一種髓過氧化物酶(mpo)引導(dǎo)細(xì)胞免疫治療技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫工程領(lǐng)域，更加具體地，涉及一種髓過氧化物酶(MPO)引導(dǎo)細(xì)胞免疫治療技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]髓過氧化物酶(myeloperoxidase，ΜΡ0)的相對分子質(zhì)量為150X 103，是由2個亞單位聚合而成的二聚體，每個亞單位又由一條重鏈(α鏈，相對分子質(zhì)量約60X 13)和一條輕鏈(β鏈，相對分子質(zhì)量約15Χ103)所構(gòu)成，2個亞單位在α鏈處由I個二硫鍵相連。重鏈具有亞鐵卟啉基團(tuán)，MPO呈鐵依賴性。MPO是一種由中性粒白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌的含血紅素輔基的血紅素蛋白酶，是血紅素過氧化物酶超家族成員之一，MPO是I相代謝酶，每個酶分子有兩個鐵素基團(tuán)，順磁共振波譜表明血紅素中的鐵是在甲?；t素部分。MPO的合成是粒細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)之前在骨髓內(nèi)合成并貯存于嗜天青顆粒內(nèi)，外界刺激可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞聚集，釋放髓過氧化物酶(MPO)。在成熟的粒細(xì)胞中，MPO是含量最豐富的糖蛋白，約占外周血多形核中性粒細(xì)胞(PMNs)內(nèi)總蛋白質(zhì)含量的5%，血液中95%的MPO來源于PMNs。MPO以3種亞形存在于髓系細(xì)胞中，分別為MPO 1、I1、III，它們的重鏈有差異，輕鏈的差異較小，導(dǎo)致它們在相對分子質(zhì)量及疏水性等方面不同，3種亞型在功能上的差異還不明確，有待進(jìn)一步研宄。
[0003]MPO是中性粒細(xì)胞的功能標(biāo)志和激活標(biāo)志，其水平及活性變化代表著嗜中性多形核白細(xì)胞(PMN)的功能和活性狀態(tài)。純化的人MPO活性為25?35IU/mg，水溶性好，底物H202濃度> 0.8mmol時酶受抑制，酶反應(yīng)最佳pH為4.5?5.5，當(dāng)pH彡10，或彡2時酶失活。MPO的主要功能是在吞噬細(xì)胞內(nèi)殺滅微生物，利用過氧化氫和氯離子產(chǎn)生次氯酸鹽，并形成具有氧化能力的自由基，構(gòu)成MP0-H202-鹵素系統(tǒng)。
[0004]許多研宄發(fā)現(xiàn)，MPO不僅能殺滅吞噬于細(xì)胞內(nèi)的微生物，而且可釋放到細(xì)胞外，破壞多種靶物質(zhì)，如腫瘤細(xì)胞、血小板、NK細(xì)胞、原蟲、毒素等，對機(jī)體產(chǎn)生和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等多方面發(fā)揮作用，然而，在特定條件下，MPO催化反應(yīng)生成過量的氧化劑(H0C1、3-氯化酪氨酸、酪氨?；⑾趸野彼岬?，超過局部抗氧化劑的防御反應(yīng)時，就會導(dǎo)致氧化應(yīng)激和氧化性組織損傷。MPO還參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的許多過程，MPO缺陷的中性粒細(xì)胞因過量的注入炎癥部位而發(fā)生氧化反應(yīng)，大量的超氧化物和氧化物形成，造成炎癥部位組織細(xì)胞損傷。此外還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)MPO能與DNA牢固結(jié)合形成復(fù)合物，有效保護(hù)DNA防止其在氧化過程中受損，從而保證髓系細(xì)胞的正常分化成熟及功能。
[0005]MPO消耗過氧化氫，生理情況下，是天生免疫系統(tǒng)的一部分，在特定條件下，它催化反應(yīng)所產(chǎn)生的氧化劑生成過量，超過局部抗氧化劑的防御反應(yīng)時，就會導(dǎo)致氧化應(yīng)激和氧化性組織損傷。另外，MPO還與白血病、腎炎、小血管炎、腫瘤及動脈粥樣硬化等的發(fā)病有關(guān)。冠心病是心血管系統(tǒng)中最常見的疾病，而動脈粥樣硬化(AS)又是形成冠心病的重要病理基礎(chǔ)，AS發(fā)病過程中通常出現(xiàn)氧化低密度脂蛋白，進(jìn)而巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)變成泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞的形成在AS的發(fā)生機(jī)制中起關(guān)鍵作用。
[0006]研宄發(fā)現(xiàn)MPO有促進(jìn)AS病變形成的作用，MPO通過產(chǎn)生自由基和多種反應(yīng)性物質(zhì)，促進(jìn)斑塊形成和不穩(wěn)定性增加，加速AS進(jìn)展，進(jìn)而引起多種并發(fā)癥如急性冠脈綜合征(ACS)，研宄發(fā)現(xiàn)MPO缺陷的個體罹患心血管疾病的危險性明顯下降。MPO水平的升高不僅與患冠狀動脈疾病易感性相關(guān)，還可以預(yù)測早期患心肌梗死的危險性。MPO促進(jìn)急性冠脈綜合征(ACS)病變形成，并影響粥樣斑塊的穩(wěn)定性，通過增大氧化應(yīng)激而引起ACS。研宄表明，MPO是預(yù)測ACS患者發(fā)生不良心血管事件的一個新的預(yù)測因子，特別是在肌鈣蛋白T(TnT)水平較低的患者，MPO能夠識別那些將來發(fā)生心血管事件危險性較高的患者。
[0007]在肺部受微生物侵襲、職業(yè)暴露以及吸煙時，MPO會隨中性粒細(xì)胞的聚集釋放到炎癥部位，MPO可代謝激活多種與肺癌有關(guān)的環(huán)境致癌物，能將前致癌物如多環(huán)芳烴類的苯并芘(BaP)轉(zhuǎn)化成具有高度反應(yīng)性和致癌性的活性產(chǎn)物二醇環(huán)氧化苯并芘(BPDE)，BPDE能與DNA形成加合物并導(dǎo)致姐妹染色體互換，從而導(dǎo)致肺癌。
[0008]隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)MPO在砷中毒所致皮膚病變的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。MPO被研宄者認(rèn)為可能是砷中毒新發(fā)現(xiàn)的一種易感標(biāo)志物，將在慢性砷中毒的早期診斷和危險評估中具有重要的意義，但國內(nèi)就這方面的研宄還沒有涉及到，國外對其深入的影響機(jī)制的研宄也不是很多，因此還很難在現(xiàn)有的研宄基礎(chǔ)上建立起砷中毒易感性與MPO及其多態(tài)性的明確關(guān)系，還需要進(jìn)一步的研宄證實。MPO在現(xiàn)階段的研宄也確定了它在疾病早期診斷與危險評估中具有重要的意義，MPO通過不同的途徑可導(dǎo)致某些疾病，同時其基因多態(tài)性也會降低機(jī)體對某些疾病的易感受性，從而對機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用，但其作用機(jī)制仍不清楚，隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，MPO的作用機(jī)制研宄將不斷深入，可能會發(fā)現(xiàn)其他一些與疾病易感性有關(guān)的多態(tài)性位點，從而使人們更清楚的認(rèn)識其相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展，以便對這些人群采取有效的預(yù)防和治療措施。
[0009]細(xì)胞免疫治療技術(shù)又稱生物免疫治療技術(shù)，是一種以“科學(xué)關(guān)愛生命”為宗旨的腫瘤生物治療的概念。細(xì)胞免疫治療技術(shù)是一種新興的、具有顯著療效的以現(xiàn)代生物技術(shù)手段激發(fā)自身免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤的新型治療方法。是繼手術(shù)、放療和化療等傳統(tǒng)治療法之后的第四大腫瘤治療技術(shù)。細(xì)胞免疫治療技術(shù)是通過提取人體抗擊腫瘤的多種關(guān)鍵免疫細(xì)胞，通過體外培養(yǎng)、激活、誘導(dǎo)、增殖，回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，從根本上可以改變腫瘤細(xì)胞的生長環(huán)境來抑制腫瘤的生長和增值，達(dá)到殺滅腫瘤和抑制腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的治療方法。DC (Dendritic cells)細(xì)胞識別抗原、激活獲得性免疫系統(tǒng)，CIK (cytokine inducedkiller)細(xì)胞通過發(fā)揮自身細(xì)胞毒性和分泌細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞，兩者聯(lián)合可以提高CIK細(xì)胞的增殖能力和殺傷活性，并且激發(fā)機(jī)體特異抗腫瘤免疫，達(dá)到長期對腫瘤細(xì)胞的控制殺傷效果。
[0010]細(xì)胞免疫治療技術(shù)廣泛適用于多種實體腫瘤及血液系統(tǒng)腫瘤的臨床治療，包括乳腺癌、惡性黑色素瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、腎癌、膀胱癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、喉癌、鼻咽癌、胰腺癌、肝癌、胃癌等實體瘤手術(shù)后防止復(fù)發(fā)，也可以用于多發(fā)性骨髓瘤、B淋巴瘤和白血病等血液系統(tǒng)惡性腫瘤的復(fù)發(fā)，還可以用于上述腫瘤的進(jìn)一步鞏固治療，達(dá)到延長生存期、提高生活質(zhì)量和抑制腫瘤惡化的目的?？傮w有效率38%?70%，用于治療惡性胸腹水有效率80%?95%，降低腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險率40%?50%。但生物治療不適用于T細(xì)胞淋巴瘤患者、器官移植后長期使用免疫抑制藥物和正在使用免疫抑制藥物的自身免疫病的患者。
[0011]細(xì)胞免疫治療的作用包括:早期腫瘤術(shù)前應(yīng)用，可全面提高患者的免疫功能，尤其可以避免由于手術(shù)應(yīng)激所引起的免疫功能下降，提高手術(shù)治療的成功率；手術(shù)、放療或化療完成后應(yīng)用，可恢復(fù)及加強其免疫抗腫瘤作用，消滅體內(nèi)殘留癌細(xì)胞，減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高治愈率；放療、化療療程之間及結(jié)束后應(yīng)用，可增強放療、化療療效提高對化療、放療的耐受性并減輕其副作用；晚期腫瘤已失去手術(shù)機(jī)會者或體質(zhì)較差、無法耐受大劑量放、化療或化療不敏感及耐藥時，單用生物治療能明顯改善癥狀、提高生存質(zhì)量、延長存活時間；臨床治愈患者，定期應(yīng)用，可以預(yù)防轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)；癌前病變應(yīng)用，可以阻止癌變進(jìn)程，預(yù)防腫瘤的發(fā)生。
[0012]細(xì)胞免疫治療技術(shù)與傳統(tǒng)治療相比的優(yōu)勢:激活機(jī)體免疫功能，有望徹底消滅腫瘤細(xì)胞(包括殘余的腫瘤干細(xì)胞和其它非增殖期腫瘤細(xì)胞)，有效降低腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，提高腫瘤治愈率；殺癌力強、殺瘤譜廣，對多種腫瘤(包括不適宜手術(shù)，放療不敏感及化療耐藥腫瘤)均有效；選擇性靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，對正常細(xì)胞無毒性作用；與三大治療聯(lián)用，增強手術(shù)成功率，提高放化療療效；能夠避免因三大治療所致的毒副作用及免疫功能下降；明顯改善患者臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，延長生存期。
[0013]細(xì)胞免疫治療的靶向性是細(xì)胞免疫治療的質(zhì)量所在，有效的靶向可以起到定位和專一的治療效果，靶向有兩種情況，一種是細(xì)胞膜蛋白靶向定位，主要指腫瘤或者乙肝等患病細(xì)胞的膜上特異蛋白的靶向性，可以引導(dǎo)免疫殺傷細(xì)胞進(jìn)行定點定性細(xì)胞殺死；另一種是部位靶向性，通過以患處的相關(guān)特異物為引導(dǎo)靶向，使免疫細(xì)胞能集中于患處，從而有效殺死周圍的各類型可疑患病細(xì)胞，細(xì)胞膜蛋白靶向定位的功能更強、更專一，而部位靶向性具有局部功能多樣性。
[0014]現(xiàn)有的多種細(xì)胞免疫治療技術(shù)在腫瘤和乙肝等細(xì)胞膜上具有患病特異靶向蛋白的疾病治療中得到的應(yīng)用，但是由于各種腫瘤等疾病的細(xì)胞膜表面特異性抗原的特異性程度有限，以及人們對其認(rèn)識的不夠，都影響了細(xì)胞免疫技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，同時一些疾病的患病過程往往伴隨著周圍其他細(xì)胞的病癥，出現(xiàn)一些炎癥等病癥，在靶向?qū)Ｒ恍悦庖咧委煹耐瑫r，往往需要對整個環(huán)境進(jìn)行治療才能最大程度的達(dá)到治療的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)仍然存在的弊端，本發(fā)明提出了一種髓過氧化物酶(MPO)引導(dǎo)細(xì)胞免疫治療技術(shù)，利用部位靶向具有的局部廣義的免疫治療，引導(dǎo)免疫強效的細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行大范圍的定點疾病治療。
[0016]一種髓過氧化物酶(MPO)引導(dǎo)細(xì)胞免疫治療技術(shù)，包括如下技術(shù)步驟:
I)從血液中分離單核細(xì)胞:
1.1)取10ml經(jīng)抗凝處理后的血液，等量加入到四根50ml的無菌離心管中，在300g加速度下，對所述無菌離心管離心1min后，將四根所述無菌離心管中上層血漿轉(zhuǎn)移到兩根干凈的備用50ml無菌離心管中，經(jīng)56°C水浴滅活30min后，再于400g加速度下離心1min后，收集所述備用50ml無菌離心管中上層黃色液體，即低血小板血楽(Poor PlateletPlasma, PPP)，于4°C條件下儲存?zhèn)溆茫?br> 1.2)向四根下層含血細(xì)胞的所述無菌離心管中加入注射用生理鹽水，直到每管30ml混合液，用移液器混勻得到血細(xì)胞混合液； 1.3)再取四根50ml含15ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管，緩慢的將所述血細(xì)胞混合液用移液器轉(zhuǎn)移到淋巴細(xì)胞分離液的上層，在400g加速度下離心20