、操作簡單、是理想的MPO染色方法。(5)成熟中性粒細(xì)胞染色時(shí)間為5～15秒即可，特別適合用于快速機(jī)檢。


圖1為正常骨髓涂片KI-PyB法MPO染色顯微圖，圖2為急性髓細(xì)胞白血病外周血涂片KI-PyB法MPO染色顯微圖，圖3、圖4為急性髓細(xì)胞白血病骨髓涂片KI-PyB法MPO染色顯微圖，圖5為正常骨髓涂片KI-PyG法MPO染色顯微圖，圖6為急性髓細(xì)胞白血病外周血涂片KI-PyG法MPO染色顯微圖，圖7、圖8為急性髓細(xì)胞白血病骨髓涂片KI-PyG法MPO染色顯微圖，具體實(shí)施方式
經(jīng)意外發(fā)現(xiàn)，在配制的0.5％PyB(50％乙醇為溶劑)溶液做MPO染色時(shí)出現(xiàn)過強(qiáng)陽性反應(yīng)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)PyB是被自然氧化了。用此已自然氧化了的PyB溶液做MPO染色時(shí)，不需加H2O2。于是設(shè)想將適量H2O2加入到0.5％PyB(50％乙醇)溶液中，促使PyB溶液預(yù)先氧化而達(dá)到成熟。實(shí)驗(yàn)顯示，只需一次性加入適量H2O2即可使PyB預(yù)先氧化成熟，其H2O2的量與正交試驗(yàn)所確定的最佳含量一致，而以后每次配制MPO工作液時(shí)都不必再加H2O2，也能很好的顯示MPO。
進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)本組同時(shí)配制了加H2O2的PyG及PyB三種溶液，其溶劑分別為50％乙醇、50％甲醇及蒸餾水，以觀察PyG及PyB的氧化成熟情況。1周后染色發(fā)現(xiàn)以50％甲醇為溶劑的PyG溶液被氧化成熟，達(dá)到了做MPO染色時(shí)不需加H2O2的目的，染色效果很滿意；但以50％乙醇及蒸餾水為溶劑的PyG溶液卻沒有出現(xiàn)氧化，做MPO染色時(shí)仍需加H2O2。而以50％乙醇及50％甲醇為溶劑的PyB溶液均被氧化成熟，而以蒸餾水為溶劑的PyB溶液氧化較緩慢。因此配制PyG溶液必須以甲醇為溶劑，PyG才能被氧化；配制PyB溶液以乙醇及甲醇為溶劑為佳，也可用蒸餾水。甲醇、乙醇中的甲基、乙基或羥基可能參與了PyG及PyB溶液氧化成熟的反應(yīng)過程或具有媒促反應(yīng)的效果。
本KI-PyB法MPO染色陽性顆粒為鮮紅色，KI-PyG法MPO染色陽性顆粒為棕黑色。所顯示的MPO陽性反應(yīng)，對(duì)比鮮明，易于判斷，染色時(shí)間短，靈敏度高。試劑安全、穩(wěn)定可靠、易于配制、操作簡單，特別是不需加H2O2，消除了H2O2對(duì)染色結(jié)果的影響，避免了假陰性結(jié)果的發(fā)生。新鮮涂片通常染色30～60s即可達(dá)最佳，必要時(shí)可適當(dāng)延長染色時(shí)間，但不必超過2min。成熟中性粒細(xì)胞染色時(shí)間為5～15s即可，特別適合用于快速機(jī)檢。
經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)證明許多與PyG、PyB化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化學(xué)物，特別是帶有苯胺基結(jié)構(gòu)的的化學(xué)物(試劑)，均可作為碘化鉀法MPO染色的顯色劑，這類化學(xué)物(試劑)主要是①氧蒽酮染料類，特別是由氧蒽酮為母體的堿性染料(例如羅丹明B及其類似物)；②燦爛甲酚藍(lán)(煌焦油藍(lán))及其類似物；③以吩噻嗪為母體的堿性染料(如硫菫、亞甲藍(lán)及其類似物、天青I、Wright-Giemsa染色液等)；④以吩嗪為母體的堿性染料(如中性紅、藏紅T及其類似物)；⑤三苯甲烷類堿性染料(如孔雀石綠、甲基綠、碘綠、結(jié)晶紫、乙基紫、新品紅、堿性品紅、副品紅等，及其類似物)。
各類染料中的部分試劑也可用本法人工氧化的方法氧化成熟，作為本法MPO染色的顯色劑。其中亞甲藍(lán)、羅丹明B、天青I、孔雀石綠、甲基綠、碘綠、乙基紫等效果較好。
實(shí)施例一KI-PyB法一、試劑配制1、固定劑1∶9甲醛乙醇液，即40％甲醛溶液10ml加無水乙醇90ml混合即得。
2、磷酸鹽緩沖溶液0.067mol/L pH5.8。
3、KI溶液500mg碘化鉀溶于50ml蒸餾水中。
4、PyB溶液250mg吡啰紅B溶于50ml 50％乙醇中，待完全溶解后，加30％H2O225μl。
5、甲基綠溶液500mg甲基綠溶于50ml蒸餾水中。
6、MPO染色工作液配制(臨用時(shí)現(xiàn)配)取磷酸鹽緩沖溶液1ml，加KI溶液50μl、PyB溶液100μl(邊滴邊搖)，4小時(shí)內(nèi)使用。
二、染色步驟1、干燥的血涂片或骨髓涂片，滴加固定劑布滿血膜固定30-60s，流水沖洗，晾干或?yàn)V紙吸干。
2、滴加工作液于涂片上，染色1-2min后傾去(不用水沖洗)，濾紙吸干。
3、滴加甲基綠溶液于涂片上，染色5s后傾去(不用水沖洗)，濾紙吸干，鏡檢。
三、染色結(jié)果判斷陽性產(chǎn)物呈紅色至深紅色顆粒狀定位于胞漿中，強(qiáng)陽性時(shí)陽性顆粒充滿整個(gè)胞漿，甚至覆蓋細(xì)胞核。MPO陰性細(xì)胞的胞漿呈淺藍(lán)色，無紅色顆粒。細(xì)胞核呈淺綠色，核仁呈淺藍(lán)色。(見圖1、圖2、圖3、圖4)，圖1為正常骨髓涂片KI-PyB法MPO染色顯微圖，圖2為急性髓細(xì)胞白血病外周血涂片KI-PyB法MPO染色顯微圖，圖3、圖4為急性髓細(xì)胞白血病骨髓涂片KI-PyB法MPO染色顯微圖。
實(shí)施例二KI-PyG法一、試劑配制1、固定劑1∶9甲醛乙醇液，即40％甲醛溶液10ml加無水乙醇90ml混合即得。
2、磷酸鹽緩沖溶液0.067mol/L pH5.8。
3、KI溶液500mg碘化鉀溶于50ml蒸餾水中。
4、PyG溶液250mg吡啰紅G溶于50ml 50％乙醇中，待完全溶解后，加30％H2O225～50μl。
5、工作液配制(臨用時(shí)現(xiàn)配)取磷酸鹽緩沖溶液1ml，加KI溶液150μl、PyG溶液100μl混勻，4小時(shí)內(nèi)使用。
二、染色步驟1、干燥的血涂片或骨髓涂片，滴加固定劑布滿血膜固定30～60s，流水沖洗，晾干或?yàn)V紙吸干。
2、滴加工作液于涂片上，染色1-2min后傾去，濾紙吸干，鏡檢。
三、MPO染色結(jié)果判斷陽性產(chǎn)物呈棕黑色顆粒狀定位于胞漿中，強(qiáng)陽性時(shí)陽性顆粒充滿整個(gè)胞漿，甚至覆蓋細(xì)胞核，細(xì)胞核呈淺紅色。MPO陰性細(xì)胞的胞漿呈淺紅色，但較細(xì)胞核略深，無棕黑色顆粒。(見圖5、圖6、圖7、圖8)。圖5為正常骨髓涂片KI-PyG法MPO染色顯微圖，圖6為急性髓細(xì)胞白血病外周血涂片KI-PyG法MPO染色顯微圖，圖7、圖8為急性髓細(xì)胞白血病骨髓涂片KI-PyG法MPO染色顯微圖。
上述實(shí)施例一、實(shí)施例二染色結(jié)果采用急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)9例、急性髓細(xì)胞性白血病(AML)33例、粒系反應(yīng)性增12例及正常骨髓涂片5例，共計(jì)59例標(biāo)本。各例分別按本實(shí)施例1、實(shí)施例2及Washburn法做MPO染色，每張涂片分類計(jì)200個(gè)有核細(xì)胞，記錄MPO染色陽性細(xì)胞占有核細(xì)胞(ANC)的百分率；采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
附表50例骨髓涂片MPO染色陽性率(％，x±S)結(jié)果比較骨髓診斷例數(shù)實(shí)施例1 實(shí)施例2 Washburn法正常髓象5 58.6±3.3 63.0±6.8 65.0±7.9粒系增生12 71.8±6.0 72.4±6.5 73.3±6.1AML-M1 10 40.8±21.939.7±20.338.2±22.5AML-M2a 9 73.1±15.074.4±15.271.3±14.2AML-M2b 4 80.0±10.478.5±8.5 77.8±14.3AML-M3b 6 92.2±4.3 91.3±4.8 94.3±2.9AML-M4b 4 42.3±3.7 50.3±11.646.8±13.1總計(jì)50 65.3±21.366.3±20.565.8±21.9結(jié)果顯示，9例ALL的白血病細(xì)胞，本法中的實(shí)施例1、實(shí)施例2與Washburn法MPO染色均為陰性，但涂片中的少量中性粒細(xì)胞MPO呈強(qiáng)陽性；另50例MPO染色陽性率(ANC)見附表，實(shí)施例1及實(shí)施例2與Washburn法MPO陽性率十分相近，平均值分別為65.3％、66.3％及65.8％，三者差異無顯著性意義(P＞0.05)。
權(quán)利要求
1.一種人工預(yù)先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液，它由緩沖溶液、碘化鉀溶液或含碘化鉀的緩沖溶液、顯色劑組成，其特征在于所述顯色劑是經(jīng)人工預(yù)先氧化的顯色劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工預(yù)先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液，其特征在于所述人工預(yù)先氧化的顯色劑是經(jīng)雙氧水人工預(yù)先氧化成熟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人工預(yù)先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液，其特征在于所述的人工預(yù)先氧化的顯色劑為吡啰紅G的甲醇溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人工預(yù)先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液，其特征在于所述的人工預(yù)先氧化的顯色劑為吡啰紅B的甲醇溶液或乙醇溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人工預(yù)先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液，其特征在于所述顯色劑可為下述物質(zhì)中的一種①氧蒽酮染料類，特別是由氧蒽酮為母體的堿性染料；②燦爛甲酚藍(lán)及其類似物；③以吩噻嗪為母體的堿性染料；④以吩嗪為母體的堿性染料；⑤三苯甲烷類堿性染料。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人工預(yù)先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液，其特征在于所述顯色劑可為亞甲藍(lán)、羅丹明B、天青I、孔雀石綠、甲基綠、碘綠、乙基紫中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人工預(yù)先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液，其特征在于所述顯色劑可為亞甲藍(lán)、羅丹明B、天青I、孔雀石綠、甲基綠、碘綠、乙基紫中的一種。
全文摘要
一種人工預(yù)先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶(MPO)的工作液，它由緩沖溶液、碘化鉀溶液或含碘化鉀的緩沖溶液、顯色劑組成，所述顯色劑是經(jīng)人工預(yù)先氧化的顯色劑。其優(yōu)點(diǎn)在于每次配制MPO染色工作液時(shí)不必再加H
文檔編號(hào)G01N1/30GK1546978SQ20031011151
公開日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月4日
發(fā)明者陳萬新 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院