專利名稱：：新型蛋白質(zhì)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新型蛋白質(zhì)、編碼該蛋白質(zhì)的多核苷酸、其制備方法、癌癥預(yù)防·治療劑或診斷藥物、細胞凋亡促進劑、癌癥預(yù)防·治療劑或細胞凋亡促進劑的篩選等。
背景技術(shù)：
：近年來由于微陣列(microarray)·寡核苷酸陣列(oligonucleotidearray)技術(shù)的進步，可以對基因表達進行詳盡的分析，預(yù)計即使是癌癥也可以通過微陣列圖譜數(shù)據(jù)(microarrayprofilingdata)評價其病理學(xué)狀況，實際中已經(jīng)報告在白血病中可以通過基因表達圖譜對白血病進行分類。另外，認為通過弄清各種癌癥組織的基因表達圖譜并累積其分類，可能可以預(yù)測對于特定癌癥治療方法的反應(yīng)性，或為特定癌癥發(fā)現(xiàn)新型藥物開發(fā)的目標蛋白質(zhì)。具體地，當發(fā)現(xiàn)某種癌癥是某種蛋白質(zhì)表達亢進時，可以對新診斷為抗原陽性的患者通過下述方法轉(zhuǎn)染抗腫瘤活性，即，(i)降低其表達量；(ii)抑制功能；(iii)使宿主對該蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)顯性化。與此同時，對診斷為抗原陰性的患者可以迅速改成其它療法，從而消除給患者帶來不必要的負擔(dān)的擔(dān)心。以上的基因圖譜解析有望給癌癥的分子診斷和分子靶向治療藥物的開發(fā)作出巨大的貢獻。Semaphorin家族是由分泌型分子和膜結(jié)合型分子兩種構(gòu)成的一大蛋白質(zhì)家族，已經(jīng)報告脊椎動物中至少有19種基因、無脊椎動物中有3種基因(Cell，97，551-552，1999)。已知Semaphorin家族參與神經(jīng)軸突誘導(dǎo)或突觸形成等為代表的廣范圍的神經(jīng)發(fā)生過程。近年來逐漸明確了Semaphorin家族參與免疫系統(tǒng)(TrendsinImmunol.，22，670-676，2001)和器官發(fā)生·血管新生。屬于Semaphorin家族且來源于人的Semaphorin3B和Semaphorin3F已經(jīng)作為癌癥抑制基因被報道(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，13954-13959，2001，CancerRes.，62，542-546，2002，CancerRes.，62，2637-2643，2002)。有報告指出Semaphorin3C在人肺癌組織中表達亢進(J.Surg.Oncol.，72，18-23，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，14713-14718，1997)。有報告指出Semaphorin3E在轉(zhuǎn)移性細胞中表達(CancerRes.，58，1238-1244，1998)。與Semaphorin4D在氨基酸水平上具有41％同源性的Semaphorin4B(以下簡稱為“SEMA4B”)已經(jīng)作為由基因組序列推定的基因登記在基因文庫中(GenBankAccessionNo.XM_044533)。SEMA4B作為在低氧條件下表達增加的基因之一被報道(WO02/46465)。也有報告指出基于基因芯片分析，包括SEMA4B等的數(shù)百種堿基序列可以用于探索診斷或治療肺癌的化合物等(WO02/86443)。有報告指出與SEMA4B在氨基酸水平上具有93％同源性的NOV7在癌癥中表達亢進(WO02/06329)。亟待開發(fā)以在癌細胞中特異性表達的分子為靶，誘導(dǎo)抑制癌細胞增殖的安全藥物。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述課題，本發(fā)明人進行了悉心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一種在肺癌組織中表達顯著增加的新基因，并發(fā)現(xiàn)該基因的反義寡核苷酸促進癌細胞的細胞凋亡。在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上進一步進行反復(fù)研究，從而完成本發(fā)明。即，本發(fā)明提供(1)蛋白質(zhì)或其鹽，其含有與序列號4、序列號7或序列號10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，(2)蛋白質(zhì)或其鹽，其包含序列號4、序列號7或序列號10所示的氨基酸序列，(3)上述(1)中所述蛋白質(zhì)的部分肽或其鹽，(4)多核苷酸，其含有編碼上述(1)中所述蛋白質(zhì)或其部分肽的多核苷酸，(5)上述(4)中所述的多核苷酸，其為DNA，(6)上述(5)所述多核苷酸，其含有序列號5、序列號8或序列號11所示的堿基序列，(7)多核苷酸，其包含序列號5、序列號8或序列號11所示的堿基序列，(8)重組載體，其含有上述(4)中所述多核苷酸，(9)被上述(8)中所述重組載體轉(zhuǎn)化了的轉(zhuǎn)化體，(10)上述(1)中所述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)上述(9)中所述轉(zhuǎn)化體，從而生成并蓄積上述(1)中所述蛋白質(zhì)或其部分肽，(11)含有上述(1)中所述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的藥物，(12)含有上述(4)中所述多核苷酸的藥物，(13)含有上述(4)中所述多核苷酸的診斷藥物，(14)上述(1)中所述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的抗體，(15)含有上述(14)中所述抗體的藥物，(16)含有上述(14)中所述抗體的診斷藥物，(17)多核苷酸，其含有與上述(4)中所述多核苷酸互補或者基本上互補的堿基序列或其一部分，(18)含有上述(17)中所述多核苷酸的藥物，(19)上述(1)中所述蛋白質(zhì)的定量方法，其特征在于，使用上述(14)中所述的抗體，(20)與上述(1)中所述蛋白質(zhì)或其功能相關(guān)的疾病的診斷方法，其特征在于，使用上述(19)中所述的定量方法，(21)抑制上述(1)中所述蛋白質(zhì)表達的化合物或其鹽的篩選方法，其特征在于，使用上述(1)中所述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽，(22)用于篩選抑制上述(1)中所述蛋白質(zhì)表達的化合物或其鹽的試劑盒，其含有上述(1)中所述的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽，(22a)抑制上述(1)中所述蛋白質(zhì)表達的化合物或其鹽，其通過使用上述(21)所述的篩選方法或上述(22)所述的篩選用試劑盒而得到，(22b)含有上述(22a)所述的化合物或其鹽而成的藥物，(23)抑制上述(1)中所述蛋白質(zhì)基因表達的化合物或其鹽的篩選方法，其特征在于，使用上述(4)中所述的多核苷酸，(24)用于篩選抑制上述(1)中所述蛋白質(zhì)基因表達的化合物或其鹽的試劑盒，其含有上述(4)中所述的多核苷酸，(24a)抑制上述(1)中所述蛋白質(zhì)基因表達的化合物或其鹽，其通過使用上述(23)中所述的篩選方法或上述(24)中所述的篩選用試劑盒得到，(24b)含有上述(24a)所述化合物或其鹽的藥物，(25)上述(11)、(12)、(15)或(18)中所述的藥物，其為癌癥預(yù)防·治療劑，(25a)上述(25)中所述的藥物，其中癌癥為肺癌、卵巢癌或胰腺癌，(25b)上述(22b)或(24b)所述的藥物，其為癌癥預(yù)防·治療劑，(26)上述(11)、(12)、(15)或(18)中所述藥物，其為(癌細胞的)細胞凋亡促進劑，(26a)上述(22b)或(24b)所述的藥物，其為(癌細胞的)細胞凋亡促進劑，(26b)上述(11)、(12)、(15)、(18)、(22b)或(24b)中所述藥物，其為癌細胞的增殖抑制促進劑，(27)上述(13)或(16)中所述診斷藥物，其為癌癥的診斷藥物，(28)細胞凋亡促進劑，其含有抑制上述(1)中所述的蛋白質(zhì)或其部分肽表達或該蛋白質(zhì)的基因表達的物質(zhì)，(29)細胞凋亡促進劑，其含有下述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的抗體，所述蛋白質(zhì)包含與序列號1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，(30)癌癥預(yù)防·治療劑，其含有下述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的抗體，所述蛋白質(zhì)包含與序列號1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，(30a)上述(30)中所述的癌癥預(yù)防·治療劑，其中癌癥是肺癌、卵巢癌或胰腺癌，(30b)癌細胞的增殖抑制促進劑，其含有下述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的抗體，所述蛋白質(zhì)包含與序列號1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，(31)多核苷酸，其含有與編碼下述蛋白質(zhì)或其部分肽的多核苷酸的堿基序列互補或基本上互補的堿基序列或其一部分，所述蛋白質(zhì)包含與序列號1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，(32)含有上述(31)中所述多核苷酸的藥物，(33)上述(32)中所述藥物，其為細胞凋亡促進劑，(33a)上述(32)中所述藥物，其為癌細胞的增殖抑制促進劑，(34)細胞凋亡促進劑的篩選方法，其特征在于，使用編碼下述蛋白質(zhì)或其部分肽的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)包含與序列號1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，(35)用于篩選細胞凋亡促進劑的試劑盒，其特征在于，含有編碼下述蛋白質(zhì)或其部分肽的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)包含與序列號1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，(35a)用上述(34)中所述的篩選方法或上述(35)中所述的篩選用試劑盒得到的細胞凋亡促進劑，(36)細胞凋亡促進劑，其含有抑制下述蛋白質(zhì)或其部分肽表達或該蛋白質(zhì)的基因表達的物質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含與序列號1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，(36a)癌細胞的增殖抑制促進劑，其含有抑制下述蛋白質(zhì)或其部分肽的基因表達的物質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含與序列號1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，(37)癌癥預(yù)防·治療方法，其特征在于，對哺乳動物施用有效量的(i)抑制下述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽表達的物質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含與序列號1、序列號4、序列號7或序列號10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；(ii)抑制上述蛋白質(zhì)或其部分肽的基因表達的物質(zhì)；或(iii)上述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的抗體，(38)癌細胞的細胞凋亡促進方法，其特征在于，對哺乳動物施用有效量的(i)抑制下述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽表達的物質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含與序列號1、序列號4、序列號7或序列號10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；(ii)抑制上述蛋白質(zhì)或其部分肽的基因表達的物質(zhì)；或(iii)上述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的抗體，(39)癌癥預(yù)防·治療方法，其特征在于，抑制下述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽表達，所述蛋白質(zhì)包含與序列號1、序列號4、序列號7或序列號10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；或抑制上述蛋白質(zhì)或其部分肽的基因表達，(40)癌細胞的細胞凋亡促進方法，其特征在于，抑制下述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽表達，所述蛋白質(zhì)包含與序列號1、序列號4、序列號7或序列號10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；或抑制上述蛋白質(zhì)或其部分肽的基因表達，(41)下述物質(zhì)在制備癌癥預(yù)防·治療劑中的用途，所述物質(zhì)為(i)抑制下述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽表達的物質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含與序列號1、序列號4、序列號7或序列號10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；(ii)抑制上述蛋白質(zhì)或其部分肽的基因表達的物質(zhì)；或(iii)上述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的抗體，(42)下述物質(zhì)在制備癌細胞細胞凋亡促進劑中的用途，所述物質(zhì)為(i)抑制下述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽表達的物質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含與序列號1、序列號4、序列號7或序列號10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；(ii)抑制上述蛋白質(zhì)或其部分肽的基因表達的物質(zhì)；或(iii)上述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的抗體。具體實施例方式包含與序列號1、序列號4、序列號7或序列號10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(以下有時也稱為“本發(fā)明的蛋白質(zhì)”或“本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)”)可以是來源于人或溫血動物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、雞、兔、豬、羊、牛和猴等)的細胞(例如肝細胞、脾細胞、神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、胰腺β細胞、骨髓細胞、腎小球膜細胞、郎格罕氏細胞(Langerhans’cell)、表皮細胞、上皮細胞、杯狀細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、纖維細胞、肌細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例如巨噬細胞、T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、肥大細胞、嗜中性白細胞、嗜堿性細胞、嗜酸性細胞、單核細胞)、巨核細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞或間質(zhì)細胞，或這些細胞的前體細胞、干細胞或癌細胞等)，或這些細胞存在的所有組織，例如腦、腦的各部位(例如嗅球、扁桃核、大腦基底核、海馬、丘腦、下丘腦、大腦皮質(zhì)、延髓、小腦)、脊髓、垂體、胃、胰腺、腎臟、肝臟、生殖腺、甲狀腺、膽囊、骨髓、腎上腺、皮膚、肌肉、肺、消化道(例如大腸、小腸)、血管、心臟、胸腺、脾臟、頜下腺、外周血液、前列腺、睪丸、卵巢、胎盤、子宮、骨、關(guān)節(jié)、骨骼肌等的蛋白質(zhì)，也可以是合成蛋白質(zhì)。作為與序列號1所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，可以列舉與序列號1所示的氨基酸序列具有95％或更高、優(yōu)選約98％或更高、更優(yōu)選約99％或更高同源性的氨基酸序列等。作為含有與序列號1所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，例如優(yōu)選含有與上述序列號1所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列、并且具有與含有序列號1所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)基本上相同性質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)。作為與序列號4所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，可以列舉與序列號4所示的氨基酸序列具有99.9％或更高同源性的氨基酸序列等。作為含有與序列號4所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，例如優(yōu)選含有與上述序列號4所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列、并且具有與含有序列號4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)基本上相同性質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)。作為與序列號7所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，可以列舉與序列號7所示的氨基酸序列具有99.9％或更高同源性的氨基酸序列等。作為含有與序列號7所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，例如優(yōu)選含有與上述序列號7所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列、并且具有與含有序列號7所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)基本上相同性質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)。作為與序列號10所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，可以列舉與序列號10所示的氨基酸序列具有99.9％或更高同源性的氨基酸序列等。作為含有與序列號10所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，例如優(yōu)選含有與上述序列號10所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列、并且具有與含有序列號10所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)基本上相同性質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)。氨基酸序列的同源性可以用同源性計算NCBIBLAST(NationalCenterforBiotechnologyInformationBasicLocalAlignmentSearchTool)算法計算，在以下條件(期待值＝10；允許缺口；矩陣＝BLOSUM62；濾波(filtering)＝OFF)下進行計算?！盎旧舷嗤再|(zhì)”是指這些性質(zhì)在性質(zhì)上(例如生理學(xué)上或藥理學(xué)上)是相同的。因此，優(yōu)選本發(fā)明蛋白質(zhì)的活性相等(例如約0.01～100倍，優(yōu)選約0.1～10倍，更優(yōu)選約0.5～2倍)。上述活性的程度，例如蛋白質(zhì)的分子量等量的要素，可以不同。另外，本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)還包括所謂的突變蛋白質(zhì)，諸如以下蛋白質(zhì)(1)包含(i)在序列號1所示的氨基酸序列中缺失1個或2個或2個以上(例如1～50個左右，優(yōu)選1～30個左右，更優(yōu)選1～10個左右，進一步優(yōu)選數(shù)個(1～5個))氨基酸的氨基酸序列；(ii)在序列號1所示的氨基酸序列中添加1個或2個或2個以上(例如1～50個左右，優(yōu)選1～30個左右，更優(yōu)選1～10個左右，進一步優(yōu)選數(shù)個(1～5個))氨基酸的氨基酸序列；(iii)在序列號1所示的氨基酸序列中插入1個或2個或2個以上(例如1～50個左右，優(yōu)選1～30個左右，更優(yōu)選1～10個左右，進一步優(yōu)選數(shù)個(1～5個))氨基酸的氨基酸序列；(iv)序列號1所示的氨基酸序列中1個或2個或2個以上(例如1～50個左右，優(yōu)選1～30個左右，更優(yōu)選1～10個左右，進一步優(yōu)選數(shù)個(1～5個)、)氨基酸被其它氨基酸取代的氨基酸序列；或(v)將這些組合得到的氨基酸序列的蛋白質(zhì)等所謂的突變蛋白質(zhì)；(2)所謂的突變蛋白質(zhì)，諸如以下蛋白質(zhì)(i)在序列號4、序列號7或序列號10所示的氨基酸序列中缺失1個或2個氨基酸的氨基酸序列；(ii)在序列號4、序列號7或序列號10所示的氨基酸序列中添加1個或2個或2個以上(例如1～50個左右，優(yōu)選1～30個左右，更優(yōu)選1～10個左右，進一步優(yōu)選數(shù)個(1～5個))氨基酸的氨基酸序列；(iii)在序列號4、序列號7或序列號10所示的氨基酸序列中插入1個或2個氨基酸的氨基酸序列；(iv)序列號4、序列號7或序列號10所示的氨基酸序列中1個或2個氨基酸被其它氨基酸取代的氨基酸序列；或(v)這些氨基酸序列的組合等。如上所述，氨基酸序列被插入、缺失或取代時，對插入、缺失或取代的位置沒有特別限定。本說明書中的蛋白質(zhì)按照肽標記的慣例左端為N末端(氨基末端)，右端為C末端(羧基末端)。以包含序列號1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)為首的本發(fā)明所用蛋白質(zhì)的C末端可以是羧基(-COOH)、羧酸根基(-COO-)、酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)中的任意一種。此處所述酯中的R可以使用例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基等C1～6烷基，例如環(huán)戊基、環(huán)己基等C3-8環(huán)烷基，例如苯基、α-萘基等C6-12芳基，例如芐基、苯乙基等苯基-C1～2烷基或α-萘甲基等α-萘基-C1～2烷基等C7-14芳烷基，三甲基乙酰氧基甲基等。本發(fā)明所用的蛋白質(zhì)除了C末端以外還具有羧基(或羧酸根基)時，羧基被酰胺化或酯化得到的物質(zhì)也包括在本發(fā)明所用的蛋白質(zhì)中。此時，酯可以使用例如上述C末端的酯等。進一步地，本發(fā)明所用的蛋白質(zhì)還包括N末端氨基酸殘基(例如蛋氨酸殘基)中的氨基被保護基團(例如甲?；⒁阴；菴1～6烷酰基等的C1-6?；?保護得到的物質(zhì)、在機體內(nèi)被切斷生成的N末端的谷氨酸殘基被焦谷氨酸化了的物質(zhì)、分子內(nèi)的氨基酸側(cè)鏈上的取代基(例如-OH、-SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)被適當?shù)谋Ｗo基團(例如甲?；?、乙?；鹊菴1-6烷?；鹊腃1-6酰基等)保護了的物質(zhì)、或結(jié)合了糖鏈的所謂糖蛋白等復(fù)合蛋白質(zhì)等。本發(fā)明所用蛋白質(zhì)的具體例子可以列舉例如含有序列號1所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，含有序列號4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，含有序列號7所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，含有序列號10所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)等。本發(fā)明所用蛋白質(zhì)的部分肽是上述本發(fā)明所用蛋白質(zhì)的部分肽，優(yōu)選只要是具有與上述本發(fā)明所用蛋白質(zhì)相同的性質(zhì)的任何物質(zhì)均可。例如，可以使用包含構(gòu)成本發(fā)明所用蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的至少20個或更多、優(yōu)選50個或更多、更優(yōu)選70個或更多、進一步優(yōu)選100個或更多、最優(yōu)選200個或更多的氨基酸序列的肽。另外，本發(fā)明所用的部分肽也可以在其氨基酸序列中缺失1個或2個或2個以上(優(yōu)選1～20個左右，更優(yōu)選1～10個左右，進一步優(yōu)選數(shù)個(1～5個))氨基酸，或在其氨基酸序列中添加1個或2個或2個以上(優(yōu)選1～20個左右，更優(yōu)選1～10個左右，進一步優(yōu)選數(shù)個(1～5個))氨基酸，或在其氨基酸序列中插入1個或2個或2個以上(優(yōu)選1～20個左右，更優(yōu)選1～10個左右，進一步優(yōu)選數(shù)個(1～5個))氨基酸，或用其它氨基酸取代其氨基酸序列中的1個或2個或2個以上(優(yōu)選1～20個左右，更優(yōu)選1～1O個左右，進一步優(yōu)選數(shù)個(1～5個))氨基酸。本發(fā)明所用部分肽的C末端可以是羧基(-COOH)、羧酸根基(-COO-)、酰胺(CONH2)或酯(-COOR)中的任意一種。并且，與上述本發(fā)明所用的蛋白質(zhì)同樣，本發(fā)明所用的部分肽還包括除了C末端以外還具有羧基(或羧酸根基)的物質(zhì)、N末端氨基酸殘基(例如蛋氨酸殘基)中的氨基被保護基團保護了的物質(zhì)、N末端在機體內(nèi)被切斷生成的谷氨酸殘基被焦谷氨酸化了的物質(zhì)、分子內(nèi)的氨基酸側(cè)鏈上的取代基被適當?shù)谋Ｗo基團保護了的物質(zhì)、或結(jié)合了糖鏈的所謂糖肽等復(fù)合肽。本發(fā)明所用的部分肽可以用作用于制備抗體的抗原。本發(fā)明所用蛋白質(zhì)或部分肽的鹽，可以使用與生理學(xué)上可接受的酸(例如無機酸、有機酸)或堿(例如堿金屬鹽)等形成的鹽，特別優(yōu)選生理學(xué)上可接受的酸加成鹽。這些鹽可以使用例如與無機酸(例如鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)形成的鹽，或與有機酸(例如醋酸、甲酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、枸櫞酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的鹽等。本發(fā)明所用的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽可以由上述人或溫血動物的細胞或組織通過公知的蛋白質(zhì)純化方法制備，也可以通過培養(yǎng)包含編碼蛋白質(zhì)的DNA的轉(zhuǎn)化體來制備，還可以按照后述肽合成法制備。從人或哺乳動物的組織或細胞制備時，可以將人或哺乳動物的組織或細胞勻漿化后，用酸等進行提取，然后通過將反相色譜、離子交換色譜等色譜法組合對提取液進行純化分離。合成本發(fā)明所用的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽、或其酰胺物時，可以使用通常市售的蛋白質(zhì)合成用樹脂。作為這種樹脂，包括例如氯代甲基樹脂、羥甲基樹脂、二苯甲胺樹脂、氨基甲基樹脂、4-芐氧基芐醇樹脂、4-甲基二苯甲胺樹脂、PAM樹脂、4-羥甲基甲基苯基乙酰氨基甲基樹脂、聚丙烯酰胺樹脂、4-(2’，4’-二甲氧基苯基-羥甲基)苯氧基樹脂、4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc氨基乙基)苯氧基樹脂等。使用這些樹脂，根據(jù)目的蛋白質(zhì)的序列，氨基酸在樹脂上按照公知的各種縮合方法進行縮合，其中，所述氨基酸是α-氨基與側(cè)鏈官能基團被適當保護了的氨基酸。在反應(yīng)的最后從樹脂中切取蛋白質(zhì)或部分肽，同時除去各種保護基團，進一步在高度稀釋的溶液中進行分子內(nèi)的二硫鍵形成反應(yīng)，從而得到目的蛋白質(zhì)或其部分肽或它們的酰胺物。對于上述被保護的氨基酸的縮合，可以使用蛋白質(zhì)合成時使用的各種活化試劑，特別是可以為碳化二亞胺。作為碳化二亞胺，可以使用DCC、N，N’-二異丙基碳化二亞胺、N-乙基-N’-(3-二甲氨基脯氨?；?碳化二亞胺等。這些試劑導(dǎo)致的活化中，可以將被保護的氨基酸與消旋化抑制添加劑(例如HOBt、HOOBt)一起直接加到樹脂中，或者將被保護的氨基酸預(yù)先以對稱酸酐或HOBt酯或HOOBt酯的形式活化，然后加入到樹脂中。被保護的氨基酸的活化或與樹脂的縮合中所用的溶劑可以從已知可以用于蛋白質(zhì)縮合反應(yīng)的溶劑中適當選擇。例如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺類，二氯甲烷、氯仿等鹵代烴類，三氟乙醇等醇類，二甲亞砜等亞砜類，吡啶、二噁烷、四氫呋喃等醚類，乙腈、丙腈等腈類，乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯類或上述溶劑的合適混合物等。反應(yīng)溫度可以在已知可以用于蛋白鍵形成反應(yīng)的范圍內(nèi)適當選擇，通常在約-20℃～50℃的范圍內(nèi)適當選擇。被活化的氨基酸衍生物通常以1.5～4倍過量使用。通過使用水合茚三酮反應(yīng)進行測定的結(jié)果表明，縮合不充分時，不進行保護基團的脫離而反復(fù)進行縮合反應(yīng)，由此可以充分進行縮合。即使反復(fù)進行反應(yīng)也不能充分縮合時，通過使用乙酸酐或乙酰咪唑使未反應(yīng)的氨基酸乙?；?，由此可以避免對后續(xù)反應(yīng)的影響。作為原料中的氨基的保護基團，可以使用例如Z、Boc、叔戊氧基羰基、異冰片基氧基羰基、4-甲氧基芐氧基羰基、Cl-Z、Br-Z、金剛烷氧基羰基、三氟乙酰基、鄰苯二甲酰基、甲?；?、2-硝基苯基亞磺酰基(nitrophenylsulphenyl)、二苯基硫膦基(diphenylphosphinothioyl)、Fmoc等。羧基可以通過烷基酯化(例如甲基、氧基、丙基、丁基、叔丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、2-金剛烷基等直鏈、支鏈或環(huán)烷基酯化)、芳烷基酯化(例如芐基酯、4-硝基芐基酯、4-甲氧基芐基酯、4-氯芐基酯、二苯甲基酯化等)、苯甲酰甲基酯化、芐氧基羰基酰肼化、叔丁氧羰基酰肼化和三苯甲基酰肼化等進行保護。絲氨酸的羥基可以通過例如酯化或醚化進行保護。適合用于該酯化的基團可以使用例如乙?；鹊图?C1-6)烷?；?、芐基等芳?；?、芐氧基羰基、乙氧基羰基等由碳酸衍生的基團等。適合用于醚化的基團包括例如芐基、四氫呋喃基和叔丁基等。酪氨酸酚性羥基的保護基團可以使用例如Bzl、Cl2-Bzl、2-硝基芐基、Br-Z和叔丁基等。組氨酸的咪唑部分的保護基團可以使用例如Tos、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺?；?、DNP、芐氧甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc等。原料中羰基活化了的氨基酸可以使用例如對應(yīng)的酸酐、疊氮化物、活化酯[與醇(例如五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基苯酚、氰基甲基醇、對硝基苯酚、HONB、N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺、HOBt)的酯]。原料中活化了氨基的氨基酸可以使用例如對應(yīng)的磷酸酰胺。作為除去(脫離)保護基團的方法，可以使用例如在Pd-黑或Pd-碳等催化劑的存在下在氫氣流中進行的催化還原，或使用無水氟化氫、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟醋酸或其混合物等進行的酸處理，或用二異丙基乙胺、三乙胺、哌啶和哌嗪等進行的堿處理，或在液氨中用鈉進行還原等。上述通過酸處理進行的脫離反應(yīng)一般可以在約-20℃～40℃的溫度進行。在酸處理中，加入茴香醚、苯酚、茴香硫醚、間甲酚、對甲酚、二甲硫醚、1，4-丁二硫醇、1，2-乙二硫醇等陽離子捕捉劑是有效的。另外，用作組氨酸咪唑部分的保護基團的2，4-二硝基苯基通過苯硫酚處理除去，用作色氨酸的吲哚保護基團的甲?；ㄟ^上述在1，2-乙二硫醇、1，4-丁二硫醇等存在下的酸處理進行脫保護，除此之外還可以通過使用稀氫氧化鈉溶液、稀氨水等的堿處理除去。不應(yīng)參與原料反應(yīng)的官能團的保護以及保護基團、和該保護基團的消除，參與反應(yīng)的官能團的活化等可以從公知的基團或公知的方法中適當選擇。作為獲得蛋白質(zhì)或部分肽的酰胺物的其它方法，例如，首先使羧基末端氨基酸的α-羧基酰胺化而進行保護后，在氨基側(cè)將肽(蛋白質(zhì))鏈延長到所需的鏈長，然后制備僅僅除去所述肽鏈N末端的α-氨基保護基團的蛋白質(zhì)或部分肽和僅僅除去C末端羧基保護基團的蛋白質(zhì)或部分肽，使這些蛋白質(zhì)或肽在如上述的混合溶劑中進行縮合。縮合反應(yīng)的詳述與上述相同。將縮合得到的保護蛋白質(zhì)或肽純化后，通過上述方法除去所有的保護基團，得到所需的粗制蛋白質(zhì)或肽。使用已知的各種純化方法純化該粗制蛋白質(zhì)或肽，然后將主要級分凍干，由此可以獲得所需的蛋白質(zhì)或肽的酰胺物。為了獲得蛋白質(zhì)或肽的酯，可以例如使羧基末端氨基酸的α-羧基與所需的醇類縮合制成氨基酸酯，然后與蛋白質(zhì)或肽的酰胺物同樣處理，從而得到所需的蛋白質(zhì)或肽的酯。本發(fā)明所用的部分肽或其鹽可以按照公知的肽合成方法制備，或通過用適當?shù)碾拿盖袛啾景l(fā)明所用的蛋白質(zhì)來制備。肽的合成方法可以使用固相合成法和液相合成法中的任何一種。即，使部分肽或氨基酸與殘余部分縮合，當產(chǎn)物帶有保護基團時除去保護基團，由此可以制備目的肽，其中所述的部分肽或氨基酸可以構(gòu)成本發(fā)明所用部分肽。公知的縮合方法或脫保護基團的方法可以列舉以下(i)～(v)中記載的方法(i)M.Bodanszky&M.A.OndettiPeptideSynthesis，IntersciencePublishers，NewYork(1966)(ii)Schroeder&LuebkeThePeptide，AcademicPress，NewYork(1965)(iii)NobuoIzumiya，etal.PeptideGosei-no-KisotoJikken(Basicsandexperimentsofpeptidesynthesis)，publishedbyMaruzenCo.(1975)(iv)HaruakiYajima&ShunpeiSakakibaraSeikagakuJikkenKoza(BiochemicaiExperiment)1，TanpakushitsunoKagaku(ChemistryofProteins)IV，205(1977)(v)HaruakiYajimaed.ZokuIyakuhinnoKaihatsu(AsequeltoDevelopmentofPharmaceuticals)，Vol.14，PeptideSynthesis，publishedbyHirokawaShoten另外，反應(yīng)后可以通過常規(guī)純化方法，例如溶劑提取、蒸餾、柱色譜、液相色譜和重結(jié)晶等的組合純化分離本發(fā)明所用的部分肽。通過上述方法得到的部分肽為游離形式時，可以通過公知方法或其改進方法轉(zhuǎn)化成適當?shù)柠}。相反，如果得到的部分肽為鹽，則可以通過公知方法或其改進方法轉(zhuǎn)化成游離形式或其它鹽。作為編碼本發(fā)明所用蛋白質(zhì)的多核苷酸，可以是任何多核苷酸，只要其包含上述編碼本發(fā)明所用蛋白質(zhì)的堿基序列即可。優(yōu)選多核苷酸是DNA。該DNA可以是基因組DNA、基因組DNA文庫、來源于上述細胞或組織的cDNA、來源于上述細胞或組織的cDNA文庫、合成DNA中的任意一種。文庫所用的載體可以是噬菌體、質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒等中的任何一種。另外，還可以用由上述細胞或組織制備的總RNA或mRNA級分，直接通過逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(以下簡稱為“RT-PCR”)擴增DNA。編碼本發(fā)明所用蛋白質(zhì)的DNA可以是例如下述中的任何一個(i)含有序列號2所示的堿基序列的DNA，或含有與序列號2所示的堿基序列在高度嚴格條件下雜交的堿基序列、且編碼與含有序列號1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有基本上相同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的DNA；(ii)含有序列號5所示的堿基序列的DNA，或含有與序列號5所示的堿基序列在高度嚴格條件下雜交的堿基序列、且編碼與含有序列號4所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有基本上相同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的DNA；(iii)含有序列號8所示的堿基序列的DNA，或含有與序列號8所示的堿基序列在高度嚴格條件下雜交的堿基序列、且編碼與含有序列號7所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有基本上相同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的DNA；(iv)含有序列號11所示的堿基序列的DNA，或含有與序列號11所示的堿基序列在高度嚴格條件下雜交的堿基序列、且編碼與含有序列號10所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有基本上相同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的DNA。作為可以與序列號2所示的堿基序列在高度嚴格條件下雜交的DNA，使用例如包含與序列號2所示的堿基序列具有95％或更高、優(yōu)選約98％或更高、更優(yōu)選約99％或更高同源性的堿基序列的DNA等。作為可以與序列號5所示的堿基序列在高度嚴格條件下雜交的DNA，使用例如包含與序列號5所示的堿基序列具有99.9％或更高同源性的堿基序列的DNA等。作為可以與序列號8所示的堿基序列在高度嚴格條件下雜交的DNA，使用例如包含與序列號8所示的堿基序列具有99.9％或更高同源性的堿基序列的DNA等。作為可以與序列號11所示的堿基序列在高度嚴格條件下雜交的DNA，使用例如包含與序列號11所示的堿基序列具有99.9％或更高同源性的堿基序列的DNA等。雜交可以通過公知的方法或其改進方法進行，例如MolecularCloning，第2版(J.Sambrook等，ColdSpringHarborLab.Press，1989)中公開的方法等。另外，使用市售的基因文庫時，可以按照隨附的使用說明書中記載的方法進行。更優(yōu)選按照高度嚴格的條件進行。高度嚴格的條件是指例如鈉濃度為約19～40mM、更優(yōu)選約19～20mM，溫度為約50～70℃、優(yōu)選約60～65℃的條件。特別是最優(yōu)選鈉濃度為約19mM、溫度為約65℃的條件。更具體地，使用(i)含有序列號2所示堿基序列的DNA或含有序列號3所示堿基序列的DNA等作為編碼含有序列號1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA；(ii)含有序列號5所示堿基序列的DNA或含有序列號6所示堿基序列的DNA等作為編碼含有序列號4所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA；(iii)含有序列號8所示堿基序列的DNA或含有序列號9所示堿基序列的DNA等作為編碼含有序列號7所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA；(iv)含有序列號11所示堿基序列的DNA或含有序列號12所示堿基序列的DNA等作為編碼含有序列號10所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA。編碼本發(fā)明所用部分肽的多核苷酸(例如DNA)，只要是包含上述編碼本發(fā)明所用部分肽的堿基序列的多核苷酸即可。另外，還可以是基因組DNA、基因組DNA文庫、來源于上述細胞或組織的cDNA、來源于上述細胞或組織的cDNA文庫、合成DNA中的任意一種。作為編碼本發(fā)明所用部分肽的DNA，使用例如包含含有序列號2、序列號5、序列號8或序列號11所示堿基序列的DNA的一部分的DNA，或含有與序列號2、序列號5、序列號8或序列號11所示堿基序列在高度嚴格條件下雜交的堿基序列、且包含編碼與本發(fā)明蛋白質(zhì)具有基本上相同性質(zhì)活性的蛋白質(zhì)的DNA的一部分的DNA等?？梢耘c序列號2、序列號5、序列號8或序列號11所示堿基序列雜交的DNA定義與上述相同。雜交方法和高度嚴格的條件與上述相同。作為完全編碼本發(fā)明所用蛋白質(zhì)、部分肽(以下在說明編碼這些的DNA的克隆和表達時，有時將這些簡稱為本發(fā)明的蛋白質(zhì))的DNA的克隆方法，可以通過PCR法用包含編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的堿基序列的一部分的合成DNA引物進行擴增；或者將插入到適當載體中的DNA通過與標記的DNA片段或合成DNA的雜交來篩選，其中所述標記的DNA片段或合成DNA是編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的一部分或整個區(qū)域的DNA片段或合成DNA。雜交可以按照例如MolecularCloning，2nd(J.Sambrook等，ColdSpringHarborLab.Press，1989)中公開的方法進行。另外，使用市售的基因文庫時，可以按照隨附的使用說明書記載的方法進行。DNA堿基序列的變換可以使用PCR、公知試劑盒例如MutanTM-superExpressKm(TakaraShuzoCo.，Ltd.)或MutanTM-K(TakaraShuzoCo.，Ltd.)等按照ODA-LAPCR法、Gappedduplex法和Kunkel法等公知的方法或其改進方法進行。被克隆了的編碼蛋白質(zhì)的DNA可以根據(jù)目的直接使用，或根據(jù)需要用限制酶消化或添加連接體(linker)后再使用。該DNA可以在其5′末端側(cè)包含ATG作為翻譯起始密碼子，也可以在3′末端側(cè)具有TAA、TGA或TAG作為翻譯終止密碼子。這些翻譯起始密碼子也可以用適當?shù)暮铣蒁NA連接片段添加。本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達載體可以通過例如如下制備(a)從編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA上切取目的DNA片段，然后(b)將該DNA片段連接到適當表達載體中的啟動子下游。載體可以使用來源于大腸桿菌的質(zhì)粒(例如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、來源于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的質(zhì)粒(例如pUB110、pTP5、pC194)、來源于酵母的質(zhì)粒(例如pSH19、pSH15)、λ噬菌體等噬菌體、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒(vacciniavirus)、桿狀病毒等動物病毒，以及pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。本發(fā)明所用的啟動子只要適合于基因表達所用的宿主，可以是任何啟動子。例如當用動物細胞作為宿主時，可以列舉SRα啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CMV啟動子和HSV-TK啟動子等。其中優(yōu)選使用CMV(巨細胞病毒)啟動子和SRα啟動子等。當宿主為大腸桿菌屬細菌時，優(yōu)選trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、lpp啟動子、T7啟動子等；當宿主為芽孢桿菌屬細菌時，優(yōu)選SPO1啟動子、SPO2啟動子、penP啟動子等；當宿主為酵母時，優(yōu)選PHO5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子等；當宿主為昆蟲細胞時，優(yōu)選多角體蛋白啟動子、P10啟動子等。除了上述例子之外，表達載體還可以使用根據(jù)需要含有增強子、剪接信號、聚合A添加信號、選擇性標記子、SV40復(fù)制起點(以下有時簡稱為SV40ori)等的載體。選擇性標記子包括例如二羥基葉酸還原酶(以下有時簡稱為“dhfr”)基因[甲氨蝶呤(MTX)抗藥性]、氨芐西林抗藥性基因(以下有時簡稱為“Ampr”)、新霉素抗藥性基因(以下有時簡稱為“Neor”，G418抗藥性)等。特別是使用dhfr基因缺失的中國倉鼠細胞，以dhfr基因作為選擇性標記子時，目的基因也可以用不含胸苷的培養(yǎng)基進行選擇。另外，根據(jù)需要，可在本發(fā)明蛋白質(zhì)的N末端添加與宿主匹配的信號序列。當宿主為大腸桿菌屬細菌時，可以使用PhoA·信號序列、OmpA·信號序列等；宿主為芽孢桿菌屬細菌時，可以使用α-淀粉酶·信號序列、枯草芽孢桿菌蛋白酶·信號序列等；當宿主為酵母時，可以使用MFα·信號序列、SUC2·信號序列等；當宿主為動物細胞時，可以使用胰島素信號序列、α-干擾素·信號序列、抗體分子·信號序列等?？梢允褂萌缟蠘?gòu)建的包含編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA的載體制備轉(zhuǎn)化體。宿主可以使用例如大腸桿菌屬細菌、芽孢桿菌屬細菌、酵母、昆蟲細胞、昆蟲和動物細胞等。作為大腸桿菌屬細菌的具體例子，使用例如大腸桿菌(Escherichiacoli)K12DH1[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，60，160(1968)]、JM103[NucleicAcidsResearch，9，309(1981)]、JA221[JournalofMolecularBiology，120，517(1978)]、HB101[JournalofMolecularBiology，41，459(1969)]、C600[Genetics，39，440(1954)]等。芽孢桿菌屬細菌使用例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)MI114[Gene，24，255(1983)]、207-21[JournalofBiochemistry，95，87(1984)]等酵母使用例如啤酒糖酵母(Saccharomycescereviseae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12，栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)NCYC1913、NCYC2036，巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)KM71等。作為昆蟲細胞，例如當病毒為AcNPV時，使用來源于草地貪夜蛾幼蟲的細胞株(Spodopterafrugiperdacell，Sf田胞)、來源于粉紋夜蛾(Trichoplusiani)中腸的MG1細胞、來源于粉紋夜蛾卵的HighFiveTM細胞、來源于Mamestrabrassicae的細胞、來源于棉黑紋燈蛾(Estigmenaacrea)的細胞等。當病毒為BmNPV時，使用來源于家蠶(BombyxmoriN，BmN細胞)的細胞株等。作為所述Sf田胞，使用例如Sf9細胞(ATCCCRL1711)、Sf21細胞(兩種細胞都公開在Vaughn，J.L.等，InVivo，13，213-217(1977))等。昆蟲使用例如蠶的幼蟲等[Maeda等，Nature，315，592(1985)]。動物細胞使用例如猴細胞COS-7、Vero，中國倉鼠細胞CHO(以下簡稱為“CHO細胞”)，dhfr基因缺失型中國倉鼠細胞CHO(以下簡稱為“CHO(dhfr-)細胞”)，小鼠L細胞、小鼠AtT-20、小鼠骨髓瘤細胞、小鼠ATDC5細胞、大鼠GH3和人FL細胞等。大腸桿菌屬細菌可以按照例如Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，69，2110(1972)，Gene，17，107(1982)等中公開的方法進行轉(zhuǎn)化。芽孢桿菌屬細菌可以按照例如Molecular&GeneralGenetics，168，111(1979)等中公開的方法進行轉(zhuǎn)化。酵母可以按照例如MethodsinEnzymology，194，182-187(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，1929(1978)等中公開的方法進行轉(zhuǎn)化。昆蟲細胞或昆蟲可以按照例如Bio/Technology，6，47-55(1988)等中公開的方法進行轉(zhuǎn)化。動物細胞可以按照例如SaiboKogaku(CellEngineering)，extraissue8，ShinSaiboKogakuJikkenProtocol(NewCellEngineeringExperimentalProtocol)，263-267(1995)(publishedbyShujunsha)或Virology，52，456(1973)中公開的方法進行轉(zhuǎn)化。這樣就可以得到用包含編碼蛋白質(zhì)的DNA的表達載體轉(zhuǎn)化過的轉(zhuǎn)化體。在培養(yǎng)大腸桿菌屬或芽孢桿菌屬的細菌時，轉(zhuǎn)化體可適宜地培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中，其中含有該轉(zhuǎn)化體生長發(fā)育所必需的碳源、氮源和無機物等。碳源包括例如葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等，氮源包括例如銨鹽類、硝酸鹽類、玉米浸漬液、蛋白胨、酪蛋白、肉提取物、豆餅、馬鈴薯提取物等無機或有機物質(zhì)，無機物包括例如氯化鈣、磷酸二氫鈉和氯化鎂等。另外，還可以添加酵母提取物、維生素類和生長促進因子等。培養(yǎng)基的pH值優(yōu)選約為5～8。培養(yǎng)大腸桿菌屬細菌的培養(yǎng)基優(yōu)選例如包含葡萄糖和酪蛋白氨基酸(Casaminoacids)的M9培養(yǎng)基[Miller，JournalofExperimentsinMolecularGenetics，431-433，ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，1972]。根據(jù)需要，可以向該培養(yǎng)基中加入例如3β-吲哚基丙烯酸等試劑以高效地激活啟動子。當宿主為大腸桿菌屬細菌時，所述轉(zhuǎn)化體通常培養(yǎng)在約15～43℃、約3～24小時。根據(jù)需要還可以通氣或攪拌。當宿主為芽孢桿菌屬細菌時，所述轉(zhuǎn)化體通常培養(yǎng)在約30～40℃、約6～24小時。根據(jù)需要還可以通氣或攪拌。當宿主為酵母時，可以使用例如Burkholder′s基本培養(yǎng)基[Bostian，K.L等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77，4505(1980)]或含有0.5％酪蛋白氨基酸的SD培養(yǎng)基[Bitter，G.A.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，5330(1984)]作為轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基。優(yōu)選培養(yǎng)基的pH值調(diào)至約5～8。培養(yǎng)通常在約20～35℃進行約24～72小時。根據(jù)需要還可以通氣或攪拌。當宿主為昆蟲細胞或昆蟲時，所述轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)可以使用例如適當添加了固定了的10％牛血清等物質(zhì)的Grace′sInsect培養(yǎng)基(Grace，T.C.C.，Nature)，195，788(1962))等作為培養(yǎng)基。優(yōu)選培養(yǎng)基的pH值調(diào)至約6.2～6.4。培養(yǎng)通常在約27℃進行約3～5天。根據(jù)需要還可以通氣或攪拌。當培養(yǎng)的是宿主為動物細胞的轉(zhuǎn)化體時，使用例如包含約5～20％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基[Science，122.，501(1952)]、DMEM培養(yǎng)基[Virology，8，396(1959)]、RPMI1640培養(yǎng)基[TheJournaloftheAmericanMedicalAssociation，199，519(1967)]、199培養(yǎng)基[ProceedingoftheSocietyfortheBiologicalMedicine，73，1(1950)]等作為培養(yǎng)基。優(yōu)選培養(yǎng)基的pH約為6～8。優(yōu)選培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5～8。培養(yǎng)通常在約30～40℃進行約15～60小時。根據(jù)需要還可以通氣或攪拌。如上所述，可以在轉(zhuǎn)化體的細胞內(nèi)、細胞膜上或轉(zhuǎn)化體外產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)。例如可以按照以下方法從上述培養(yǎng)物中分離純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)。當從培養(yǎng)菌體或細胞中提取本發(fā)明的蛋白質(zhì)時，可以適當使用下述方法等。即，在培養(yǎng)后通過公知的方法收集菌體或細胞，并將其懸浮在適當?shù)木彌_液中，通過超聲波、溶菌酶和/或冷凍融化等將菌體或細胞破壞，然后通過離心分離或過濾得到蛋白質(zhì)的粗制提取液。緩沖液中也可以含有尿素或鹽酸胍等蛋白改性劑或TritonX-100TM等表面活性劑。當?shù)鞍踪|(zhì)分泌到培養(yǎng)液中時，在培養(yǎng)終止后，通過公知的方法將菌體或細胞與上清分離并收集上清。通過上述方法得到的培養(yǎng)上清或提取液中所含的蛋白質(zhì)，可以適當組合使用公知的分離、純化方法進行純化。所述公知的分離、純化方法包括鹽析、或溶劑沉淀法等利用溶解度的方法，透析法、超濾法、凝膠濾法和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳等主要利用分子量差的方法，離子交換色譜等利用電荷差的方法，親和層析等利用特異性親和性的方法，反相高效液相色譜等利用疏水性差的方法，和等電點電泳法等利用等電點差的方法等。當所得的蛋白質(zhì)為游離形式時，可以通過公知的方法或其改進方法變成鹽。反過來，所得的蛋白質(zhì)為鹽時，可以通過公知的方法或其該方法變成游離形式或其它的鹽。另外，還可以將重組體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在純化前或純化后用適當?shù)牡鞍仔揎椕高M行處理，由此任意地施加修飾或部分地除去多肽。蛋白修飾酶可以使用例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、精氨酰內(nèi)肽酶、蛋白激酶和糖苷酶等。由此生成的本發(fā)明蛋白質(zhì)的存在可以通過使用特異性抗體的酶免疫測定或蛋白印跡法進行測定。本發(fā)明所用蛋白質(zhì)或部分肽或其鹽的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體中的任意一種，只要其可以識別本發(fā)明所用蛋白質(zhì)或部分肽或其鹽。本發(fā)明所用蛋白質(zhì)或部分肽或其鹽(以下在抗體的說明中有時將這些簡稱為“本發(fā)明的蛋白質(zhì)”)的抗體，可以通過用本發(fā)明的蛋白質(zhì)作為抗原并按照公知的抗體或抗血清制備方法制備。(a)單克隆抗體產(chǎn)生細胞的制備可以將本發(fā)明的蛋白質(zhì)單獨或與載體、稀釋劑一起向溫血動物給藥至可以通過給藥產(chǎn)生抗體的部位。給藥時，為了提高抗體產(chǎn)生能力，還可以給藥完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑。通常是每2～6周給藥1次，一共給藥2～10次左右。所用的溫血動物包括例如猴、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、綿羊、山羊和雞等，優(yōu)選使用小鼠和大鼠。制備單克隆抗體產(chǎn)生細胞時，從用抗原免疫了的溫血動物例如小鼠中選擇抗體滴度確認了的個體，從最終免疫開始2～5天后采集脾臟或淋巴結(jié)，并使其中所含的抗體產(chǎn)生細胞與同種或異種動物的骨髓瘤細胞融合，由此可以制備單克隆抗體產(chǎn)生雜交瘤?？寡逯械目贵w滴度可以通過例如使后述的標記蛋白質(zhì)與抗血清反應(yīng)，然后測定與抗體結(jié)合的標記物的活性來測定。融合操作可以按照已知的方法例如Koehler和Milstein的方法[ature，256，495(1975)]進行。融合促進劑包括例如聚乙二醇(PEG)和仙臺病毒等，優(yōu)選使用PEG。骨髓瘤細胞的例子包括例如NS-1、P3U1、SP2/0和AP-1等溫血動物的骨髓瘤細胞等，優(yōu)選使用P3U1。所用的抗體產(chǎn)生細胞(脾臟細胞)數(shù)與骨髓瘤細胞數(shù)之比優(yōu)選為1∶1～20∶1。以10～80％左右的濃度添加PEG(優(yōu)選PEG1000～PEG6000)，然后在20～40℃、優(yōu)選30～37℃溫育1～10分鐘，由此可以高效地進行細胞融合?？梢允褂酶鞣N方法篩選產(chǎn)生的單克隆抗體雜交瘤，可以列舉例如以下方法向直接吸附或與載體一起吸附了蛋白質(zhì)抗原的固體相(例如微量培養(yǎng)板)中加入雜交瘤培養(yǎng)上清，然后加入用放射性物質(zhì)或酶等標記了的抗免疫球蛋白抗體(細胞融合所用的細胞為小鼠細胞時，使用抗小鼠免疫球蛋白抗體)或蛋白質(zhì)A，并檢測與固體相結(jié)合的單克隆抗體的方法；向吸附了抗免疫球蛋白抗體或蛋白質(zhì)A的固體相中添加雜交瘤培養(yǎng)上清，然后加入用放射性物質(zhì)或酶標記了的蛋白質(zhì)，并檢測與固體相結(jié)合的單克隆抗體的方法等。單克隆抗體的篩選可以按照公知的方法或其改進方法進行。通常用添加了HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)的動物細胞用培養(yǎng)基進行。篩選和育種用培養(yǎng)基可以使用只要使雜交瘤可以生長發(fā)育的任何培養(yǎng)基。例如可以使用含有1～20％、優(yōu)選10～20％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基、包含1～10％胎牛血清的GIT培養(yǎng)基(和光純藥工業(yè)(株))或用于培養(yǎng)雜交瘤的無血清培養(yǎng)基(SFM-101，日水制藥(株))等。培養(yǎng)溫度通常為20～40℃，優(yōu)選37℃。培養(yǎng)時間通常為5天～3周，優(yōu)選1周～2周。培養(yǎng)通常在5％CO2中進行。雜交瘤培養(yǎng)上清的抗體滴度可以與上述抗血清中的抗體滴度同法測定。(b)單克隆抗體的純化單克隆抗體的分離純化可以按照公知的方法進行，例如免疫球蛋白的分離純化方法[例如鹽析法、醇沉淀法、等電點沉淀法、電泳法、利用離子交換體(例如DEAE)的吸附和解吸法、超速離心法、凝膠過濾法、用抗原結(jié)合固體相或蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G等活性吸附劑僅僅采集抗體，然后使結(jié)合分離得到抗體的特異性純化法]。本發(fā)明的多克隆抗體可以按照公知的方法或其改進方法制備。例如可以如下制備制備免疫原(蛋白質(zhì)抗原)本身或其與載體蛋白的復(fù)合物，然后以與上述單克隆抗體制備方法同樣地免疫溫血動物，從該經(jīng)免疫的動物采集含有本發(fā)明蛋白質(zhì)抗體的物質(zhì)，并進行抗體的分離純化。在用于免疫溫血動物的免疫原與載體蛋白質(zhì)的復(fù)合物中，載體蛋白質(zhì)的種類以及載體蛋白質(zhì)與半抗原的混合比例可以是任何類型和以任意比例，只要抗體可以高效地針對通過交聯(lián)到載體蛋白而用于免疫的半抗原產(chǎn)生。例如，按照重量比計，以半抗原為1，可以采用使牛血清白蛋白或牛甲狀腺球蛋白、血藍蛋白為約0.1～20、優(yōu)選為約1～5的比例進行偶聯(lián)的方法。另外，半抗原與載體蛋白偶聯(lián)時可以使用各種縮合劑。使用戊二醛、碳化二亞胺、馬來酰亞胺活化酯和含有巰基、二硫代吡啶基的活化酯等試劑進行偶聯(lián)?？梢詫⒖s合產(chǎn)物本身或與載體、稀釋劑一起向溫血動物給藥至可以產(chǎn)生抗體的部位。給藥時，為了提高抗體產(chǎn)生能力，還可以給藥完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑。通常是每2～6周給藥1次，一共給藥3～10次左右。多克隆抗體可以從通過上述方法免疫了的溫血動物的血液和腹水等中采集，優(yōu)選從血液中采集。抗血清中的多克隆抗體滴度測定可以利用與上述抗血清中的抗體滴度測定同法進行。多克隆抗體的分離純化可以按照與上述單克隆抗體的分離純化相同的免疫球蛋白分離純化方法進行。含有與編碼本發(fā)明所用蛋白質(zhì)或部分肽的多核苷酸(例如DNA(以下在反義多核苷酸的說明中有時將這些DNA統(tǒng)稱為“本發(fā)明的DNA”)的堿基序列互補或基本上互補的堿基序列或其一部分的反義多核苷酸可以是任何反義多核苷酸，只要其含有與本發(fā)明的多核苷酸(例如DNA)的堿基序列互補或基本上互補的堿基序列或其一部分，并具有能抑制該DNA表達的作用，其中優(yōu)選反義DNA。與本發(fā)明的DNA基本上互補的堿基序列包括，例如，與本發(fā)明DNA的互補堿基序列(即本發(fā)明DNA的互補鏈)的整個堿基序列或其一部分具有約70％或更高、優(yōu)選約80％或更高、更優(yōu)選約90％或更高、最優(yōu)選約95％或更高同源性的堿基序列等。特別是在本發(fā)明DNA的互補鏈的整個堿基序列中，(a)在導(dǎo)致翻譯抑制的反義多核苷酸的情況下，與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)N末端部位的部分堿基序列(例如起始密碼子附近的堿基序列等)的互補鏈具有約70％或更高、優(yōu)選約80％或更高、更優(yōu)選約90％或更高、最優(yōu)選約95％或更高同源性的反義多核苷酸；(b)在導(dǎo)致RnaseH對RNA的降解的反義多核苷酸的情況下，與含有內(nèi)含子的本發(fā)明DNA的整個堿基序列的互補鏈具有約70％或更高、優(yōu)選約80％或更高、更優(yōu)選約90％或更高、最優(yōu)選約95％或更高同源性的反義多核苷酸。具體例子包括含有下述堿基序列或其一部分的反義多核苷酸，所述堿基序列與包含序列號2、序列號3、序列號5、序列號6、序列號8、序列號9、序列號11或序列號12所示堿基序列的DNA堿基序列互補或基本上互補。優(yōu)選含有下述堿基序列或其一部分的反義多核苷酸等，所述堿基序列與包含序列號2、序列號3、序列號5、序列號6、序列號8、序列號9、序列號11或序列號12所示堿基序列的DNA堿基序列互補。反義多核苷酸通常包含10～40個左右、優(yōu)選15～30個左右的堿基。為了防止核酸酶等水解酶導(dǎo)致的分解，構(gòu)成反義DNA的各核苷酸的磷酸殘基(磷酸酯)可以被例如硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯等化學(xué)修飾的磷酸殘基所取代。另外，各核苷酸的糖(脫氧核糖)可以被2′-O-甲基化等化學(xué)修飾糖結(jié)構(gòu)取代，堿基部分(嘧啶、嘌呤)也可以進行化學(xué)修飾，只要可以與包含序列號2所示堿基序列的DNA雜交即可。這些反義多核苷酸可以使用公知的DNA合成裝置等制備。根據(jù)本發(fā)明，能夠抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)基因復(fù)制或表達的該基因?qū)?yīng)的反義多核苷酸(核酸)，可以以編碼已克隆或鑒定的蛋白質(zhì)的DNA的堿基序列信息為基礎(chǔ)進行設(shè)計、合成。所述反義多核苷酸可以與本發(fā)明蛋白質(zhì)基因的RNA雜交，或抑制該RNA的合成或功能，或通過與本發(fā)明蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)的RNA之間的相互作用而調(diào)解、控制本發(fā)明蛋白質(zhì)基因的表達。與和本發(fā)明蛋白質(zhì)相關(guān)的RNA的選定序列互補的多核苷酸、以及可以與本發(fā)明蛋白質(zhì)相關(guān)的RNA特異性雜交的多核苷酸，對于在機體內(nèi)和機體外調(diào)解、控制本發(fā)明蛋白質(zhì)基因的表達是有用的，還對疾病等的治療或診斷是有用的。術(shù)語“對應(yīng)”是指與包含基因的核苷酸、堿基序列或核酸的特定序列具有同源性或互補。核苷酸、堿基序列或核酸與蛋白質(zhì)之間的“對應(yīng)”通常是指由核苷酸(核酸)的序列或其互補序列衍生(在于指令)的蛋白質(zhì)的氨基酸。蛋白質(zhì)基因的5′末端發(fā)夾環(huán)、5′末端6-堿基對重復(fù)單元、5′末端非翻譯區(qū)域、多肽翻譯起始密碼子、蛋白質(zhì)編碼區(qū)域、ORF翻譯終止密碼子、3′末端非翻譯區(qū)域、3′末端回文結(jié)構(gòu)區(qū)域、或3味端發(fā)夾環(huán)等可以優(yōu)選選擇作為對象區(qū)域，蛋白質(zhì)基因內(nèi)的所有區(qū)域也可以選擇作為對象。目的核酸和與對象區(qū)域的至少一部分互補的多核苷酸之間的關(guān)系，具體是目的核酸與可以同對象區(qū)域雜交的多核苷酸之間的關(guān)系是“反義”的。反義多核苷酸包括例如含有2-脫氧-D-核糖的多核苷酸、含有D-核糖的多核苷酸、作為嘌呤或嘧啶堿基的N-糖苷的其它類型的多核苷酸、具有非核苷酸骨架的其它聚合物(例如市售的蛋白質(zhì)核酸和合成序列特異性核酸聚合物)或包含特殊的鍵的聚合物(該聚合物包含具有下述結(jié)構(gòu)的核苷酸，該結(jié)構(gòu)允許如在DNA或RNA中所見的堿基配對或堿基附著)等。這些多核苷酸可以是雙鏈DNA、單鏈DNA、雙鏈RNA、單鏈RNA或DNA:RNA雜交體，還可以是非修飾的多核苷酸(或非修飾的寡核苷酸)被進行了公知的修飾所得的物質(zhì)，例如帶有本領(lǐng)域已知標記的物質(zhì)、帶帽的物質(zhì)、甲基化的物質(zhì)、用類似物取代1個或1個以上天然核苷酸所得的物質(zhì)、進行了分子內(nèi)核苷酸修飾的物質(zhì)，例如帶有非電荷鍵(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯和氨基甲酸酯等)和帶有電荷的鍵或含硫鍵(例如硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯等)的物質(zhì)，例如帶有蛋白質(zhì)(例如核酸酶、核酸酶抑制劑、毒素、抗體、信號肽、聚-L-賴氨酸等)或糖(例如單糖等)側(cè)鏈基團的物質(zhì)、帶有嵌入劑(例如丫啶、補骨脂素等)的物質(zhì)、含有螯合化合物(例如金屬、具有放射活性的金屬、硼、氧化性金屬等)的物質(zhì)、含有烷化劑的物質(zhì)、帶有被修飾的鍵的物質(zhì)(例如α-端異構(gòu)核酸等、)。術(shù)語“核苷”、“核苷酸”和“核酸”不僅僅含有嘌呤和嘧啶堿基，也可以含有被修飾的其它雜環(huán)型堿基。這樣的修飾物包括甲基化嘌呤和嘧啶、?；堰屎袜奏せ蚱渌s環(huán)。被修飾了的核苷酸和被修飾了的核苷酸還可以在糖部分被修飾。例如1個或1個以上的羥基被鹵素或脂肪族基團等取代，或變成醚、胺等官能團。本發(fā)明的反義多核苷酸是RNA、DNA或被修飾的核酸(RNA、DNA)。被修飾的核酸的具體例子包括核酸的硫衍生物、硫代磷酸鹽衍生物、多核苷酰胺或寡核苷酰胺的分解抵抗性物質(zhì)等。本發(fā)明的反義多核苷酸可例如按照如下設(shè)計。即，提高細胞內(nèi)的反義多核苷酸的穩(wěn)定性，提高反義多核苷酸的細胞滲透性，增大對目標有義鏈的親和性，或當有毒性時減小反義多核苷酸的毒性。這樣的修飾大多報告在例如Pharm.Tech.Japan，Vol.8，pp.247，或pp.395，1992；AntisenseResearchandApplications，CRCPress，1993等中。本發(fā)明的反義多核苷酸可以包含變化或修飾了的糖、堿基、鍵，能以脂質(zhì)體、微球體等特殊形式而被提供，或用于基因治療，或連同添加的部分一起被提供。所述添加的部分，包括起中和磷酸基骨架(phosphatebackbone)電荷作用的聚賴氨酸等聚陽離子物，提高與細胞膜的相互作用或增加核酸攝取的脂質(zhì)(例如磷脂、膽固醇等)等的疏水性物質(zhì)。優(yōu)選被添加的脂質(zhì)包括膽固醇或其衍生物(例如膽甾醇氯甲酸酯、膽酸等)等。這些物質(zhì)可以添加到核酸的3′末端或5′末端，也可以通過堿基、糖或分子內(nèi)核苷鍵被添加。其它基團包括特異性放置在核酸3′末端或5′末端以阻止核酸外切酶、Rnase等核酸酶導(dǎo)致的分解的加帽基團(cappinggroup)等。這樣的帽用基團包括以聚乙二醇、四甘醇等二醇為代表的本領(lǐng)域已知的羥基保護基團等，但不限于這些。反義多核苷酸的抑制活性可以利用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體、本發(fā)明的體內(nèi)或體外基因表達系統(tǒng)、或本發(fā)明蛋白質(zhì)的體內(nèi)或體外翻譯系統(tǒng)進行檢測。以下說明以下物質(zhì)的用途本發(fā)明蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽(以下有時簡稱為“本發(fā)明的蛋白質(zhì)”)、編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)或其部分肽的多核苷酸(例如DNA)(以下有時簡稱為“本發(fā)明的DNA”)、本發(fā)明蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的抗體(以下有時簡稱為“本發(fā)明的抗體”)和本發(fā)明DNA的反義多核苷酸(以下有時簡稱為“本發(fā)明的反義多核苷酸”)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)在癌組織中表達增加，因此可以用作疾病標記物。即，可以用作癌組織的早期診斷、癥狀嚴重程度的判斷、疾病發(fā)展預(yù)測的標記物。因此，含有編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的多核苷酸的反義多核苷酸、抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的化合物或其鹽、抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)基因表達的化合物或其鹽、或含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體的藥物可以用作癌癥(例如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦瘤、動脈瘤等)的預(yù)防·治療劑、細胞凋亡促進劑。(1)疾病的藥物候補化合物篩選本發(fā)明的蛋白質(zhì)在癌組織中的表達亢進，并且當抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)的活性時，引起癌細胞的凋亡。因此，抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的化合物或其鹽可以用作癌癥(例如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦瘤、動脈瘤等)的預(yù)防·治療劑、細胞凋亡促進劑。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用作用于篩選抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的化合物或其鹽的試劑。即，本發(fā)明提供篩選抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的化合物或其鹽的方法，其特征在于使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)。具體地例如，采用篩選抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的化合物或其鹽的方法，該方法的特征在于，比較(i)能產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的細胞的活性與(ii)能產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的細胞與受試化合物的混合物的活性。作為能產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的細胞，可以使用例如用包含編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA的載體轉(zhuǎn)化了的上述宿主(轉(zhuǎn)化體)。宿主優(yōu)選使用例如COS7細胞、CHO細胞和HEK293細胞等動物細胞。篩選時優(yōu)選使用這樣的轉(zhuǎn)化體，其中例如通過按照上述方法進行培養(yǎng)而使本發(fā)明蛋白質(zhì)在細胞中表達。能表達本發(fā)明蛋白質(zhì)的細胞的培養(yǎng)方法與上述本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)方法相同。受試化合物的例子包括肽、蛋白質(zhì)、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細胞提取液、植物提取液和動物組織提取液等。例如，可以選擇與上述(i)相比，抑制上述(ii)中本發(fā)明蛋白質(zhì)的活性約20％或以上、優(yōu)選30％或以上、更優(yōu)選約50％或以上的受試化合物作為抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的化合物。具有抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的活性的化合物可以用作用于抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)生理活性的低毒性安全藥物。進一步地，本發(fā)明蛋白質(zhì)的基因也在癌組織中表達增加，因此，抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)基因表達的化合物或其鹽也可以用作癌癥(例如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦瘤、動脈瘤等)的預(yù)防·治療劑、細胞凋亡促進劑。因此，本發(fā)明的多核苷酸(例如DNA)可以用作用于篩選抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)基因表達的化合物或其鹽的試劑。作為篩選方法，可以列舉下述方法，該方法的特征在于，將(iii)培養(yǎng)能產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的細胞的情況與(iv)在受試化合物的存在下培養(yǎng)能產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的細胞的情況進行比較。在上述方法中，測定并比較(iii)和(iv)情況中上述基因的表達量(具體是本發(fā)明蛋白質(zhì)的量或編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的mRNA量)。作為受試化合物和能生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)的細胞，可以列舉與上述相同的物質(zhì)。蛋白質(zhì)的量可以根據(jù)公知的方法進行測定，例如，按照以下方法測定用識別本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體，通過蛋白印跡分析法和ELISA法等方法或其改進方法測定細胞提取液等中存在的上述蛋白質(zhì)。mRNA的量可以根據(jù)公知的方法進行測定，例如，用包含序列號2、序列號5、序列號8或序列號11所示的堿基序列或其一部分的核酸作為探針的Northern雜交法；或用包含序列號2、序列號5、序列號8或序列號11所示的堿基序列或其一部分的核酸作為探針的PCR法，或它們的改進方法。例如，可以選擇與上述(iii)相比，抑制上述(iv)中基因表達約20％或以上、優(yōu)選30％或以上、更優(yōu)選約50％或以上的受試化合物作為抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)基因表達的化合物。本發(fā)明的篩選用試劑盒含有本發(fā)明所用的蛋白質(zhì)或部分肽或其鹽，或能產(chǎn)生本發(fā)明所用蛋白質(zhì)或部分肽的細胞。利用本發(fā)明篩選方法或篩選試劑盒獲得的化合物或其鹽是上述受試化合物，例如選自肽、蛋白質(zhì)、非肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細胞提取液、植物提取液、動物組織提取液和血漿等中的化合物或其鹽，它們是抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的化合物或其鹽、抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)基因表達的化合物或其鹽。作為這些化合物的鹽，使用與上述本發(fā)明蛋白質(zhì)的鹽相同的鹽。抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的化合物或其鹽和抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)基因表達的化合物或其鹽分別可以用作例如癌癥(例如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦瘤、動脈瘤等)的預(yù)防·治療劑、細胞凋亡促進劑等低毒性的安全藥物。將利用本發(fā)明的篩選方法或篩選試劑盒得到的化合物或其鹽用作上述預(yù)防·治療劑時，可以根據(jù)常規(guī)方法制成制劑。例如，口服給藥的組合物包括固體或液體劑型，具體包括片劑(包括糖衣片、薄膜包衣片)、丸劑、顆粒劑、散劑、膠囊(包括軟膠囊)、糖漿劑、乳劑和混懸劑等。所述組合物可以通過公知的方法制備，包含制劑領(lǐng)域中通常使用的載體、稀釋劑或賦形劑。例如作為片劑用的載體、賦形劑，使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸鎂等。非口服給藥的組合物包括例如注射劑和栓劑等。注射劑包括靜脈注射劑、皮下注射劑、皮內(nèi)注射劑、肌肉注射劑、滴注注射劑、關(guān)節(jié)內(nèi)注射劑等劑型。所述注射劑可以根據(jù)公知的方法制備，例如通過將上述化合物或其鹽溶解、懸浮或乳化在通常用于注射劑的無菌水性或油性液體中來制備。注射用水性液體使用例如生理鹽水、包含葡萄糖或其它助劑的等滲液等，還可以與適當?shù)闹軇├绱?例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子表面活性劑(例如聚山梨酯80、HCO-50(氫化蓖麻油的聚氧化乙烯(50mol)加成物))等一起使用。油性液體使用例如芝麻油、大豆油等，也可以與作為助溶劑的苯甲酸芐酯、芐醇等并用。制備的注射液通常裝入適當?shù)陌碴持?。用于直腸給藥的栓劑通過將上述化合物或其鹽與常用的栓劑基質(zhì)混合而制備。將上述口服或非口服藥物組合物制成適合于活性成分給藥量的給藥單位劑型是有利的。所述給藥單位的劑型可以列舉片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑(安瓿)和栓劑等。每個給藥單位劑型通常包含5～500mg上述化合物，注射劑優(yōu)選包含5～100mg、其它劑型優(yōu)選包含10～250mg上述化合物。另外，上述各組合物還可以包含其它活性成分，只要該成分在與上述化合物混合時不會產(chǎn)生不良的相互作用。按照上述方法獲得的制劑安全，并且毒性低，可以對例如人或溫血動物(例如小鼠、大鼠、兔、羊、豬、牛、馬、鳥類、貓、狗、猴和黑猩猩等)進行口服或非口服給藥。上述化合物或其鹽的給藥量因其作用、對象疾病、給藥對象和給藥途徑等而異。例如，為了治療乳腺癌而口服給予抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)基因表達的化合物或其鹽時，一般對成人(以體重為60kg計)每天給予上述化合物或其鹽約0.1～100mg、優(yōu)選約1.0～50mg、更優(yōu)選約1.0～20mg。非口服給藥時，上述化合物或其鹽的一次給藥量也因給藥對象、對象疾病等而異。例如，普通成人(以體重為60kg計)為了治療乳腺癌而以注射劑的形式給藥抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)基因表達的化合物或其鹽時，每天通過注射在癌變部位給藥約0.01～30mg、優(yōu)選約0.1～20mg、更優(yōu)選約0.1～10mg上述化合物或其鹽是有利的。對于其它動物的情況，可以按照換算成體重60kg的量進行給藥。(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)的定量本發(fā)明的抗體可以特異性地識別本發(fā)明的蛋白質(zhì)，因此可以用于被測液中本發(fā)明蛋白質(zhì)的定量，特別是用于通過夾心(sandwich)免疫測定法的定量。即，本發(fā)明提供(i)被測液中本發(fā)明蛋白質(zhì)的定量方法，其特征在于，使本發(fā)明的抗體、被測液和被標記的本發(fā)明蛋白質(zhì)競爭性地反應(yīng)，然后測定與所述抗體結(jié)合的被標記的本發(fā)明蛋白質(zhì)的比例，和(ii)被測液中本發(fā)明蛋白質(zhì)的定量方法，其特征在于，使被測液與固定在載體上的本發(fā)明抗體以及被標記的本發(fā)明的其它抗體同時或連續(xù)地進行反應(yīng)后，然后測定固定的載體上的標記物的活性。在上述(ii)的定量方法中，優(yōu)選一種抗體為識別本發(fā)明蛋白質(zhì)N末端部的抗體，而另一種抗體是與本發(fā)明蛋白質(zhì)的C末端部反應(yīng)的抗體。另外，除了用本發(fā)明蛋白質(zhì)的單克隆抗體(以下有時稱為本發(fā)明的單克隆抗體)對本發(fā)明蛋白質(zhì)進行定量外，也可以通過組織染色等進行檢測。為了這些目的，可以使用抗體分子本身，也可以使用抗體分子的F(ab′)2、Fab′或Fab級分。對利用本發(fā)明抗體的本發(fā)明蛋白質(zhì)的定量方法沒有特別限定，只要是通過化學(xué)或物理方法測定出對應(yīng)于被測液中抗原量(例如蛋白質(zhì)量)的抗體、抗原或抗體-抗原復(fù)合物的量，然后通過使用包含已知量抗原的標準液制作的標準曲線算出抗原的量的方法即可，可以采用任何測定方法。合適使用例如濁度法、競爭法、免疫測定法和夾心法等。從靈敏度和特異性方面考慮，特別優(yōu)選使用后述的夾心法。在使用標記物質(zhì)的測定法中所用的標記試劑為例如放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)和發(fā)光物質(zhì)等。放射性同位素使用例如[125I]、[1311I]、[3H]和[14C]等。上述酶優(yōu)選穩(wěn)定并且比活性高的酶，包括例如β-半乳糖甙酶、β-葡萄糖甙酶、堿性磷酸酯酶、過氧化物酶和蘋果酸脫氫酶等。作為熒光物質(zhì)，使用例如花青熒光染料(cyaninefluorescentdyes)(例如Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7(AmershamBiosciences公司生產(chǎn))等)、熒光胺、熒光素異硫氰酸鹽等。作為發(fā)光物質(zhì)，使用例如魯米諾(luminol)、魯米諾衍生物、螢光素(luciferin)和光澤精(lucigenin)等。另外，還可以在抗體或抗原與標記試劑結(jié)合時使用生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)。在使抗原或抗體不溶化(insolubilization)時，可以采用物理吸附，也可以使用通常在蛋白質(zhì)或酶不溶化、固定時所用的化學(xué)結(jié)合的方法。作為載體，可以列舉瓊脂糖、葡聚糖和纖維素等不溶性多糖類，聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和硅酮等合成樹脂，或玻璃等。在夾心法中，使固定的本發(fā)明單克隆抗體與被測液反應(yīng)(一次反應(yīng))，然后與標記了的其它本發(fā)明單克隆抗體反應(yīng)(二次反應(yīng))，接著測定固定抗體上的標記物活性，由此可以對被測液中的本發(fā)明蛋白質(zhì)進行定量。一次反應(yīng)和二次反應(yīng)也可按照相反的順序進行，還可以同時進行或錯開時間進行。標記試劑和固定的方法可以如上所述地進行。另外，在采用夾心法的免疫測定方法中，用于固定的抗體或用于標記的抗體不必須是一種抗體，為了提高測定靈敏度等目的，可以使用兩種或兩種以上的抗體的混合物。在采用本發(fā)明夾心法的本發(fā)明蛋白質(zhì)測定方法中，一次反應(yīng)和二次反應(yīng)所用的本發(fā)明單克隆抗體，優(yōu)選使用與本發(fā)明蛋白質(zhì)的結(jié)合部位不同的抗體。例如，二次反應(yīng)所用的抗體識別本發(fā)明蛋白質(zhì)的C末端部時，一次反應(yīng)所用的抗體優(yōu)選為識別C末端部以外的抗體，例如識別N末端部?？梢詫⒈景l(fā)明的單克隆抗體用于夾心法以外的測定系統(tǒng)，例如競爭法、免疫測量法或濁度法等。在競爭法中，使被測液中的抗原和標記抗原與抗體競爭性地反應(yīng)后，將未反應(yīng)的標記抗原(F)和與抗體結(jié)合的標記抗原(B)分離(B/F分離)，測定B或F中任意一個的標記量，由此對被測液中的抗原量進行定量。本反應(yīng)方法中，可以使用液相法和固定化法，所述液相法為使用可溶性抗體作為抗體，并使用用于B/F分離的聚乙二醇、上述抗體的第2抗體等的液相法，所述固定化法是用固相化抗體作為第1抗體，或用可溶性抗體作為第1抗體、用固相化抗體作為第2抗體的固定化方法。在免疫測量法中，使被測液中的抗原和固定化抗原與一定量的標記抗體競爭性地反應(yīng)后，分離固相和液相，或者使被測液中的抗原與過量的標記抗體反應(yīng)，然后加入固定化抗原，使未反應(yīng)的標記抗體被結(jié)合到固相中后，分離固相與液相。然后測定任意一個相中的標記量，從而對被測液中的抗原量進行定量。在濁度法中，測定凝膠內(nèi)或溶液中抗原抗體反應(yīng)所生成的不溶性沉淀的量。當被測液中的抗原量很少、僅得到少量沉淀時，也適合采用利用激光散射的激光濁度法。將上述各個免疫學(xué)測定方法用于本發(fā)明的定量方法時，不需要設(shè)定特別的條件、操作等。在各方法常規(guī)的條件、操作方法的基礎(chǔ)上，加上本領(lǐng)域技術(shù)人員在技術(shù)上的常規(guī)考慮來構(gòu)建本發(fā)明蛋白質(zhì)的測定體系即可。有關(guān)這些普通技術(shù)方法，可以參照總論或者出版物等?？梢詤⒄绽?，HiroshiIrie編，″Radioimmunoassay″(Kodansha，1974出版)；HiroshiIrie編，″SequeltotheRadioimmunoassay″(Kodansha，1979出版)；EijiIshikawa等編，″Enzymeimmunoassay″(Igakushoin，1978出版)；EijiIshikawa等編，″Immunoenzymeassay″(第二版)(Igakushoin，1982出版)；EijiIshikawa等編，″Immunoenzymeassay″(第三版)(Igakushoin，1987出版)；MethodsinENZYMOLOGY，Vol.70(ImmunochemicalTechniques(PartA))；MethodsinENZYMOLOGY，Vol.73(ImmunochemicalTechniques(PartB))；MethodsinENZYMOLOGY，Vol.74(ImmunochemicalTechniques(PartC))；MethodsinENZYMOLOGY，Vol.84(ImmunochemicalTechniques(PartDSelectedImmunoassays))；MethodsinENZYMOLOGY，Vol.92(ImmunochemicalTechniques(PartEMonoclonalAntibodiesandGeneralImmunoassayMethods))；MethodsinENZYMOLOGY，Vol.121(ImmunochemicalTechniques(PartIHybridomaTechnologyandMonoclonalAntibodies))(以上均由AcademicPressPublishing出版)等。如上所述，通過使用本發(fā)明的抗體，可以以高靈敏度測定本發(fā)明蛋白質(zhì)的含量。并且，通過使用本發(fā)明的抗體對本發(fā)明蛋白質(zhì)的濃度進行定量，檢測出本發(fā)明蛋白質(zhì)濃度的增加時，可以例如診斷癌癥(例如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦瘤、動脈瘤等)或?qū)眍净及┌Y的可能性高。另外，本發(fā)明的抗體可以用于檢測體液或組織等被測物中存在的本發(fā)明的蛋白質(zhì)，還可以用于制備用于純化本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體柱、檢測純化時各級分中本發(fā)明的蛋白質(zhì)、分析被測細胞中本發(fā)明蛋白質(zhì)的行為等。(3)基因診斷藥物本發(fā)明的DNA通過作為例如探針使用，可以檢測出人或溫血動物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、鳥類、羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴和黑猩猩等)中編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)或其部分肽的DNA或mRNA異常(基因異常)，因此可以用作例如該DNA或mRNA損傷、突變或表達降低、或者該DNA或mRNA增加或過度表達等的基因診斷藥物。采用本發(fā)明DNA的上述基因診斷，可以根據(jù)例如公知的Northern雜交或PCR-SSCP法(Genomics，5，874-879(1989)；ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，86，2766-2770(1989))等進行。例如，通過Northern雜交檢測出表達過度或通過PCR-SSCP檢測出DNA突變時，可以診斷為例如癌癥(例如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦瘤、動脈瘤等)的可能性高。(4)含有反義多核苷酸的藥物與本發(fā)明的DNA互補結(jié)合并抑制該DNA表達的本發(fā)明反義多核苷酸是低毒性的，可以抑制機體中本發(fā)明蛋白質(zhì)或本發(fā)明DNA的功能或作用，誘導(dǎo)癌細胞的細胞凋亡，因此可以用作例如癌癥(例如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦瘤、動脈瘤等)的預(yù)防·治療劑、細胞凋亡促進劑等。當將上述反義多核苷酸作為上述預(yù)防·治療劑、促進劑使用時，可以根據(jù)本發(fā)明公知的方法制成制劑、給藥。例如，可以將上述反義多核苷酸單獨或?qū)⑵洳迦肽孓D(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒載體等適當載體后，按照常規(guī)方法向人或哺乳動物(例如大鼠、兔、羊、豬、牛、貓、狗和猴等)進行口服或非口服給藥。該反義多核苷酸可以直接或為了促進吸收而與助劑等生理學(xué)上允許的載體一起制成制劑后，通過基因槍或水凝膠導(dǎo)管等導(dǎo)管給藥，或者，也可以氣霧化制成吸入劑局部給藥到氣管中。并且，為了改善體內(nèi)藥動學(xué)、延長半衰期、改善細胞內(nèi)吸收效率，上述反義多核苷酸也可以單獨或與脂質(zhì)體等載體一起制成制劑(注射劑)后通過靜脈或皮下等途徑給藥。該反義多核苷酸的給藥量因?qū)ο蠹膊?、給藥對象和給藥途徑等而異。例如，為了治療乳腺癌而給予本發(fā)明的反義多核苷酸時，一般成人(以體重60kg計)每天給予該反義多核苷酸約0.1～100mg。另外，上述反義多核苷酸還可以作為用于檢查組織或細胞中本發(fā)明DNA的存在或表達狀況的診斷用寡核苷酸探針使用。與上述反義多核苷酸一樣，包含編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的RNA的一部分的雙鏈RNA、包含編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的RNA的一部分核酶等，也可以抑制本發(fā)明基因的表達，并可以抑制機體中本發(fā)明所用蛋白質(zhì)或本發(fā)明所用DNA的功能，因此可以用作例如癌癥(例如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦瘤、動脈瘤等)的預(yù)防·治療劑、細胞凋亡促進劑等。雙鏈RNA可以根據(jù)公知的方法(例如Nature，411，494，2001)以本發(fā)明多核苷酸的序列為基礎(chǔ)進行設(shè)計并制備。核酶可以根據(jù)公知的方法(例如TRENDSinMolecularMedicine，7，221，2001)以本發(fā)明多核苷酸的序列為基礎(chǔ)進行設(shè)計并制備。例如，可以通過將公知的核酶連接到編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的RNA的一部分來制備。作為編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的RNA的一部分，可以列舉與本發(fā)明RNA上的切斷部位接近的部分(RNA片段)，所述本發(fā)明RNA是由公知核酶切斷所得到的。將上述雙鏈RNA或核酶用作上述預(yù)防·治療劑時，可以與反義多核苷酸同樣制成制劑并給藥。(5)含本發(fā)明抗體的藥物本發(fā)明的抗體由于具有誘導(dǎo)癌細胞凋亡的活性，因此可以用作例如癌癥(例如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦瘤、動脈瘤等)的預(yù)防·治療劑(例如疫苗等)、細胞凋亡促進劑等。含有本發(fā)明抗體的上述疾病的預(yù)防·治療劑、促進劑是低毒性的，可以直接以液體制劑或適當劑型的藥物組合物形式對人或哺乳動物(例如大鼠、兔、羊、豬、牛、貓、狗和猴等)進行口服或非口服給藥(例如血管內(nèi)給藥和皮下給藥等)。優(yōu)選以疫苗的形式按照常規(guī)方法給藥。本發(fā)明的抗體可以單獨給藥，也可以以合適的藥物組合物形式給藥。用于給藥的藥物組合物也可以包含本發(fā)明的抗體和其鹽，以及可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。這樣的藥物組合物以適合口服或非口服的劑型提供。用于非口服給藥的組合物包括例如注射劑、栓劑、疫苗等，注射劑還可以包括靜脈注射劑、皮下注射劑、肌肉注射劑、滴注注射劑等劑型。這樣的注射劑可以通過公知的方法制備。作為注射劑的制備方法，例如，可以通過將上述本發(fā)明的抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化在注射劑常用的無菌水性介質(zhì)或油性介質(zhì)中而制備。注射用的水性介質(zhì)使用例如生理鹽水、含有葡萄糖或其它助劑的等滲液等，還可以與合適的助溶劑例如醇類(例如乙醇)、多元醇類(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子表面活性劑(例如聚山梨酯80、HCO-50(聚氧化乙烯(50摩爾)與氫化蓖麻油的加成物)等并用。油性介質(zhì)使用例如芝麻油、大豆油等，還可以與苯甲酸芐酯、芐醇等助溶劑并用。所制備的注射劑優(yōu)選裝入適當?shù)陌碴持?。用于直腸給藥的栓劑可以通過將上述抗體或其鹽與常用的栓劑基質(zhì)混合而制備。用于口服的組合物包括固體或液體劑型，具體可以列舉片劑(包括糖衣片、薄膜包衣片)、丸劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑(包括軟膠囊)、糖漿劑、乳劑和混懸劑等。這些組合物可以通過公知的方法制備，也可以含有制劑領(lǐng)域中通常使用的載體、稀釋劑或賦形劑。作為片劑的載體、賦形劑，使用例如乳糖、淀粉、蔗糖和硬脂酸鎂。將上述非口服或口服藥物組合物制成適合于活性成分給藥量的給藥單位劑型是有利的。這種給藥單位的劑型包括例如片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑(安瓿)和栓劑等。抗體的含量通常是5～500mg/每給藥單位劑型，特別是當為注射劑時，優(yōu)選包含5～100mg上述抗體；為其它劑型時，優(yōu)選包含10～250mg上述抗體。含有本發(fā)明抗體的上述預(yù)防·治療劑、調(diào)節(jié)劑的給藥量因給藥對象、對象疾病、癥狀和給藥途徑等而異，例如用于治療、預(yù)防成人乳腺癌時，本發(fā)明抗體的一次劑量通常為0.01～20mg/kg體重左右，優(yōu)選0.1～10mg/kg體重左右，更優(yōu)選0.1～5mg/kg體重左右，一天大約1～5次，優(yōu)選一天1～3次左右。通過靜脈注射給藥是有利的。其它非口服給藥和口服可藥時也可以按照對應(yīng)于上述量的量給藥。癥狀特別嚴重時，也可以根據(jù)該癥狀增加給藥量。本發(fā)明的抗體可以單獨給藥，也可以以合適的藥物組合物形式給藥。用于上述給藥的藥物組合物包含本發(fā)明的抗體或其鹽，以及可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。這樣的組合物以適合口服或非口服給藥(例如血管內(nèi)注射和皮下注射等)的劑型提供。另外，上述各組合物還可以含有其它活性成分，只要該活性成分不會因與上述抗體混合而產(chǎn)生不良相互作用。并且，本發(fā)明的抗體還可以與其它藥物并用，例如烷化劑(例如環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺等)、代謝拮抗劑(例如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶等)、抗癌性抗生素(例如絲裂霉素、阿霉素等)、來源于植物的抗癌劑(例如長春新堿、長春堿、長春地辛、紫杉醇等)、順鉑、卡鉑、etopoxide等。本發(fā)明抗體可以與上述藥物同時或不同時給藥至患者。(6)含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的藥物由于本發(fā)明的蛋白質(zhì)在癌癥中過度表達，因此可以用本發(fā)明的蛋白質(zhì)作為癌癥疫苗以激活癌癥患者的免疫系統(tǒng)。例如，可以優(yōu)選適用于下述的所謂過繼免疫療法等。即，在本發(fā)明蛋白質(zhì)的存在下，培養(yǎng)強的抗原呈遞細胞(例如樹突細胞)，使其吞噬該蛋白質(zhì)后，再次回到患者體內(nèi)?；氐襟w內(nèi)的樹突細胞可以誘導(dǎo)、活化癌抗原特異性的細胞毒性T細胞，由此殺死癌細胞。另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)也作為預(yù)防或治療例如癌癥(例如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦瘤、動脈瘤等)的疫苗制劑安全地對哺乳動物(例如人、猴、小鼠、大鼠、兔和猴)進行給藥。該疫苗制劑通常含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)和生理學(xué)上允許的載體。載體包括例如水、鹽水(包括生理鹽水)、緩沖液(例如磷酸緩沖液)、醇(例如乙醇)等液體載體。疫苗制劑可以按照常規(guī)疫苗制劑的制備方法制備。通常將本發(fā)明的蛋白質(zhì)溶解或懸浮在生理學(xué)上允許的載體中。另外，也可以分別制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)和生理學(xué)上允許的載體，在使用時將它們混合。疫苗制劑中，除了本發(fā)明的蛋白質(zhì)和生理學(xué)上允許的載體之外，還可以加入佐劑(例如氫氧化鋁凝膠、血清白蛋白等)、防腐劑(例如硫柳汞(thimerosal)等)、無痛化劑(例如葡萄糖、芐醇等)等。另外，為了促進本發(fā)明蛋白質(zhì)抗體的產(chǎn)生，還可以加入例如細胞因子(例如白細胞介素-2等白細胞介素類、干擾素-γ等干擾素類等)。當用作疫苗制劑時，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以以活性形式使用。為了提高抗原性，也可以使本發(fā)明的蛋白質(zhì)變性。本發(fā)明蛋白質(zhì)的變性可以通過采用常規(guī)的加熱處理、蛋白質(zhì)變性劑(例如福爾馬林、鹽酸胍、尿素)的處理進行。所得的疫苗制劑是低毒性的，通?？梢宰鳛樽⑸鋭┩ㄟ^例如皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)注射途徑給藥，也可以局部給藥至癌細胞塊或其附近。本發(fā)明蛋白質(zhì)的給藥量因例如對象疾病、給藥對象和給藥途徑等而異。例如，當本發(fā)明的蛋白質(zhì)以注射劑的形式給癌癥成人患者(以體重60kg計)皮下注射時，一次通常為0.1～300mg左右，優(yōu)選100～300mg左右。疫苗制劑的給藥次數(shù)可以是一次，但為了提高抗體產(chǎn)生量，也可以以約2周～約6個月的間隔給予該疫苗制劑2～4次。(7)DNA轉(zhuǎn)基因動物本發(fā)明提供攜帶有編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的外源性DNA(以下簡稱為“本發(fā)明的外源性DNA”)或其變異DNA(有時簡稱為“本發(fā)明的外源性變異DNA”)的非人哺乳動物。即，本發(fā)明提供(1)攜帶本發(fā)明外源性DNA或其變異DNA的非人哺乳動物；(2)上述(1)所述的動物，其為嚙齒動物；(3)上述(2)所述的動物，該嚙齒動物為小鼠或大鼠；以及(4)一種重組載體，其含有本發(fā)明的外源性DNA或其變異DNA，并且可以在哺乳動物中表達。攜帶有本發(fā)明外源性DNA或其變異DNA的非人哺乳動物(以下簡稱為本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)基因動物)可以通過下述方法制備對于未受精卵、受精卵、精子和包含其原生殖細胞的生發(fā)細胞(germinalcells)，優(yōu)選在非人哺乳動物發(fā)育過程中的胚胎發(fā)生階段(更優(yōu)選在單細胞或受精卵細胞階段，并且一般在8細胞期之前)，通過磷酸鈣法、電脈沖法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、凝集法、微量注射法、粒子槍法、DEAE-葡聚糖法等轉(zhuǎn)染目的DNA。通過該DNA轉(zhuǎn)染方法，也可以向體細胞、機體器官和組織細胞等中轉(zhuǎn)染本發(fā)明的目的外源性DNA，并用于細胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)等。并且，通過使上述細胞與上述生發(fā)細胞通過公知的細胞融合法融合，也可以制備本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)基因動物。非人哺乳動物使用例如牛、豬、綿羊、山羊、兔、狗、貓、豚鼠、倉鼠、小鼠和大鼠等。其中，從制作病體動物模型體系方面考慮，優(yōu)選個體發(fā)育和生物周期比較短、并且繁殖容易的嚙齒動物，特別是小鼠(例如C57BL/6系統(tǒng)、DBA2系統(tǒng)等純種類，B6C3F1系統(tǒng)、BDF1系統(tǒng)、B6D2F1系統(tǒng)、BALB/c系統(tǒng)、ICR系統(tǒng)等雜種類)、或大鼠(例如Wistar、SD等)等?？梢栽诓溉閯游镏斜磉_的重組載體中的“哺乳動物”，除了上述非人哺乳動物之外，還包括人等。本發(fā)明的外源性DNA不是指非人哺乳動物本身固有的本發(fā)明的DNA，而是指從哺乳動物分離、提取出了的本發(fā)明的DNA。作為本發(fā)明的變異DNA，使用本發(fā)明原始DNA的堿基序列發(fā)生變異(例如突變等)生成的變異體，具體地，使用通過堿基的添加、缺失、用其它堿基取得等生成的DNA等。另外，也包括異常DNA。所述異常DNA是指使異常表達本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA，例如，使用使抑制本發(fā)明正常蛋白質(zhì)功能的蛋白質(zhì)表達的DNA等。本發(fā)明的外源性DNA可以是來源于與對象動物同種或異種的哺乳動物的DNA。將本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)染到對象動物時，一般將該DNA作為連接到可以在動物細胞中表達的啟動子下游的DNA構(gòu)建體(DNAconstruct)進行使用是有利的。例如，轉(zhuǎn)染本發(fā)明的人DNA時，將本發(fā)明的人DNA連接到可以使來源于下述動物的DNA表達的各種啟動子下游，其中該動物攜帶有與上述DNA同源性高的本發(fā)明DNA(例如兔、狗、貓、豚鼠、倉鼠、大鼠和小鼠等)，然后將所得的DNA構(gòu)建體(例如載體等)微量注射到對象哺乳動物的受精卵，例如小鼠的受精卵，由此可以制備高水平地表達本發(fā)明DNA的DNA轉(zhuǎn)基因哺乳動物。作為本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達載體，使用來源于大腸桿菌的質(zhì)粒、來源于枯草芽孢桿菌的質(zhì)粒、來源于酵母的質(zhì)粒、λ噬菌體等噬菌體、莫洛尼(Moloney)白血病病毒等逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒和桿狀病毒等動物病毒。其中，優(yōu)選使用來源于大腸桿菌的質(zhì)粒、來源于枯草芽孢桿菌的質(zhì)?；騺碓从诮湍傅馁|(zhì)粒等。作為調(diào)節(jié)上述DNA表達的啟動子，使用例如(i)來源于病毒(例如猴病毒、巨細胞病毒、莫洛尼白血病病毒、JC病毒、乳腺癌病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒等)的DNA的啟動子；(ii)來源于各種哺乳動物的啟動子(人、兔、狗、貓、豚鼠、倉鼠、大鼠、小鼠等)的啟動子，例如，白蛋白、胰島素II、uroplakinII、彈性蛋白酶、紅細胞生成素、內(nèi)皮肽、肌肉肌酸激酶、膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、來源于血小板的生長因子β、角蛋白K1、K10和K14、I型膠原和II型膠原、環(huán)AMP-依賴性蛋白激酶βI亞單位、肌營養(yǎng)不良蛋白、耐酒石酸堿性磷酸酯酶、心鈉素、內(nèi)皮受體酪氨酸激酶(一般簡稱為“Tie2”)、鈉-鉀腺苷三磷酸酶(adenosinetriphosphorylase)(Na，K-ATPase)、神經(jīng)絲輕鏈、金屬硫蛋白I和IIA、金屬蛋白酶(Metalloproteinase)I組織抑制劑、MHC類I抗原(H-2L)、H-ras、腎素、多巴胺β-羥化酶、甲狀腺過氧化物酶(TPO)、肽鏈延長因子1α(EF-1α)、β-肌動蛋白、α和β-肌球蛋白重鏈、肌球蛋白輕鏈1和2、髓鞘基礎(chǔ)蛋白(myelinbaseprotein)、甲狀腺球蛋白、Thy-1、免疫球蛋白、H-鏈可變區(qū)(VNP)、血清淀粉組分P、肌紅蛋白、肌鈣蛋白C、平滑肌α-肌動蛋白、前腦啡肽原A、加壓素等。其中優(yōu)選可以在全身高水平表達的巨細胞病毒啟動子、人肽鏈延長因子1α(EF-1α)啟動子、人和雞β-肌動蛋白啟動子等。優(yōu)選上述載體具有在DNA轉(zhuǎn)基因哺乳動物中終止目的信使RNA轉(zhuǎn)錄的序列(一般稱為終止子)，例如，可以使用來源于病毒和來源于各種哺乳動物的各DNA的序列，優(yōu)選使用猴病毒的SV40終止子。另外，為了進一步提高目的外源性DNA的表達，還可以根據(jù)目的將各DNA的剪接信號、增強子區(qū)域、真核DNA內(nèi)含子的一部分等連接到啟動子區(qū)域的5′上游、啟動子區(qū)域和翻譯區(qū)域之間或翻譯區(qū)域的3′下游。正常的本發(fā)明蛋白質(zhì)的翻譯區(qū)域可以用下述物質(zhì)作為原料獲得，即，來源于人或各種哺乳動物(例如兔、狗、貓、豚鼠、倉鼠、大鼠和小鼠等)肝臟、腎臟、甲狀腺細胞、成纖維細胞的DNA和市售的各種基因組DNA文庫的基因組DNA的全部或一部分，或用來源于肝臟、腎臟、甲狀腺細胞、成纖維細胞的RNA通過公知方法制備的互補DNA。另外外源性的異常DNA可以通過使正常蛋白質(zhì)的翻譯區(qū)域進行點突變制備變異了的翻譯區(qū)域，所述正常蛋白質(zhì)是由上述細胞或組織獲得的。該翻譯區(qū)域可以通過常規(guī)的DNA工程方法制備，在所述的DNA工程方法中，DNA以能在轉(zhuǎn)基因動物中表達的DNA構(gòu)建體的形式連接到上述啟動子的下游，并且如果需要，連接到轉(zhuǎn)錄終止部位的上游。在受精卵細胞階段中轉(zhuǎn)染本發(fā)明的外源性DNA，可以確保對象哺乳動物生發(fā)細胞和體細胞全部存在。在通過DNA轉(zhuǎn)染制備的動物的生發(fā)細胞中，存在本發(fā)明的外源性DNA是指制備動物的后代全都在其生發(fā)細胞和體細胞中保持有本發(fā)明的外源性DNA。繼承了本發(fā)明外源性DNA的此種動物的子代在其生發(fā)細胞和體細胞中全都攜帶有本發(fā)明的外源性DNA。轉(zhuǎn)染了本發(fā)明外源性正常DNA的非人哺乳動物，在確認通過交配而穩(wěn)定保持外源性DNA后，可以作為該DNA攜帶動物在常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境中傳代飼養(yǎng)。在受精卵細胞階段中轉(zhuǎn)染本發(fā)明的外源性DNA，可以確保該DNA在對象哺乳動物的全部生發(fā)細胞和體細胞中過量存在。在通過DNA轉(zhuǎn)染制備的動物的生發(fā)細胞中過量存在本發(fā)明的外源性DNA是指，所制備動物的子代都在其全部生發(fā)細胞和體細胞中過量帶有本發(fā)明的外源性DNA。繼承了本發(fā)明外源性DNA的此種動物的子代在其全部生發(fā)細胞和體細胞中過量帶有本發(fā)明的外源性DNA。獲得了同源染色體雙方都攜帶轉(zhuǎn)染DNA的純合動物，通過該雌雄動物的交配可以使所有的子代都過量攜帶該DNA而繁殖傳代。在攜帶有本發(fā)明正常DNA的非人哺乳動物中，本發(fā)明的正常DNA高水平地表達，通過促進內(nèi)源性正常DNA的功能而最終導(dǎo)致本發(fā)明的蛋白質(zhì)功能亢進，從而可以用作該疾病的模型動物。例如，可以使用本發(fā)明正常DNA轉(zhuǎn)染的動物，進行本發(fā)明蛋白質(zhì)的功能亢進病癥或與本發(fā)明蛋白質(zhì)相關(guān)的疾病的病理機制的分析和這些疾病的治療方法方面的研究。另外，用本發(fā)明外源性正常DNA轉(zhuǎn)染了的哺乳動物，由于有游離的本發(fā)明蛋白質(zhì)增加的癥狀，因此也可以用于與本發(fā)明蛋白質(zhì)相關(guān)的疾病的預(yù)防·治療劑，例如癌癥(例如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦瘤、動脈瘤等)預(yù)防·治療劑的篩選試驗。另一方面，攜帶有本發(fā)明外源性異常DNA的非人哺乳動物在通過交配確認穩(wěn)定地保持了外源性DNA后，可以作為該DNA攜帶動物在常規(guī)的飼養(yǎng)環(huán)境中傳代飼養(yǎng)。并且，可以將目的外源DNA重組到上述質(zhì)粒中作為原料使用。具有啟動子的DNA構(gòu)建體可以通過常規(guī)的DNA工程技術(shù)制備。在受精卵細胞階段轉(zhuǎn)染本發(fā)明的異常DNA，可以確保其存在于對象哺乳動物的全部生發(fā)細胞和體細胞中。在通過DNA轉(zhuǎn)染制備的動物的生發(fā)細胞中存在本發(fā)明的異常DNA是指，所制備動物的子代都在其全部生發(fā)細胞和體細胞中攜帶有本發(fā)明的異常DNA。繼承了本發(fā)明外源性DNA的此種動物的子代在其所有生發(fā)細胞和體細胞中攜帶有本發(fā)明的異常DNA。獲得了同源染色體雙方都攜帶轉(zhuǎn)染DNA的純合動物，通過該雌雄動物的交配可以使所有的子代都攜帶該DNA而繁殖傳代。在攜帶有本發(fā)明異常DNA的非人哺乳動物中，本發(fā)明的異常DNA高水平地表達，通過抑制內(nèi)源性正常DNA的功能而最終導(dǎo)致本發(fā)明蛋白質(zhì)的功能失活型不應(yīng)癥(functioninactivetypeinadaptability)，從而可以用作該疾病的模型動物。例如，可以使用本發(fā)明異常DNA轉(zhuǎn)染的動物，進行本發(fā)明蛋白質(zhì)功能失活型不應(yīng)癥的病理機制分析和該疾病的治療方法方面的研究。作為具體的利用可能性，本發(fā)明表達異常DNA高水平的動物，有望作為分析在本發(fā)明蛋白質(zhì)功能失活型不應(yīng)癥中，本發(fā)明異常蛋白質(zhì)導(dǎo)致的正常蛋白質(zhì)功能抑制(顯性陰性作用)的模型。用本發(fā)明外源性正常DNA轉(zhuǎn)染了的哺乳動物由于有游離的本發(fā)明蛋白質(zhì)增加的癥狀，因此也可以用于本發(fā)明蛋白質(zhì)或功能失活型不應(yīng)癥的預(yù)防臺療劑，例如癌癥(例如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦瘤、動脈瘤等)預(yù)防·治療劑的篩選試驗。另外，作為上述兩種本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)基因動物的其它利用可能性，考慮了例如(i)用作組織培養(yǎng)的細胞源；(ii)通過直接分析本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)基因動物組織中的DNA或RNA，或分析DNA表達的肽組織，對與通過本發(fā)明蛋白質(zhì)特異性表達或活化的肽之間的關(guān)聯(lián)性進行闡明；(iii)通過標準組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)攜帶有DNA的組織細胞，應(yīng)用這些，研究來源于通常難于培養(yǎng)的組織的細胞的功能；(iv)使用上述(iii)所述的細胞，篩選提高細胞功能的藥物；(v)分離純化本發(fā)明的變異蛋白質(zhì)和制備其抗體。并且，可以使用本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)基因動物，研究包括本發(fā)明蛋白質(zhì)功能失活型不應(yīng)癥在內(nèi)的與本發(fā)明蛋白質(zhì)相關(guān)的疾病的臨床癥狀。還可以獲得與本發(fā)明蛋白質(zhì)相關(guān)的疾病模型的各器官中更加詳細的病理學(xué)結(jié)果，從而開發(fā)新的治療方法。另外，還可以對該疾病導(dǎo)致的繼發(fā)疾病的研究和治療作出貢獻。另外，從本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)基因動物切取各器官并切碎后，通過胰蛋白酶等蛋白質(zhì)分解酶獲得游離的DNA轉(zhuǎn)染細胞，從而可以進行該細胞的培養(yǎng)或該培養(yǎng)細胞的系統(tǒng)化。并且，可以用于確定產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的細胞，研究與細胞凋亡、分化或增殖的關(guān)系或其中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，以研究它們的異常等，從而可以作為用于研究本發(fā)明蛋白質(zhì)及其作用機制的有效研究材料。進一步地，為了利用本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)基因動物開發(fā)包括本發(fā)明蛋白質(zhì)功能失活型不應(yīng)癥在內(nèi)的與本發(fā)明蛋白質(zhì)相關(guān)的治療藥物，用上述檢測法和定量法可以有效并快速篩選該疾病治療藥物的方法。另外，還可以利用本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)基因動物或本發(fā)明的外源性DNA表達載體研究、開發(fā)與本發(fā)明蛋白質(zhì)相關(guān)的疾病的DNA療法。(8)敲除動物本發(fā)明提供，攜帶失活了的本發(fā)明DNA非人哺乳動物胚胎干細胞和本發(fā)明DNA表達有缺陷的非人哺乳動物。即，本發(fā)明提供(1)攜帶失活了的本發(fā)明DNA非人哺乳動物胚胎干細胞；(2)上述(1)所述的胚胎干細胞，其中所述DNA通過轉(zhuǎn)染報道基因(例如來源于大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因)而失活；(3)上述(1)所述的胚胎干細胞，其具有新霉素耐藥性；(4)上述(1)所述的胚胎干細胞，其中非人哺乳動物為嚙齒動物；(5)上述(4)所述的胚胎干細胞，其中嚙齒動物是小鼠；(6)本發(fā)明DNA表達缺陷的非人哺乳動物，其中該DNA已經(jīng)失活；(7)上述(6)所述的非人哺乳動物，其中所述DNA通過轉(zhuǎn)染報道基因(例如來源于大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因)而失活，該報道基因可以在本發(fā)明DNA的啟動子的控制下表達；(8)上述(6)所述的非人哺乳動物，其中非人哺乳動物為嚙齒動物；(9)上述(8)所述的非人哺乳動物，其中嚙齒動物是小鼠；和(10)一種篩選促進或抑制本發(fā)明DNA的啟動子活性的化合物或其鹽的方法，其特征在于，向述(7)所述的動物給予受試化合物，然后檢測報道基因的表達。本發(fā)明DNA失活了的非人哺乳動物胚胎干細胞是指下述非人哺乳動物的胚胎干細胞(以下簡稱為“ES”細胞)，即，向該哺乳動物攜帶的本發(fā)明DNA人為地施加變異，由此抑制DNA的表達能力；或通過實質(zhì)性地使該DNA編碼的本發(fā)明蛋白質(zhì)喪失活性，使DNA基本上不具有表達本發(fā)明蛋白質(zhì)的能力(以下有時稱為“本發(fā)明的敲除DNA”)。作為非人哺乳動物，使用與上述相同的動物。向本發(fā)明DNA人為地施加變異的方法，包括例如通過基因工程方法刪除該DNA序列中的一部分或全部，然后插入其它DNA或用其它DNA取代。通過這些變異，可以通過例如使密碼子的讀碼框移位或破壞啟動子或外顯子的功能來制備本發(fā)明的敲除DNA。攜帶失活的本發(fā)明DNA的非人哺乳動物胚胎干細胞(以下簡稱為“本發(fā)明DNA失活的ES細胞”或“本發(fā)明的敲除ES細胞”)可以通過例如下述方法獲得分離目的非人哺乳動物攜帶的本發(fā)明的DNA，向該動物的染色體中通過例如同源重組法轉(zhuǎn)染具有如下所述構(gòu)建的DNA序列的DNA鏈(以下簡稱為“目標載體”)，其中所述的構(gòu)建的DNA序列是，通過向其外顯子部分插入以新霉素耐藥性基因、潮霉素(hygromycin)耐藥性基因為代表的耐藥性基因，或以lacZ(β-半乳糖苷酶基因)、cat(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)為代表的報道基因等，破壞外顯子的功能，或在外顯子之間的內(nèi)含子部分插入終止基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列(例如多聚腺苷酸添加信號(polyAadditionalsignal)等)，從而不能合成完全信使RNA，結(jié)果導(dǎo)致基因破壞，而構(gòu)建的DNA序列。所得的ES細胞用本發(fā)明DNA上或其附近的DNA序列作為探針通過Southern雜交進行分析，或用目標載體上的DNA序列與用于制備目標載體的本發(fā)明DNA以外的附近區(qū)域的DNA序列作為引物通過PCR法進行分析，以篩選本發(fā)明的敲除ES細胞。通過同源重組法等使本發(fā)明DNA失活的親代ES細胞，可以使用例如如上所述已經(jīng)建立的細胞，也可以使用按照公知的Evans和Kaufman的方法新建立的細胞。例如，當為小鼠的ES細胞時，目前一般使用129系的ES細胞，但由于它們免疫學(xué)背景不明確，可以優(yōu)選使用利用C57BL/6小鼠或BDFl小鼠(C57BL/6和DBA/2的F1)，其中后者通過與DBA/2雜交改善了C57BL/6小鼠采卵數(shù)較少，而不是獲得具有清楚的免疫學(xué)基因背景等的純系ES細胞。BDF1小鼠除了采卵數(shù)多并且卵健康的優(yōu)點外，還具有下述優(yōu)點，因此可以有利地利用，所述優(yōu)點為由于BDFl小鼠具有C57BL/6小鼠的背景，利用由其獲得的ES細胞制作病理模型小鼠時，通過與C57BL/6小鼠回交可以將其遺傳背景變成C57BL/6的遺傳背景。建立ES細胞時，一般使用受精后第3.5天的胚泡(胚盤胞)，但除此之外，可以在8細胞期采集胚，并培養(yǎng)到胚泡后再使用，由此可以高效地獲得大量早期胚?？梢允褂么菩壑腥我庖环N的ES細胞，但通常雄性ES細胞在制備生殖細胞系嵌合體(germcelllinechimera)時是方便的。另外，為了減少煩雜的培養(yǎng)工序，優(yōu)選盡早進行雌雄判別。ES細胞雌雄的判定方法，作為其中的一例可以列舉例出，通過PCR法擴增Y染色體上性別決定區(qū)域的基因并檢測的方法。以往進行核型分析需要約106個細胞，但如果采用上述方法，則1個集落左右的ES細胞數(shù)(約50個)就足夠了。因此可以通過雌雄判別在培養(yǎng)初期進行ES細胞的第一次篩選，從而可以通過在早期選定雄性細胞，由此能夠大幅削減培養(yǎng)初期的工作。另外，第二次篩選可以通過例如采用G-顯帶法確認染色體數(shù)量而進行。所得的ES細胞的染色體數(shù)優(yōu)選為正常數(shù)量的100％，但由于建立時物理操作等方面的關(guān)系而難于得到染色體數(shù)正常的ES細胞時，優(yōu)選在敲除ES細胞的基因后再次克隆到正常細胞(例如小鼠中染色體數(shù)為2n＝40的細胞)中。如上獲得的胚胎干細胞雖然通常增殖性很好，但由于容易喪失個體發(fā)育能力，因此必須嚴加注意地進行傳代培養(yǎng)。例如，在STO成纖維細胞等適當?shù)娘曫B(yǎng)細胞上，在LIF(1～10000U/ml)的存在下，在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(優(yōu)選5％二氧化碳、95％空氣；或5％氧氣、5％二氧化碳和90％空氣)在大約37℃進行培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)時，用胰蛋白酶/EDTA溶液(通常為0.001～0.5％胰蛋白酶/0.1～5mMEDTA，優(yōu)選約0.1％胰蛋白酶/1mMEDTA)處理以獲得單細胞，然后接種到新準備的飼養(yǎng)細胞上的方法。這樣的傳代通常每隔1～3天進行，此時觀察細胞，發(fā)現(xiàn)形態(tài)異常的細胞時優(yōu)選放棄該培養(yǎng)細胞。通過ES細胞在適當條件下單層培養(yǎng)到達到高密度，或懸浮培養(yǎng)到形成細胞聚集塊，其可以分化成體壁(pariental)肌、內(nèi)臟肌和心肌等各種類型的細胞[M.J.EvansandM.H.Kaufman，Nature，292，154，1981；GR.Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，78，7634，1981；T.C.Doetschman等JournalofEmbryologyExperimentalMorphology，87，27，1985]。使本發(fā)明ES細胞分化獲得的本發(fā)明DNA表達缺陷細胞，在本發(fā)明蛋白質(zhì)的體外細胞生物學(xué)研究中是有用的。本發(fā)明的DNA表達缺陷非人哺乳動物可以通過采用公知方法測定該動物的mRNA水平，并間接地比較其表達量，由此與正常動物區(qū)別開來。該非人哺乳動物使用與上述相同的動物。本發(fā)明DNA表達缺陷非人哺乳動物可以通過例如下述方法敲除本發(fā)明的DNA，即，將上述制備的目標載體轉(zhuǎn)染到小鼠胚胎干細胞或小鼠卵細胞中，并進行同源重組，其中攜帶失活的本發(fā)明DNA的目標載體的DNA序列，通過基因同源重組與小鼠胚胎干細胞或小鼠卵細胞染色體上的本發(fā)明DNA交換，通過該同源基因重組可以敲除本發(fā)明的DNA。敲除了本發(fā)明DNA的細胞可以通過以本發(fā)明DNA上或其附近的DNA序列為探針的Southern雜交分析進行確定，或可以通過PCR法分析進行確定，該PCR法中使用目標載體上的DNA序列和用于目標載體的小鼠來源的本發(fā)明DNA以外的附近區(qū)域的DNA序列作為引物。使用非人哺乳動物胚胎干細胞時，通過基因同源重組使攜帶失活的本發(fā)明DNA的細胞株被克隆，將所得克隆注入在適當?shù)臅r期，例如8細胞期的非人哺乳動物胚或胚泡中，將所制成的嵌合胚移植到假孕的該非人哺乳動物的子宮內(nèi)。所得的動物是由具有正常的本發(fā)明DNA基因座的細胞和具有人為變異了的本發(fā)明DNA基因座的細胞兩者所構(gòu)成的嵌合動物。當該嵌合動物的一部分生發(fā)細胞具有變異了的本發(fā)明DNA基因座時，從這種嵌合個體與正常個體交配得到的個體群中，通過例如判斷外被顏色(coatcolor)等選擇所有組織是由人為施加了變異的本發(fā)明DNA基因座的細胞構(gòu)成的個體。這樣獲得的個體通常是本發(fā)明蛋白質(zhì)雜合表達缺陷個體，本發(fā)明蛋白質(zhì)雜合表達缺陷個體之間進行交配，可以由它們的子代得到本發(fā)明蛋白質(zhì)的純合表達缺陷個體。使用卵細胞時，例如，通過微量注射法向卵細胞核內(nèi)注入DNA溶液，由此可以獲得染色體內(nèi)轉(zhuǎn)染了目標載體的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。從這些轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物中，通過基因同源重組可以選擇本發(fā)明DNA基因座中帶有變異的動物。如上所述敲除了本發(fā)明DNA的個體，確認了通過交配所得的動物個體也敲除了該DNA后，可以在常規(guī)的飼養(yǎng)環(huán)境中進行飼養(yǎng)傳代。并且，生殖系統(tǒng)也可以根據(jù)常規(guī)方法獲得并保持。即，通過帶有該失活DNA的雌雄動物的交配，可以獲得同源染色體雙方都攜帶該失活DNA的純合動物。所得的純合動物可以通過飼養(yǎng)由母體動物得到1個正常個體和多個純合子而高效地獲得。通過雌雄雜合動物之間的交配，使攜帶該失活DNA的純合和雜合動物繁殖傳代。攜帶失活的本發(fā)明DNA的非人哺乳動物胚胎干細胞在制作本發(fā)明DNA表達缺陷非人哺乳動物中是非常有用的。另外，本發(fā)明DNA表達缺陷非人哺乳動物由于缺失了由本發(fā)明蛋白質(zhì)衍生的多種生物活性，因此可以作為因本發(fā)明蛋白質(zhì)生物活性失活引起的疾病的動物模型，對研究這些疾病的原因和治療方法有用。(8a)對本發(fā)明DNA缺失或損傷等引起的疾病具有治療、預(yù)防效果的化合物的篩選方法本發(fā)明DNA表達缺陷非人哺乳動物可以用于篩選對本發(fā)明DNA缺失或損傷等引起的疾病具有治療、預(yù)防效果的化合物。即，本發(fā)明提供篩選對因本發(fā)明DNA缺失或損傷等引起的疾病，例如癌癥等，具有治療、預(yù)防效果的化合物或其鹽的方法，其特征在于，給本發(fā)明DNA表達缺陷非人哺乳動物施用受試化合物，并觀察、測定該動物的變化。在該篩選方法中使用的本發(fā)明DNA表達缺陷非人哺乳動物與上述相同。受試化合物可以列舉例如肽、蛋白質(zhì)、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細胞提取液、植物提取液、動物組織提取液和血漿等，這些化合物可以是新化合物，也可以是已知化合物。具體地，可以將本發(fā)明DNA表達缺陷非人哺乳動物用受試化合物處理，并與未處理的對照動物進行比較，以該動物的各器官、組織和疾病癥狀等的變化為指標，評價受試化合物的治療、預(yù)防效果。作為用受試化合物處理試驗動物的方法，例如，可以通過口服給藥、靜脈注射等，根據(jù)試驗動物的癥狀、受試化合物的性質(zhì)等進行適當選擇。另外，受試化合物的給藥量可以根據(jù)給藥方法、受試化合物的性質(zhì)等適當選擇。例如，篩選對癌癥(例如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦瘤、動脈瘤等)具有預(yù)防·治療效果的化合物時，向本發(fā)明DNA表達缺陷非人哺乳動物施用受試化合物，在上述組織中經(jīng)時觀察，與未施用受試化合物的動物組在癌癥發(fā)病程度或癌癥治愈程度上的差異。在上述篩選方法中，向試驗動物施用受試化合物時，如果該試驗動物的上述疾病癥狀得到約10％或更多、優(yōu)選約30％或更多、更優(yōu)選約50％或更多的改善，則可以將該受試化合物選作對上述疾病具有治療、預(yù)防效果的化合物。可以使用該篩選方法的化合物是選自上述受試化合物的化合物，該化合物對因本發(fā)明蛋白質(zhì)的缺損和損傷等引起的疾病具有治療、預(yù)防效果，因此可以作為針對該疾病的安全、低毒性預(yù)防·治療劑等藥物使用。另外，由通過上述篩選方法獲得的化合物衍生的化合物同樣也可以使用。通過上述篩選方法獲得的化合物可以形成鹽。作為該化合物的鹽，使用與生理學(xué)上允許的酸(例如無機酸、有機酸等)或堿(例如堿金屬等)的鹽，特別優(yōu)選生理學(xué)上允許的酸加成鹽。這種鹽包括例如與無機酸(例如鹽酸、磷酸、氫溴酸和硫酸等)的鹽，或與有機酸(例如醋酸、甲酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、枸櫞酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸和苯磺酸等)的鹽等。含有通過上述篩選方法獲得的化合物或其鹽的藥物，可以與上述含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的藥物同樣地制備。這樣得到的制劑安全、毒性低，因此可以向人或哺乳動物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、羊、豬、牛、馬、貓、狗和猴等)施用。該化合物或其鹽的給藥量因?qū)ο蠹膊　⒔o藥對象、給藥途徑等而異。例如，口服給藥該化合物時，一般成人(以體重60kg計)乳腺癌患者每天服用該化合物約0.1～100mg，優(yōu)選約1.0～50mg，更優(yōu)選約1.0～20mg。非口服給藥時，該化合物的單次給藥量因給藥對象和對象疾病等而異。例如，普通成人(以體重60kg計)乳腺癌患者以注射劑的形式施用該化合物時，每天通過靜脈注射施用該化合物約0.01～30mg，優(yōu)選約0.1～20mg，更優(yōu)選約0.1～10mg。對其它動物，可以按照換算成每60kg體重的量施用。(8b)促進或抑制本發(fā)明DNA啟動子活性的化合物的篩選方法本發(fā)明提供篩選促進或抑制本發(fā)明DNA啟動子活性的化合物的方法，其特征在于，向本發(fā)明DNA表達缺陷非人哺乳動物施用受試化合物，并檢測報道基因的表達。在上述篩選方法中，作為本發(fā)明DNA表達缺陷非人哺乳動物，使用在上述本發(fā)明DNA表達缺陷非人哺乳動物中，通過轉(zhuǎn)染報道基因使本發(fā)明DNA失活、并且該報道基因可以在本發(fā)明DNA啟動子的控制下進行表達的動物。受試化合物與上述相同。報道基因使用與上述相同的報道基因，優(yōu)選β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、可溶性堿性磷酸酯酶基因和熒光素酶基因等。在本發(fā)明DNA被報道基因取代了的本發(fā)明DNA表達缺陷非人哺乳動物中，由于報道基因在本發(fā)明DNA啟動子的支配下存在，因此可以通過探測(trace)報道基因編碼的物質(zhì)的表達，來檢測啟動子的活性。例如，用來源于大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)取代編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA區(qū)域的一部分時，在本來表達本發(fā)明蛋白質(zhì)的組織中表達β-半乳糖苷酶，而不是本發(fā)明蛋白質(zhì)。因此，通過使用例如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-半乳吡喃糖苷(galactopyranoside)(X-gal)等作為β-半乳糖苷酶基質(zhì)的試劑進行染色，可以簡便地觀察本發(fā)明蛋白質(zhì)在動物機體內(nèi)的表達狀況。具體地，將本發(fā)明蛋白質(zhì)缺失的小鼠或其組織切片用戊二醛等固定，用磷酸緩沖生理鹽水(PBS)洗滌后，與包含X-gal的染色液在室溫或37℃附近反應(yīng)約30分鐘～1小時，組織標本用1mMEDTA/PBS溶液洗滌，由此終止β-半乳糖苷酶反應(yīng)，如果觀察到顯色則可。另外，也可以根據(jù)常規(guī)方法檢測編碼lacZ的mRNA?？梢允褂迷摵Y選方法的化合物或其鹽，是選自上述受試化合物的化合物，該化合物是促進或抑制本發(fā)明DNA的啟動子活性的化合物。通過上述篩選方法獲得的化合物可以形成鹽。作為該化合物的鹽，使用與生理學(xué)上允許的酸(例如無機酸等)或堿(例如堿金屬等)的鹽，特別優(yōu)選生理學(xué)上允許的酸加成鹽。這種鹽包括例如與無機酸(例如鹽酸、磷酸、氫溴酸和硫酸等)的鹽，或與有機酸(例如醋酸、甲酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、枸櫞酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸和苯磺酸等)的鹽等。抑制本發(fā)明DNA啟動子活性的化合物或其鹽，由于可以抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達、抑制該蛋白質(zhì)的功能，因此可以作為癌癥(例如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦瘤、動脈瘤等)的預(yù)防·治療劑。另外，由通過上述篩選方法獲得的化合物衍生的化合物同樣也可以使用。含有通過上述篩選方法獲得的化合物或其鹽的藥物，可以與上述含有本發(fā)明蛋白質(zhì)或其鹽的藥物同樣地制備。這樣得到的制劑安全、毒性低，因此可以向人或哺乳動物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、羊、豬、牛、馬、貓、狗和猴等)施用。該化合物或其鹽的給藥量因?qū)ο蠹膊?、給藥對象、給藥途徑等而異。例如，口服給藥抑制本發(fā)明DNA啟動子活性的化合物時，一般成人(以體重60kg計)乳腺癌患者每天服用該化合物約0.1～100mg，優(yōu)選約1.0～50mg，更優(yōu)選約1.0～20mg。非口服給藥時，該化合物的單次給藥量因給藥對象和對象疾病等而異。例如，普通成人(以體重60kg計)乳腺癌患者以注射劑的形式施用抑制本發(fā)明DNA啟動子活性的化合物時，每天通過靜脈注射施用該化合物約0.01～30mg，優(yōu)選約0.1～20mg，更優(yōu)選約0.1～10mg。對其它動物，可以施用以每60kg體重換算的量。這樣，本發(fā)明DNA表達缺陷非人哺乳動物，對篩選促進或抑制本發(fā)明DNA啟動子活性的化合物或其鹽是極其有用的，可以對因本發(fā)明DNA表達缺陷引起的各種疾病的病因研究或預(yù)防·治療劑的開發(fā)作出很大貢獻。另外，如果使用含有本發(fā)明蛋白質(zhì)啟動子區(qū)域的DNA，在其下游連接編碼各種蛋白質(zhì)的基因，并將其注入動物卵細胞中，從而制備所謂的轉(zhuǎn)基因動物(基因轉(zhuǎn)染動物)，則還可以特異性地合成其蛋白質(zhì)，并研究其在機體中的作用。進一步地，如果在上述啟動子部分結(jié)合適當?shù)膱蟮阑?，并?gòu)建表達該基因的細胞株，則其可以作為下述低分子化合物的研究體系而使用，其中所述低分子化合物具有特異性促進或抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)本身在體內(nèi)的產(chǎn)生能力的作用。在本說明書中，堿基或氨基酸等用簡寫表示時，該簡寫是根據(jù)IUPAC-IUBCommissiononBiochemicalNomenclature的簡寫或本領(lǐng)域常用的簡寫，其例子如下所示。另外，對于氨基酸，存在光學(xué)異構(gòu)體時，除非另有說明，表示L型。DNA脫氧核糖核酸cDNA互補脫氧核糖核酸A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鳥嘌呤C胞嘧啶RNA核糖核酸mRNA信使核糖核酸dATP脫氧腺苷三磷酸dTTP脫氧胸苷三磷酸dGTP脫氧鳥苷三磷酸dCTP脫氧胞苷三磷酸ATP腺苷三磷酸EDTA乙二胺四乙酸SDS十二烷基硫酸鈉Gly甘氨酸Ala丙氨酸Val纈氨酸Leu亮氨酸Ile異亮氨酸Ser絲氨酸Thr蘇氨酸Cys半胱氨酸Met蛋氨酸Glu谷氨酸Asp天冬氨酸Lys賴氨酸Arg精氨酸His組氨酸Phe苯丙氨酸Tyr酪氨酸Trp色氨酸Pro脯氨酸Asn天冬酰胺Gln谷氨酰胺pGlu焦谷氨酸Sec硒代半胱氨酸(selenocysteine)另外，本說明書中常用的取代基、保護基團和試劑用下列符號表示Me甲基Et乙基Bu丁基Ph苯基TC噻唑烷-4(R)-羧酰氨基Tos對甲苯磺酰CHO甲?；鵅zl芐基Cl2-Bzl2，6-二氯芐基Bom芐氧基甲基Z芐氧羰基Cl-Z2-氯芐氧羰基Br-Z2-溴芐基氧基羰基Boc叔丁氧羰基DNP二硝基苯酚Trt三苯甲基Bum叔丁氧甲基FmocN-9-芴基甲氧羰基HOBt1-羥基苯并三唑HOOBt3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-1，2，3-苯并三唑HONB1-羥基-5-降冰片烯-2，3-二羧基酰亞胺DCCN，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺本說明書中序列表的序列號表示以下的序列。表示SEMA4B的氨基酸序列。表示編碼具有序列號1所示氨基酸序列的SEMA4B的DNA的堿基序列。表示包含編碼SEMA4B全長基因的DNA的堿基序列。表示SEMA4B-M1的氨基酸序列。表示編碼具有序列號4所示氨基酸序列的SEMA4B-M1的DNA的堿基序列。表示包含編碼SEMA4B-M1全長基因的DNA的堿基序列。表示SEMA4B-M2的氨基酸序列。表示編碼具有序列號7所示氨基酸序列的SEMA4B-M2的DNA的堿基序列。表示包含編碼SEMA4B-M2全長基因的DNA的堿基序列。表示SEMA4B-M3的氨基酸序列。表示編碼具有序列號10所示氨基酸序列的SEMA4B-M3的DNA的堿基序列。表示包含編碼SEMA4B-M3全長基因的DNA的堿基序列。表示實施例2、3、15和16中使用的反義寡核苷酸的堿基序列。表示實施例2、3、15和16中使用的寡核苷酸的堿基序列。表示實施例3中使用的反義寡核苷酸的堿基序列。表示實施例3中使用的寡核苷酸的堿基序列。表示實施例3中使用的引物的堿基序列。表示實施例3中使用的引物的堿基序列。表示實施例4、6和7中使用的引物的堿基序列。表示實施例4和7中使用的引物的堿基序列。表示實施例6中使用的引物的堿基序列。表示實施例8中使用的肽1的氨基酸序列。表示實施例8中使用的肽2的氨基酸序列。表示實施例8中使用的肽3的氨基酸序列。表示實施例8中使用的肽4的氨基酸序列。后述實施例4中獲得的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌(Escherichiacoli)TOP10/SEMA4B-M1/pCR4-TOPO從2003年3月4日起保藏在日本茨城縣Tsukuba市東1丁目1番地1中央第6(郵編305-8566)的獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心，保藏號為FERMBP-8316。后述實施例4中獲得的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌TOP10/SEMA4B-M2/pCR4-TOPO從2003年3月4日起保藏在日本茨城縣Tsukuba市東1丁目1番地1中央第6(郵編305-8566)的獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心，保藏號為FERMBP-8317。后述實施例4中獲得的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌TOP10/SEMA4B-M3/pCR4-TOPO從2003年3月4日起保藏在日本茨城縣TSukuba市東1段1號1中央第6(郵編305-8566)的獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心，保藏號為FERMBP-8318。以下通過實施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實施例的限制。實施例1基因表達解析為了明確在肺癌組織中的特異性表達亢進的基因組，以從肺癌組織4例、正常肺組織5例中提取的總RNA(totalRNA)(表1)作為材料，用寡核苷酸微陣列(oligonucleotidemicroarray)(HumanGenomeU95A，U95B，U95C，U95D，U95E；Affymetrix公司)進行基因表達解析。實驗根據(jù)Affymetrix公司的實驗手冊進行(ExpressionAnalysisTechnicalManual)。結(jié)果在肺癌組織3例(lot.0011-192-01285、lot.0011-192-01293和lot.0011-192-01297)檢測出了Semaphorin4B(SEMA4B)和后述實施例4中記載的Semaphorin4B-M1(SEMA4B-M1)、Semaphorin4B-M2(SEMA4B-M2)以及Semaphorin4B-M3(SEMA4B-M3)基因的表達亢進(表2)?；虮磉_量以用寡核苷酸微點陣檢測出了基因表達的全部基因的表達量的中間值為1進行標準化。ND未檢測出實施例2人肺癌細胞株的細胞凋亡誘導(dǎo)通過抑制SEMA4B和后述實施例4中記載的SEMA4B-M1、SEMA4B-M2和SEMA4B-M3基因的表達，研究是否誘導(dǎo)人肺癌細胞株的細胞凋亡。首先，將從AmericanTypeCultureCollection(ATCC)購入的人非小細胞肺癌細胞株NCI-H1703懸浮在加入了10％胎牛血清(ATCC)的RPMI-1640培養(yǎng)基中(包含25mMHEPES)(InvitrogenCorp.)，然后以1萬個細胞/孔的細胞密度(培養(yǎng)基液體的量0.1ml)接種到96孔平底組織培養(yǎng)板中(BDFalcon社)。在5％二氧化碳氣流中在37℃培養(yǎng)一晚后，用反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染。具體地，在設(shè)計可以與具有序列號1、序列號4、序列號7和序列號10所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的3′非翻譯區(qū)域序列雜交的反義寡核苷酸序列(序列號13)后，合成硫代磷酸化的寡核苷酸，通過HPLC純化后用于轉(zhuǎn)染實驗(以下簡稱為“反義寡核苷酸)。作為對照，同法將序列號13所示堿基序列的反向序列(序列號14)硫代磷酸化，通過HPLC純化后使用(以下簡稱為“對照寡核苷酸”)。將用Opti-MEM(InvitrogenCorp.)稀釋了的反義寡核苷酸或?qū)φ展押塑账崤c用Opti-MEM(InvitrogenCorp.)稀釋至5倍并在室溫放置了5分鐘的Oligofectamine(InvitrogenCorp.)以8∶3的比例(體積比)混合，并以40μL/孔的比例添加到板上。進行調(diào)節(jié)使寡核苷酸的最終濃度達到250nM。在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)3天后，用CellDeathDetectionELISAPLUS試劑盒(RocheDiagnostics)，根據(jù)其隨附的說明書測定上述兩種寡核苷酸的細胞凋亡誘導(dǎo)活性。結(jié)果反義寡核苷酸(序列號13)與對照寡核苷酸(序列號14)相比，顯示出約1.6倍的細胞凋亡誘導(dǎo)活性，表明具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P≤0.01)(表3)。實施例3SEMA4B反義寡核苷酸導(dǎo)致的基因表達量降低研究施用反義寡核苷酸是否導(dǎo)致SEMA4B基因和后述實施例4中記載的SEMA4B-M1、SEMA4B-M2和SEMA4B-M3基因的表達量降低。將實施例2中使用的人非小細胞肺癌細胞株NCI-H1703懸浮在與實施例2中相同的培養(yǎng)基中，并以6萬個細胞/孔的細胞密度(培養(yǎng)基液體的量0.6ml)接種到24孔平底組織培養(yǎng)板(BDFalcon社)中。在5％二氧化碳氣流中在37℃培養(yǎng)一晚后，按照實施例2中的方法接種反義寡核苷酸。但寡核苷酸的添加量為240μL/孔，并且使用兩種反義寡核苷酸(序列號13和序列號15)和兩種對照寡核苷酸(序列號14和序列號16)。關(guān)于來源于序列號15和序列號16的反義寡核苷酸和對照寡核苷酸，在設(shè)計與具有序列號1、序列號4、序列號7和序列號10的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的3＇非翻譯區(qū)域序列雜交的反義寡核苷酸序列(序列號15)后，合成硫代磷酸化的寡核苷酸，通過HPLC純化后用于轉(zhuǎn)染實驗。同法將序列號15所示堿基序列的反向序列(序列號16)硫代磷酸化，并通過HPLC純化后使用。轉(zhuǎn)染后，在5％二氧化碳氣流中在37℃繼續(xù)培養(yǎng)24小時。然后用RNeasy(注冊商標)MiniTotalRNAKit(QIAGEN)提取總RNA(totalRNA)。用大約300ng的總RNA作為模板，用TaqManReverseTranscriptionReagents(AppliedBiosystems)根據(jù)其隨附的說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以轉(zhuǎn)變成總RNA時相當于7～9ng的cDNA作為模板，用兩種引物(序列號17)和序列號18)和SYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems)測定SEMA4B、SEMA4B-M1、SEMA4B-M2和SEMA4B-M3的表達拷貝數(shù)。用TaqManβ-actinControlReagents(AppliedBiosystems)測定相同量的模板cDNA中所含的β-肌動蛋白基因表達量作為內(nèi)部標準。用蒸餾水代替寡核苷酸溶液時(以下簡稱為“非轉(zhuǎn)染組”)，SEMA4B、SEMA4B-M1、SEMA4B-M2和SEMA4B-M3基因的表達量總和為β-肌動蛋白基因表達量的6.6％，而反義寡核苷酸(序列號13和序列號15)給藥組為0.98％和1.1％，確認基因表達量具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異水平的(P≤0.05)降低。另一方面，對照寡核苷酸(序列號14和序列號16)給藥組的表達量為4.1％和3.4％，確認與非轉(zhuǎn)染組相比基因表達量具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異水平的降低。由此可知，SEMA4B、SEMA4B-M1、SEMA4B-M2和SEMA4B-M3基因的表達抑制與細胞凋亡的誘導(dǎo)相關(guān)。實施例4編碼SEMA4B、SEMA4B-M1、SEMA4B-M2和SEMA4B-M3的cDNA的克隆和堿基序列確定以來源于人肺癌細胞株(A549)的Marathon-ReadycDNA(CLONTECH社)作為模板，用兩種引物(序列號19和序列號20)進行PCR反應(yīng)。該反應(yīng)液50μl由1μl上述cDNA、2.5UPfuTurboHotstartDNAPolymerase(STRATAGENE社)、各1.0μM的引物(序列號19和序列號20)、200μMdNTPs和25μl2×GCBuffferI(TakaraShuzoCo.，Ltd.)組成。PCR反應(yīng)在95℃進行1分鐘后，反復(fù)進行以下循環(huán)30次在95℃反應(yīng)1分鐘、在60℃反應(yīng)1分鐘、在72℃反應(yīng)4分鐘，循環(huán)后進一步在72℃進行5分鐘伸長反應(yīng)。為了在PCR產(chǎn)物的3′末端添加dATP，加入5U的ExTaqDNA聚合酶(TakaraShuzoCo.，Ltd.)并在72℃保溫7分鐘。所得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物用PCRPurificationKit(QIAGEN)純化，并按照TOPOTAPCRCloningKit(InvitrogenCorp.)的方案將其亞克隆到質(zhì)粒載體pCR4-TOPO(InvitrogenCorp.)。將該克隆轉(zhuǎn)染到大腸桿菌TOP10后，在包含氨芐西林的LB瓊脂培養(yǎng)基中篩選攜帶cDNA的克隆。分析各克隆的堿基序列，結(jié)果分別獲得序列號2、序列號5、序列號8和序列號11所示的cDNA堿基序列。將SEMA4B基因(GenBankAccessionNo.XM_044533基因)堿基序列中的第1-237和第2749-3766堿基序列分別添加到序列號2、序列號5、序列號8和序列號11所示堿基序列5′末端和3′末端，分別如序列號3、序列號6、序列號9和序列號12所示。序列號2所示堿基序列編碼的氨基酸序列(序列號1)與SEMA4B基因(GenBankAccessionNo.XM_044533基因)編碼的SEMA4B蛋白質(zhì)完全一致。分別將含有序列號5所示堿基序列編碼的氨基酸序列(序列號4)的蛋白質(zhì)命名為SEMA4B-M1、含有序列號8所示堿基序列編碼的氨基酸序列(序列號7)的蛋白質(zhì)命名為SEMA4B-M2、合有序列號11所示堿基序列編碼的氨基酸序列(序列號10)的蛋白質(zhì)命名為SEMA4B-M3。在SEMA4B-M1的氨基酸序列(序列號4)中，SEMA4B的氨基酸序列(序列號1)第208位的Ser被Ile取代。在編碼SEMA4B-M1的DNA的堿基序列(序列號5)中，編碼SEMA4B的DNA堿基序列(序列號2)第90位的g被a取代、第111位的g被a取代、第623位的g被t取代。第623位的取代伴隨著氨基酸取代。SEMA4B-M2的氨基酸序列(序列號7)中，SEMA4B的氨基酸序列(序列號1)第163位的Met被Ile取代。在編碼SEMA4B-M2的DNA的堿基序列(序列號8)中，編碼SEMA4B的DNA的堿基序列(序列號2)第150位的g被a取代、第489位的g被a取代、第528位的c被t取代、第1266的t被c取代、第1588的c被a取代、第2343位的a被g取代，第489位的取代伴隨著氨基酸取代。在SEMA4B-M3的氨基酸序列(序列號10)中，SEMA4B的氨基酸序列(序列號1)第364位的Lys被Asn取代。在編碼SEMA4B-M3的DNA的堿基序列(序列號11)中，編碼SEMA4B的DNA的堿基序列(序列號2)第1092位的g被t取代，并伴隨著氨基酸取代。分別將攜帶具有序列號2所示堿基序列的DNA的質(zhì)粒命名為SEMA4B/pCR4-TOPO、攜帶具有序列號5所示堿基序列的DNA的質(zhì)粒命名為SEMA4B-M1/pCR4-TOPO、攜帶具有序列號8所示堿基序列的DNA的質(zhì)粒命名為SEMA4B-M2/pCR4-TOPO、攜帶具有序列號11所示堿基序列的DNA的質(zhì)粒命名為SEMA4B-M3/pCR4-TOPO。并且，將轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒SEMA4B/pCR4-TOPO的轉(zhuǎn)化體、轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒SEMA4B-M1/pCR4-TOPO的轉(zhuǎn)化體、轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒SEMA4B-M2/pCR4-TOPO的轉(zhuǎn)化體和轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒SEMA4B-M3/pCR4-TOPO的轉(zhuǎn)化體分別命名為大腸桿菌TOP10/SEMA4B/pCR4-TOPO、大腸桿菌TOP10/SEMA4B-M1/pCR4-TOPO大腸桿菌TOP10/SEMA4B-M2/pCR4-TOPO和大腸桿菌TOP10/SEMA4B-M3/pCR4-TOPO。實施例5人培養(yǎng)細胞株中基因表達量的研究以下使用的腦腫瘤細胞系SK-N-MC、SK-N-AS、SK-N-BE、SK-N-DZ、SK-N-FI、SK-N-SH、D341Med、Daoy、DBTRG-05MG、U-118MG、U-87MG、CCF-STTG1和SW1088；人乳腺癌細胞株HCC1937、ZR-75-1、AU565、MCF-7和MDA-MB-231；人結(jié)腸癌細胞株Caco-2、COLO201、COLO205、COLO320DM、HCT-8、HT-29、LoVo、LS123、SNU-C1、SK-CO-1、SW403、SW48、SW480、SW620、SW837和SW948；人胎兒腎臟細胞株HEK293；人小細胞肺癌細胞株NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、NCI-H889、NCI-H1672、NCI-H1836、NCI-H2227、NCI-N417和SHP-77人非小細胞肺癌株A549、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H358、NCI-H460、NCI-H522、NCI-H661、NCI-H810、NCI-H1155、NCI-H1299、NCI-H1395、NCI-H1417、NCI-H1435、NCI-H1581、NCI-H1651、NCI-H1703、NCI-H1793、NCI-H1963、NCI-H2073、NCI-H2085、NCI-H2106、NCI-H2228、NCI-H2342和NCI-H2347；人卵巢癌細胞株ES-2、Caov-3、MDAH2774、NIHOVCAR3、OV-90、SK-OV-3、TOV-112D和TOV-21G；人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1、MIA-PaCa-2、AsPC-1、BxPC-3、Capan-1和Capan-2；人前列腺癌細胞株DU145；人視網(wǎng)膜細胞瘤細胞株WERI-Rb-1和Y79；以及人睪丸癌細胞株Cates-1B一共86株從ATCC購入。人正常氣管上皮細胞SAEC和人正常前列腺上皮細胞HprEC從Clonetics公司購入。人結(jié)腸癌細胞株COCM1、人非小細胞肺癌細胞株VMRC-LCD和人前列腺癌細胞株P(guān)C3從JCRB購入。這些細胞株有時在實施例9以后的實施例在也使用。用RNeasyMiniTotalRNAKit(QIAGEN)由上述91株細胞株制備總RNA。以該總RNA為模板，通過采用隨機引物的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA，通過進行定量的PCR反應(yīng)檢測SEMA4B基因(序列號2)、SEMA4B-M1基因(序列號5)、SEMA4B-M2基因(序列號8)和SEMA4B-M3基因(序列號11)的表達量。上述PCR反應(yīng)中，使用由上述總RNA3～4ng得到的cDNA作為模板，在與實施例3相同的條件下進行PCR反應(yīng)，算出SEMA4B、SEMA4B-M1、SEMA4B-M2和SEMA4B-M3基因的表達拷貝數(shù)。與此平行地，用TaqManTMHumanβ-actinControlReagents(AppliedBiosystems)算出上述總RNA中所含的β-肌動蛋白基因的拷貝數(shù)作為內(nèi)部標準。上述基因總表達量與β-肌動蛋白基因表達量進行標準化所得的相對表達率如表4所示。發(fā)現(xiàn)上述基因總表達量超過β-肌動蛋白基因表達量1％的癌細胞株17株，從而確認上述基因在癌細胞株中高水平地表達。實施例6重組型全長蛋白質(zhì)的動物細胞用表達載體的構(gòu)建以實施例4中獲得的質(zhì)粒SEMA4B/pCR4-TOPO為模板通過PCR擴增SEMA4B基因。該反應(yīng)中的反應(yīng)液的組成如下使用2ng的SEMA4B/pCR4-TOPO作為模板，加入PfuTurboHotstartDNAPolymerase(STRATAGENE)2.5U，兩種引物(序列號19和序列號21)各1μM、dNTPs200μM和10×PfuBuffer5μl，使液體量達到50μl。PCR在95℃進行1分鐘后，重復(fù)以下循環(huán)25次95℃，1分鐘；60℃，1分鐘；和72℃，4分鐘。然后用PCRPurificationKit(QIAGEN)純化該PCR反應(yīng)產(chǎn)物，接著用限制酶XbaI和EcoRI處理。質(zhì)粒p3xFLAG-CMV-14(Sigma)也用XbaI和EcoRI處理。各DNA片段用PCRPurificationKit純化，并用DNALigationKitver.2(TakaraBio，Inc.)進行連接反應(yīng)。將連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)染大腸桿菌TOP10后，在包含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌，并分析各克隆，結(jié)果表明得到包含相當于SEMA4B基因(序列號2)的cDNA片段的質(zhì)粒pCMV-14-SEMA4B。實施例7帶標記的重組型全長蛋白質(zhì)的動物細胞用表達載體的構(gòu)建構(gòu)建表達在SEMA4B蛋白質(zhì)的C末端融合了3xFLAG標記的蛋白質(zhì)的動物細胞用表達載體。除了將通過PCR擴增SEMA4B基因時所用的引物對，變成其它的引物對(序列號19和序列號20)之外，按照實施例6中記載的方法篩選轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌。結(jié)果得到包含下述cDNA片段的質(zhì)粒pCMV-14-SEMA4B-3xFLAG，所述cDNA片段編碼在SEMA4B蛋白質(zhì)(序列號1)的C末端融合了3xFLAG標記的蛋白質(zhì)。實施例8肽抗體的制備和純化以SEMA4B蛋白質(zhì)(序列號1)、SEMA4B-M1蛋白質(zhì)(序列號4)、SEMA4B-M2蛋白質(zhì)(序列號7)和SEMA4B-M3蛋白質(zhì)(序列號10)的氨基酸序列為基礎(chǔ)，通過Fmoc固相合成法合成包含12～15個氨基酸的下述4種肽(肽1～4)。肽1的氨基酸序列[Asn-Ser-Ala-Arg-Glu-Arg-Lys-Ile-Asn-Ser-Ser-Cys(序列號22)]是在SEMA4B蛋白質(zhì)(序列號1)的第402～412位的氨基酸序列的C末端添加了Cys的序列。肽2的氨基酸序列[Ser-Val-Val-Ser-Pro-Ser-Phe-Val-Pro-Thr-Gly-Glu-Lys-Pro-Cys(序列號23)]是SEMA4B蛋白質(zhì)(序列號1)的第582-596位的氨基酸序列。肽3的氨基酸序列[Pro-Leu-Asp-His-Arg-Gly-Tyr-Gln-Ser-Leu-Ser-Asp-Ser-Pro-Cys(序列號24)]是在SEMA4B蛋白質(zhì)(序列號1)的第781-794位的氨基酸序列的C末端添加了Cys的序列。肽4的氨基酸序列[Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Glu-Ser-Glu-Lys-Arg-Pro-Leu-Ser-Cys(序列號25)]是在SEMA4B蛋白質(zhì)(序列號1)的第797-809位的氨基酸序列的C末端添加了Cys的序列。在上述肽1、肽2、肽3和肽4各肽上結(jié)合匙孔戚血藍蛋白(Keyholelimpethemocyanin，KLH)作為載體蛋白制成結(jié)合抗原，并如下所述，制備兔多克隆抗體。用1只雄性兔KBLJW(11周齡，OrientalYeastCo.，Ltd.)作為免疫動物，初次致敏使用弗氏完全佐劑(DifcoLaboratories)懸浮液，第2次及其以后使用弗氏不完全佐劑(DifcoLaboratories)懸浮液。致敏通過背部皮下注射進行，1次致敏使用各抗原0.5mg，初次致敏后每14天重復(fù)3次。在初次致敏后第52天在麻醉下進行頸動脈采血，得到血清約50ml。將如上獲得的血清通過硫酸銨鹽析法濃縮，所得的粗制IgG級分全部用A蛋白親和柱(Amersham-BioscienceCorp.)純化，由此從免疫了肽1、肽2、肽3或肽4的兔分別獲得純IgG約103mg、約76mg、約112mg和約122mg。并且，得到了結(jié)合在固定了各免疫原肽的柱上的IgG級分。固定時，利用各肽的C末端Cys，用硼酸緩沖液將肽偶聯(lián)到Sepharose柱(Amersham-BioscienceCorp.)上。從柱上洗脫時，使用8M尿素/磷酸緩沖化生理鹽水(PBS)。洗脫液相對PBS進行透析而除去尿素后，進行超濃縮(ultraconcentration)、膜濾滅菌，由此得到肽1、肽2、肽3和肽4的親和純化抗體AS-2531、AS-2532、AS-2591和AS-2592分別約15mg、約126mg、約17mg和約35mg。實施例9采用兔肽抗體的免疫印跡法SEMA4B蛋白質(zhì)(序列號1)的檢測，用實施例8中制備的純化肽抗體進行。將來源于人非小細胞肺癌的NCI-H358細胞1.5×106個懸浮在包含10％胎牛血清(JRH社)的RPMI-1640培養(yǎng)基(InvitrogenCorp.)10ml中，并接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿中，在5％二氧化碳氣流下在37℃培養(yǎng)一晚。將實施例6中制備的質(zhì)粒pCMV-14-SEMA4B6μg和Plus試劑(InvitrogenCoRP.)以及OPTI-MEMI(InvitrogenCorp.)混合，在室溫放置15分鐘后，加入LipofectAMINE轉(zhuǎn)染試劑(InvitrogenCorp.)和OPTI-MEMI，并繼續(xù)在室溫放置15分鐘。將該混合液滴加到培養(yǎng)液中并繼續(xù)培養(yǎng)。在表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2天后將細胞用冰冷的PBS洗滌，并添加冰冷的RIPA緩沖液[50mMTris-鹽酸緩沖液，pH7.5，150mM氯化鈉、1％TritonX-100、0.1％SDS、1％脫氧膽酸、CompleteTMtablet(RocheDiagnostics社)、磷酸酶抑制劑雞尾酒-2(Sigma社)]1ml，在4℃放置30分鐘。回收該RIPA緩沖液，并以15,000rpm離心分離20分鐘，所得的上清作為不含細胞的提取液。將該不含細胞的提取液與2倍濃度的SDS-PAGE用樣品緩沖劑[125mMTris-鹽酸緩沖液，pH6.8，40％甘油、4％SDS、0.04％溴酚藍和5％2-巰基乙醇]等體積混合，在95℃加熱5分鐘后，將其中10μl加載加載到10％丙烯酰胺凝膠的SDS-PAGE上。電泳分離的蛋白質(zhì)按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)錄到ClearBlottingP膜(ATTO)后，在封閉溶液[50mMTris-鹽酸緩沖液，pH7.5，500mM氯化鈉、0.1％吐溫20、5％脫脂乳]中在室溫放置1小時。然后用封閉溶液將實施例8中制備的肽抗體AS-2531、AS-2532、AS-2591或AS-2592稀釋到濃度為3μg/ml，在4℃反應(yīng)一晚上。接著，在用封閉溶液稀釋5萬倍或10萬倍的HRP-標記抗兔IgG抗體(Amersham-BioscienceCorp.)中在室溫放置1小時。檢測時使用ECLplus(Amersham-BioscienceCorp.)，按照隨附的說明書檢測SEMA4B蛋白質(zhì)。除AS-2531之外，使用AS-2532、AS-2591和AS-2592中的任何一種時，均在100kD分子量附近位置發(fā)現(xiàn)來源于SEMA4B蛋白質(zhì)的特異性帶。實施例10使用兔肽抗體的免疫沉淀使用實施例8中制備的純化肽抗體，在非變性狀態(tài)下進行SEMA4B蛋白質(zhì)的免疫沉淀。用實施例7中獲得的質(zhì)粒pCMV-14-SEMA4B-3xFLAG，按照與實施例9中同樣的操作制備不含細胞的提取液。將ProteinG-Sepharose4FF(Amersham-BioscienceCorp.)用等體積的RIPA緩沖液懸浮，往該懸浮液50μl中加入不含細胞的提取液400μl，進一步加入實施例8中記載的肽抗體AS-2531、AS-2532、AS-2591和AS-2592中的任意一種5μg制備混合液，并在4℃攪拌一晚。將ProteinG-Sepharose4FF共沉淀級分，用RIPA緩沖液洗滌后，懸浮在50μlSDS-PAGE用樣品緩沖液[62.5mMTris-鹽酸緩沖液，pH6.8，20％甘油、2％SDS、0.02％溴酚藍和2.5％2-巰基乙醇]中，在95℃加熱5分鐘后，將其中5μl或10μl加載到10％丙烯酰胺凝膠的SDS-PAGE上。檢測根據(jù)實施例9記載的方法進行。但使用將小鼠抗FLAGM2抗體(Sigma社)用封閉溶液稀釋到0.2μg/ml或0.1μg/ml所得的物質(zhì)作為初級抗原，以將HRP-標記抗小鼠IgG抗體(Amersham-BioscienceCorp.)用封閉溶液稀釋2.5萬倍或5萬倍所得的物質(zhì)作為次級抗原。即使使用肽抗體AS-2531、AS-2532、AS-2591和AS-2592中的任意一種進行免疫沉淀，也在100kD分子量附近發(fā)現(xiàn)SEMA4B蛋白質(zhì)的特異性帶。由此可知，肽抗體AS-2531、AS-2532、AS-2591和AS-2592與未變性的SEMA4B蛋白質(zhì)結(jié)合。實施例11癌細胞株中SEMA4B蛋白質(zhì)的表達研究在2個直徑10cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)肺癌細胞株NCI-H2228、NCI-H1651、NCI-H358、NCI-H23和NCI-H1703；卵巢癌細胞株SKOV-3和TOV-21G；前列腺癌細胞株DU145；和胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1。對于各種細胞，將一個培養(yǎng)皿中的細胞用胰蛋白酶·EDTA(Invitrogen社)分散，并測定細胞數(shù)?；谒鶞y得的細胞數(shù)，以5×106個細胞/1ml的比例將冰冷的RIPA緩沖液(實施例9中記載的)添加到另一個培養(yǎng)皿中，并在4℃放置30分鐘。回收該RIPA緩沖液，以15,000rpm離心分離20分鐘，將所得的上清作為不含細胞的提取液。同時，準備按照SizeTMXProteinGImmunoprecipitationKit(Pierce社)隨附的說明書使實施例8中記載的肽抗體AS-2531與ProteinG-Sepharose4FF(Amersham-BioscienceCorp.)交聯(lián)得到的樹脂，并用等體積的RIPA緩沖液懸浮。往該懸浮液30μl中加入上述不含細胞的提取液400μl，在4℃攪拌一晚上。將ProteinG-Sepharose4FF共沉淀級分用RIPA緩沖液洗滌后，懸浮在實施例10記載的SDS-PAGE用樣品緩沖液中，并在95℃加熱5分鐘，然后將其中的20μl加載到10％丙烯酰胺凝膠的SDS-PAGE上。使用肽抗體AS-2532按照實施例9中記載的方法進行檢測。上述9種細胞株中，在NCI-H2228、NCI-H358、NCI-H23、SKOV-3、DU145和PANC-1的各細胞株中，在100kD分子量附近發(fā)現(xiàn)SEMA4B蛋白質(zhì)的特異性帶。由此可知，SEMA4B蛋白質(zhì)在上述6種癌細胞株中高水平地表達。實施例12穩(wěn)定表達重組型全長蛋白質(zhì)的細胞株的建立將來源于人非小細胞肺癌的NCI-H358細胞2.0×105個懸浮在2ml包含10％胎牛血清(JRH社)、1mM丙酮酸鈉和25mMHEPES的RPMI-1640培養(yǎng)基(InvitrogenCorp.)中，并接種到6孔培養(yǎng)板上，然后在5％二氧化碳氣流下在37℃培養(yǎng)一晚上。同時，將用OPTI-MEMI(InvitrogenCorp.)稀釋了的實施例6中記載的質(zhì)粒pCMV-14-SEMA4B1μg與Plus試劑(InvitrogenCorp.)6μl混合，并在室溫放置15分鐘，然后添加用OPTI-MEMI稀釋了的LipofectAMINE轉(zhuǎn)染試劑(InvitrogenCorp.)4μl，繼續(xù)在室溫放置15分鐘。將該混合液滴加到培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)1天，然后用胰蛋白酶·EDTA(InvitrogenCorp.)分散細胞，用加入了G418(PromegaCorp.)并使其濃度達到400μg/ml的上述培養(yǎng)基稀釋10倍，并接種到24孔培養(yǎng)板上。在5％二氧化碳氣流下在37℃繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每3天或4天更換包含G418的上述培養(yǎng)基(G418選擇培養(yǎng)基)。然后從1～3個細胞增殖并形成了集落的孔中回收細胞，并等量地接種到48孔培養(yǎng)板的2個孔中。繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度達到50％或50％以上后，向1個孔的細胞中加入實施例10中記載的SDS-PAGE用樣品緩沖液50μl，制備細胞溶解液。在95℃加熱5分鐘后，將其中5μl加載到10％丙烯酰胺凝膠上進行SDS-PAGE。按照實施例9中記載的方法用肽抗體AS-2532進行免疫印跡，檢測穩(wěn)定表達組成型(constitutively)表達SEMA4B蛋白質(zhì)(序列號1)的細胞。將從另一個孔中回收的細胞稀釋到0.7個細胞/孔后接種到96孔培養(yǎng)板上。在5％二氧化碳氣流下在37℃繼續(xù)培養(yǎng)到細胞密度達到50％左右，培養(yǎng)期間每3或4天更換G418選擇培養(yǎng)基。再次等量地接種到48孔培養(yǎng)板的2個孔中，并繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度達到50％以上，由1個孔中的細胞制備細胞溶解液，用該溶解液與上述同法進行免疫印跡。選擇最高水平地表達SEMA4B蛋白質(zhì)(序列號1)的克隆，得到穩(wěn)定表達SEMA4B的細胞株SEMA4B/H358。實施例13SEMA4B蛋白質(zhì)定位性研究(生物素標記)用人非小細胞肺癌細胞株NCI-H2228和NCI-H358和實施例12中制備的重組型全長蛋白質(zhì)的穩(wěn)定表達細胞株(SEMA4B/H358)，將暴露在細胞表層上的蛋白質(zhì)用CellularLabelingandImmunoprecipitationKit(RocheDiagnostics)進行生物素標記。然后用1ml按照實施9的方法制備的不含細胞的細胞提取液和5μg實施例8中制備的肽抗體AS-2591，根據(jù)實施例10的方法進行免疫沉淀和SDS-PAGE。用HRP標記的鏈霉抗生物素蛋白(streptoavidin)(Amersham-BioscienceCorp.)進行檢測，結(jié)果在100kD分子量附近發(fā)現(xiàn)SEMA4B蛋白質(zhì)的特異性帶，表明SEMA4B蛋白質(zhì)、SEMA4B-M1蛋白質(zhì)、SEMA4B-M2蛋白質(zhì)和SEMA4B-M3蛋白質(zhì)局部存在(localized)于細胞表面。實施例14SEMA4B蛋白質(zhì)定位性研究(FACS分析)將人非小細胞肺癌細胞株NCI-H2228和NCI-H358以及實施例12中記載的SEMA4B/H358分別接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿中，并培養(yǎng)至亞滿底(subconfluent)。將各細胞用PBS洗滌后，加入含有0.5％BSA和5mMEDTA的PBS，并在室溫放置15分鐘，將細胞分散。然后將該細胞以4×106個/ml的濃度懸浮在緩沖液A[包含2％胎牛血清(JRH社)和0.1％疊氮化鈉的HBSS(Hanks′BalancedSaltSolutions，InvitrogenCorp.)]中，加入AS-2532或非免疫兔IgG(Jackson)使其終濃度為10μg/ml，并在冰中放置3小時。用緩沖液A將細胞洗滌后，懸浮到包含10μg/ml的Alexa488標記抗兔IgG抗體(MolecularProbes社)的緩沖液A中，并在冰上放置2小時。再次用緩沖液A洗滌后，用FACScan(BDBiosciences)進行分析。結(jié)果所有細胞中均進行兔肽抗體AS-2532特異性染色，表明SEMA4B蛋白質(zhì)、SEMA4B-M1蛋白質(zhì)、SEMA4B-M2蛋白質(zhì)和SEMA4B-M3蛋白質(zhì)局部存在于細胞表面上。實施例15通過轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸導(dǎo)致的人非小細胞肺癌細胞株NCI-H358的細胞凋亡檢測在實施例2中記載的NCI-H1703以外的人非小細胞肺癌細胞株中是否也通過轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸而誘發(fā)細胞凋亡。將NCI-H358懸浮在包含10％胎牛血清(JRH)、1mM丙酮酸鈉和25mMHEPES的RPMI-1640培養(yǎng)基(InvitrogenCorp.)中，然后將NCI-H358按照細胞密度為8×103個/孔(培養(yǎng)基液體的量80μl)，接種到96孔平底組織培養(yǎng)板(BDFalcon社)中，在5％二氧化碳氣流中在37℃培養(yǎng)一晚。另一方面，將實施例2中記載的反義寡核苷酸(序列號13)和對照寡核苷酸(序列號14)各0.06μg用OPTI-MEMI(InvitrogenCorp.)稀釋，并與0.5μlPlus試劑(InvitrogenCorp.)混合，然后在室溫放置15分鐘。加入用OPTI-MEMI稀釋了的LipofectAMINE轉(zhuǎn)染試劑(InvitrogenCorp.)0.4μl，進一步在室溫放置15分鐘。將該混合液全部添加到NCI-H358培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)3天后，按照CellDeathDetectionELISAPLUS(RocheDiagnostics社)和Caspase-Glo3/7assay(PromegaCorp.)隨附的說明書測定上述寡核苷酸誘導(dǎo)細胞凋亡的活性。結(jié)果顯示，通過CellDeathDetectionELISAPLUS和Caspase-Glo3/7試驗，在NCI-H358中，與作為陰性對象使用的對照寡核苷酸相比，反義寡核苷酸分別顯示1.42倍和1.77倍的細胞凋亡誘導(dǎo)活性，表明具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P≤0.01)(表5和6)。實施例16通過反義寡核苷酸的轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)人非小細胞肺癌細胞株NCI-H2228、NCI-H1651和NCI-H23的細胞凋亡在NCI-H1703(實施例2)和NCI-H358(實施例15)中也檢測了通過轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸是否誘發(fā)細胞凋亡。對于NCI-H2228，使用包含10％胎牛血清(JRH)、1mM丙酮酸鈉和25mMHEPES的RPMI-1640培養(yǎng)基(InvitrogenCorp.)。對于NCI-H1651，使用包含10％FBS的ACL-4培養(yǎng)基(ATCC)。對于NCI-H23，使用10％胎牛血清(JRH社)和25mMHEPES的RPMI-1640培養(yǎng)基(InvitrogenCorp.)。將各細胞分別懸浮在相應(yīng)的培養(yǎng)基中，并以7.5×103個/孔(NCI-H2228)、7.5×103個/孔(NCI-H1651)和5×103個/孔(NCI-H23)的細胞密度接種到96孔平底組織培養(yǎng)板(BDFalcon社)中，在5％二氧化碳氣流中在37℃培養(yǎng)一晚。另一方面，將實施例2中記載的反義寡核苷酸(序列號13)和對照寡核苷酸(序列號14)各0.135μg用OPTI-MEMI(InvitrogenCorp.)稀釋，并與0.75μlPlus試劑(InvitrogenCorp.)混合后，在室溫放置15分鐘。加入用OPTI-MEMI稀釋了的LipofectAMINE試劑(InvitrogenCorp.)0.4μl，進一步在室溫放置15分鐘。將該混合液全部添加到各細胞的培養(yǎng)液中，并繼續(xù)培養(yǎng)3天后，按照CellDeathDetectionELISAPLUS(RocheDiagnostics)隨附的說明書測定上述寡核苷酸誘導(dǎo)細胞凋亡的活性。結(jié)果表明，對于所有的細胞株，與作為陰性對象使用的對照寡核苷酸相比，反義寡核苷酸分別顯示1.58倍(NCI-H2228)、1.21倍(NCI-H1651)和1.25倍(NCI-H23)的細胞凋亡誘導(dǎo)活性。算出P-值為P≤0.05(NCI-H2228)、P≤0.05(NCI-H1651)和P≤0.01(NCI-H23)，表明具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(表7、8和9)。實施例17采用兔肽抗體誘發(fā)細胞凋亡用實施例8中獲得的兔肽抗體AS-2531和AS-2532處理人非小細胞肺癌細胞株NCI-H2228，并測定這些兔肽抗體的細胞凋亡誘導(dǎo)活性。將NCI-H2228懸浮在包含10％胎牛血清(JRH)、1mM丙酮酸鈉和25mMHEPES的RPMI-1640培養(yǎng)基(InvitrogenCorp.)中，并按照細胞密度達到4×103個細胞/孔，接種到涂布了I型膠原的96孔平底組織培養(yǎng)板(BDFalcon社)中，然后在5％二氧化碳氣流中在37℃培養(yǎng)一晚。將實施例8中獲得的兔肽抗體AS-2531和AS-2532以及非免疫兔IgG(Jackson社)用PBS稀釋，分別將各抗體添加到培養(yǎng)液中，使其終濃度分別達到15μg/ml、45μg/ml和150μg/ml。繼續(xù)培養(yǎng)5天后，按照CellDeathDetectionELISAPLUS(RocheDiagnostics)隨附的說明書測定上述兔肽抗體的細胞凋亡誘導(dǎo)活性。結(jié)果顯示，與相同濃度的非免疫兔IgG相比，在45μg/ml和15μg/ml的AS-2531存在下，分別顯示1.26倍和1.31倍的細胞凋亡誘導(dǎo)活性(P≤0.05和P≤0.01)。另外，與相同濃度的非免疫兔IgG相比，在150μg/ml的AS-2532存在下，顯示1.27倍的細胞凋亡誘導(dǎo)活性(P≤0.01)。由此可知，SEMA4B蛋白質(zhì)、SEMA4B-M1蛋白質(zhì)、SEMA4B-M2蛋白質(zhì)和SEMA4B-M3蛋白質(zhì)對維持人肺癌細胞的生存起重要作用。工業(yè)適用性本發(fā)明所用的蛋白質(zhì)在癌細胞中特異性地表達，是癌癥的診斷標記。因此，抑制該蛋白質(zhì)活性的化合物或其鹽、抑制該蛋白質(zhì)基因表達的化合物或其鹽、本發(fā)明的反義多核苷酸、本發(fā)明的抗體可以安全地用作例如癌癥(例如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦瘤、動脈瘤等)的預(yù)防·治療劑、細胞凋亡促進(誘導(dǎo))劑等。另外，本發(fā)明所用的蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的多核苷酸、本發(fā)明的抗體等對于篩選癌癥(例如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦瘤、動脈瘤等)預(yù)防·治療劑、細胞凋亡促進(誘導(dǎo))劑等方面是有用的。序列表<110>武田藥品工業(yè)株式會社(TakedaPharmaceuticalCompanyLimited)<120>新型蛋白質(zhì)及其用途<130>3132WOOP<150>JP2002-378052<151>2002-12-26<150>JP2003-65497<151>2003-03-11<160>25<210>1<211>837<212>PRT<213>人<400>1MetLeuArgThrAlaMetGlyLeuArgSerTrpLeuAlaAlaProTrp51015GlyAlaLeuProProArgProProLeuLeuLeuLeuLeuLeuLeuLeu202530LeuLeuLeuGlnProProProProThrTrpAlaLeuSerProArgIle354045SerLeuProLeuGlySerGluGluArgProPheLeuArgPheGluAla505560GluHisIleSerAsnTyrThrAlaLeuLeuLeuSerArgAspGlyArg65707580ThrLeuTyrValGlyAlaArgGluAlaLeuPheAlaLeuSerSerAsn859095LeuSerPheLeuProGlyGlyGluTyrGlnGluLeuLeuTrpGlyAla100105110AspAlaGluLysLysGlnGlnCysSerPheLysGlyLysAspProGln115120125ArgAspCysGlnAsnTyrIleLysIleLeuLeuProLeuSerGlySer130135140HisLeuPheThrCysGlyThrAlaAlaPheSerProMetCysThrTyr145150155160IleAsnMetGluAsnPheThrLeuAlaArgAspGluLysGlyAsnVal165170175LeuLeuGluAspGlyLysGlyArgCysProPheAspProAsnPheLys180185190SerThrAlaLeuValValAspGlyGluLeuTyrThrGlyThrValSer195200205SerPheGlnGlyAsnAspProAlaIleSerArgSerGlnSerLeuArg210215220ProThrLysThrGluSerSerLeuAsnTrpLeuGlnAspProAlaPhe225230235240ValAlaSerAlaTyrIleProGluSerLeuGlySerLeuGlnGlyAsp245250255AspAspLysIleTyrPhePhePheSerGluThrGlyGlnGluPheGlu260265270PhePheGluAsnThrIleValSerArgIleAlaArgIleCysLysGly275280285AspGluGlyGlyGluArgValLeuGlnGlnArgTrpThrSerPheLeu290295300LysAlaGlnLeuLeuCysSerArgProAspAspGlyPheProPheAsn305310315320ValLeuGlnAspValPheThrLeuSerProSerProGlnAspTrpArg325330335AspThrLeuPheTyrGlyValPheThrSerGlnTrpHisArgGlyThr340345350ThrGluGlySerAlaValCysValPheThrMetLysAspValGlnArg355360365ValPheSerGlyLeuTyrLysGluValAsnArgGluThrGlnGlnMet370375380ValHisArgAspProProValProThrProArgProGlyAlaCysIle385390395400ThrAsnSerAlaArgGluArgLysIleAsnSerSerLeuGlnLeuPro405410415AspArgValLeuAsnPheLeuLysAspHisPheLeuMetAspGlyGln420425430ValArgSerArgMetLeuLeuLeuGlnProGlnAlaArgTyrGlnArg435440445ValAlaValHisArgValProGlyLeuHisHisThrTyrAspValLeu450455460PheLeuGlyThrGlyAspGlyArgLeuHisLysAlaValSerValGly465470475480ProArgValHisIleIleGluGluLeuGlnIlePheSerSerGlyGln485490495ProValGlnAsnLeuLeuLeuAspThrHisArgGlyLeuLeuTyrAla500505510AlaSerHisSerGlyValValGlnValProMetAlaAsnCysSerLeu515520525TyrArgSerCysGlyAspCysLeuLeuAlaArgAspProTyrCysAla530535540TrpSerGlySerSerCysLysHisValSerLeuTyrGlnProGlnLeu545550555560AlaThrArgProTrpIleGlnAspIleGluGlyAlaSerAlaLysAsp565570575LeuCysSerAlaSerSerValValSerProSerPheValProThrGly580585590GluLysProCysGluGlnValGlnPheGlnProAsnThrValAsnThr595600605LeuAlaCysProLeuLeuSerAsnLeuAlaThrArgLeuTrpLeuArg610615620AsnGlyAlaProValAsnAlaSerAlaSerCysHisValLeuProThr625630635640GlyAspLeuLeuLeuValGlyThrGlnGlnLeuGlyGluPheGlnCys645650655TrpSerLeuGluGluGlyPheGlnGlnLeuValAlaSerTyrCysPro660665670GluValValGluAspGlyValAlaAspGlnThrAspGluGlyGlySer675680685ValProValIleIleSerThrSerArgValSerAlaProAlaGlyGly690695700LysAlaSerTrpGlyAlaAspArgSerTyrTrpLysGluPheLeuVal7057l0715720MetCysThrLeuPheValLeuAlaValLeuLeuProValLeuPheLeu725730735LeuTyrArgHisArgAsnSerMetLysValPheLeuLysGlnGlyGlu740745750CysAlaSerValHisProLysThrCysProValValLeuProProGlu755760765ThrArgProLeuAsnGlyLeuGlyProProSerThrProLeuAspHis770775780ArgGlyTyrGlnSerLeuSerAspSerProProGlySerArgValPhe785790795800ThrGluSerGluLysArgProLeuSerIleGlnAspSerPheValGlu805810815ValSerProValCysProArgProArgValArgLeuGlySerGluIle820825830ArgAspSerValVal835<210>2<211>2511<212>DNA<213>人<400>2atgctgcgcaccgcgatgggcctgaggagctggctcgccgccccatggggcgcgctgccg60cctcggccaccgctgctgctgctcctgctgctgctgctcctgctgcagccgccgcctccg120acctgggcgctcagcccccggatcagcctgcctctgggctctgaagagcggccattcctc180agattcgaagctgaacacatctccaactacacagcccttctgctgagcagggatggcagg240accctgtacgtgggtgctcgagaggccctctttgcactcagtagcaacctcagcttcctg300ccaggcggggagtaccaggagctgctttggggtgcagacgcagagaagaaacagcagtgc360agcttcaagggcaaggacccacagcgcgactgtcaaaactacatcaagatcctcctgccg420ctcagcggcagtcacctgttcacctgtggcacagcagccttcagccccatgtgtacctac480atcaacatggagaacttcaccctggcaagggacgagaaggggaatgtcctcctggaagat540ggcaagggccgttgtcccttcgacccgaatttcaagtccactgccctggtggttgatggc600gagctctacactggaacagtcagcagcttccaagggaatgacccggccatctcgcggagc660caaagccttcgccccaccaagaccgagagctccctcaactggctgcaagacccagctttt720gtggcctcagcctacattcctgagagcctgggcagcttgcaaggcgatgatgacaagatc780tactttttcttcagcgagactggccaggaatttgagttctttgagaacaccattgtgtcc840cgcattgcccgcatctgcaagggcgatgagggtggagagcgggtgctacagcagcgctgg900acctccttcctcaaggcccagctgctgtgctcacggcccgacgatggcttccccttcaac960gtgctgcaggatgtcttcacgctgagccccagcccccaggactggcgtgacacccttttc1020tatggggtcttcacttcccagtggcacaggggaactacagaaggctctgccgtctgtgtc1080ttcacaatgaaggatgtgcagagagtcttcagcggcctctacaaggaggtgaaccgtgag1140acacagcagatggtacaccgtgacccacccgtgcccacaccccggcctggagcgtgcatc1200accaacagtgcccgggaaaggaagatcaactcatccctgcagctcccagaccgcgtgctg1260aactttctcaaggaccact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