專利名稱：一種農藥殘留快速檢測試劑盒及其用法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種農藥殘留快速檢測試劑盒及其用法。專用于農產品、食品、水、土壤、中毒生物體尤其是糧食、蔬菜、水果、中藥材及肉類中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留的快速檢測。
背景技術：
隨著我國工業(yè)的迅速發(fā)展及農業(yè)和產業(yè)結構的戰(zhàn)略性調整，特別是栽培方式的變革，原先為次要的、甚至為檢疫性的病蟲草等有害生物的發(fā)生危害日趨嚴重，抗藥性不斷上升，導致農藥用量和施藥次數(shù)不斷增加。濫用高毒、高殘留農藥的現(xiàn)象屢禁不止，有的不按規(guī)范要求使用農藥，有的甚至嚴重違反農藥安全使用標準。使用高毒農藥致使相當部分農產品農藥殘留明顯超標，食用后在人體內積累，引發(fā)疾病，有時甚至發(fā)生急性中毒，嚴重危及人民健康和生命安全。同時，農藥殘留問題也給農產品生產和正常貿易帶來了許多負面影響。隨著消費者的健康意識、環(huán)保意識的日益增強，人們更加關心糧食、蔬菜、水果、中藥材及肉類中有無農藥污染。因此，農藥殘留的檢測，尤其是快速檢測越來越受到人們的重視。
農藥殘留檢測技術一直是國際農產品和食品安全研究領域的一個重要熱點。國內外對農產品及環(huán)境中化學農藥的殘留分析大多采用儀器分析法、生物測定和生化測定方法。儀器分析法包括高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、薄層色譜法、HPLC/MS(液-質聯(lián)用)和GC/MS(氣-質聯(lián)用)等，這也是目前許多國家農藥殘留分析和檢測的標準方法。但儀器分析方法對設備要求較高，工作程序較復雜，操作較繁，對樣品需要進行預處理，不能快速進行大批量樣品的分析。生物測定是利用某些生物(如植物、昆蟲等)對一些農藥的敏感性進行殘留測定的。生物測定需要不斷尋找和培(飼)養(yǎng)敏感生物，檢測時間長，靈敏度不高，重復性差。生化測定法包括酶聯(lián)免疫法和酶抑制法，由于具有檢測時間短、操作簡單的優(yōu)點，常被用于農藥殘留的快速檢測。但酶聯(lián)免疫法由于特異性強，需要同時具有多種抗體，不僅制作困難，成本也比較高，故很難普遍應用。酶抑制法是根據(jù)一些農藥的作用機制(如利用有機磷和氨基甲酸酯類農藥對乙酰膽堿酯酶的抑制作用)來進行殘留測定的。酶抑制法以及以酶抑制法為原理研制的速測儀、速測卡等通常針對有機磷和氨基甲酸酯類農藥，并不準確定性農藥品種和定量，亦不能確定農藥種類，如是有機磷還是氨基甲酸酯類農藥等。

發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明的目的在于提供一種農藥殘留快速檢測試劑盒及其用法，用于農產品、食品、水、土壤、中毒生物體尤其是糧食、蔬菜、水果、中藥材及肉類中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留的快速檢測，試劑盒制作簡便，靈敏度高，成本低，操作簡單、快速。
技術方案一種農藥殘留快速檢測試劑盒，包括提取試劑、底物、顯色劑、酶，其中提取試劑是指試劑和乳化劑，包括Na2HPO4、KH2PO4和Triton X-100，或加入蒸餾水配制成的磷酸鹽緩沖液，濃度0.1％～10％；底物是指碘化硫代乙酰膽堿或其配制成的溶液，濃度0.001％～0.1％；顯色劑1#是指2，6-二氯靛酚、靛酚、2，6-二氯靛酚鹽、靛酚鹽或其他靛酚衍生物，或配制成的溶液，濃度0.0001％～0.01％；顯色劑2#是指二氯化鈀，或其配制成的溶液，濃度0.001％～0.1％；酯酶是指從實驗室長期飼養(yǎng)的特定家蠅品系的頭部提取的，對氨基甲酸酯類農藥敏感而對有機磷類農藥不敏感的膽堿酯酶或其粗酶，或配制成的溶液，配制方法為每mg酯酶加0.1mL～100mL上述提取試劑。
一份典型的提取試劑包括2.1gNa2HPO4、0.1g KH2PO4和1g Triton X-100，使用時加入蒸餾水至100mL，攪拌溶解即可，濃度3.2％，或事先就配制好。
上述農藥殘留檢測試劑盒的用法，其特征在于，1)試樣的制備取2g樣品置于10mL燒杯中，加5mL緩沖液，浸泡5min，振搖，作為提取液備用；2)檢測步驟a)取比色板，分別將并排4個眼標記為A、CKA、B、CKB，CKA、CKB分別為A、B的空白對照；b)用移液器或滴管分別在A、B中加入提取液0.1mL或2滴，在CKA、CKB中加入緩沖液0.1mL或2滴；c)分別在A、CKA中加酯酶液0.1mL或2滴，搖勻，放置10min，再加入底物溶液0.1mL或2滴；d)分別在A、CKA中加顯色劑1#0.1mL或2滴，在B、CKB中加顯色劑2#0.1mL或2滴，放置10min后觀察顏色的變化情況；3)結果的判斷當A、B的顏色與CKA、CKB基本一致時，為未檢出氨基甲酸酯類農藥小于0.05mg/kg，有機磷類農藥小于0.5mg/kg；當A、B的顏色比CKA、CKB略深，為可能檢出氨基甲酸酯類農藥0.05～1mg/kg，有機磷類農藥0.5～10mg/kg；當A、B的顏色明顯比CKA、CKB深時，為檢出氨基甲酸酯類農藥大于1mg/kg，有機磷類農藥大于10mg/kg；當A呈現(xiàn)蘭色時，說明存在氨基甲酸酯類農藥殘留，當B呈現(xiàn)黃色或黃褐色時，說明存在有機磷農藥殘留。
有益效果本發(fā)明涉及一種農藥殘留檢測試劑盒，對有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留的快速檢測在平板的比色孔內進行，利用有機磷與氨基甲酸酯類農藥對經篩選的特定膽堿酯酶的活性抑制作用的差異，即氨基甲酸酯類農藥對膽堿酯酶的活性抑制作用敏感，其抑制率與氨基甲酸酯農藥含量呈直線關系。而有機磷類農藥對該膽堿酯酶的活性基本無抑制作用，但有機磷類農藥與二氯化鈀結合能夠顯色，其顯色程度與有機磷類農藥含量呈正相關。
底物如碘化硫代乙酰膽堿可以被膽堿酯酶所水解，生成硫代膽堿，硫代膽堿能還原顯色劑，如顯色劑選用2，6-二氯靛酚或靛酚，則藍色會褪色，藍色的深淺與膽堿酯酶的活性呈負相關，與膽堿酯酶活性的抑制程度呈正相關，與氨基甲酸酯農藥的量呈正相關。而有機磷類農藥對這種膽堿酯酶的活性無抑制作用，不影響2，6-二氯靛酚或靛酚的藍色褪色，但有機磷類農藥與二氯化鈀結合能夠顯橘黃色，其顯色程度與有機磷類農藥含量呈正相關。
即當樣品提取液中的氨基甲酸酯類農藥較多存在(大于1mg/kg)時，藍色不褪，較少存在(0.05～1mg/kg)時，藍色變淺，極少存在或完全不存在(小于0.05mg/kg)時，藍色消失，通過藍色的變化判斷樣品中氨基甲酸酯農藥殘留是否超過限量標準。當樣品提取液中的有機磷農藥較多存在(大于10mg/kg)時，呈深橘黃色，較少存在(0.5～10/kg)時，呈淺橘黃色，極少存在或完全不存在(小于0.5mg/kg)時，無顏色變化，通過呈現(xiàn)橘黃色的深淺判斷樣品中有機磷農藥殘留是否超過限量標準。
本發(fā)明專利產品農藥殘留快速檢測試劑盒有下列幾個特點a、制作簡便。試劑盒由比色板、滴管、提取劑、酶、底物與顯色劑等組成。
b、靈敏度高。對有機磷和氨基甲酸酯殺蟲劑的最低檢出限可達0.1～3mg/kg。并能確定農藥類型是有機磷還是氨基甲酸酯。
c、成本低。單一樣品的檢測試劑消耗成本0.10元。
d、操作簡單、快速。整個操作過程使用5種試劑，樣品檢測時間在20分鐘左右，能夠滿足現(xiàn)場快速檢測的要求。
四

圖1為有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留的快速檢測程序五、發(fā)明的具體實施方式
試劑盒的盒體是指放置平板、吸管和試劑的包裝物，該包裝物通常是指可以保持低溫的保溫瓶或冰瓶，也包括其他材料的瓶、盒、袋、盆等，如包裝物不具有保溫功能，試劑盒中的酯酶需要放于冰箱的冷凍室。一個典型的盒體為直徑20cm、高30cm，具有保溫功能的冰瓶，另加一個10cm長×7cm寬×13cm高的紙盒。
平板是本試劑盒中十分關鍵的部分，是指用于比色的具孔的板，該板通常是指白色的陶瓷板或塑料板，也包括其他材料的白色的或淺顏色的板，用于比色的孔從1個到100個均可。一個典型的平板為12cm長×10cm寬×1cm高的白色瓷板，由3排孔組成，每排4個，共12個孔，均勻分布，孔為圓形，直徑1.5cm，0.5cm深，可以同時檢測5個樣品。
吸管包括用于移取液體的滴管、吸管、移液管或移液槍等。一個典型的吸管為每滴0.05mL的塑料滴管，一端具有吸囊。
實施例1 20型農藥殘留快速檢測平板比色試劑盒冰瓶1個，直徑20cm、高30cm，內裝可以檢測20個樣品的酯酶凍干粉1份(1mg)。紙盒1個，11cm長×8cm寬×13cm高，內裝白色陶瓷平板1塊，12cm長×10cm寬×1cm高，共12個孔。100mL燒杯1只，10mL燒杯1只，25mL量筒1只，玻璃棒1只。滴管5支。提取試劑1袋，包括2.1gNa2HPO4、0.1g KH2PO4和1g Triton X-100，放于塑料袋中。底物1瓶，0.0125％的碘化硫代乙酰膽堿溶液，2mL。顯色劑1#1瓶，顯色劑2#1瓶，各2mL。
以下試劑可滿足20個樣品中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留的快速檢測提取試劑包括2.1gNa2HPO4、0.1g KH2PO4和1g Triton X-100。可以放于塑料袋中，也可以放在100mL容量瓶或試劑瓶中，加入蒸餾水至100mL，攪拌溶解即可。
底物溶液用提取試劑或蒸餾水配制成0.0125％的碘化硫代乙酰膽堿溶液，一份2mL，可以檢測20個樣品。
顯色劑顯色劑1#溶液可用提取試劑或蒸餾水配制成0.003％的2，6-二氯靛酚鈉溶液，一份2mL，可以檢測20個樣品。顯色劑2#溶液可用提取試劑或蒸餾水配制成0.02％的二氯化鈀溶液，一份2mL，可以檢測20個樣品。
酯酶是從長期飼養(yǎng)(飼養(yǎng)2年，采自南京馬群)的家蠅品系的頭部提取的膽堿酯酶，該酯酶的特點是對氨基甲酸酯類農藥敏感，而對有機磷類農藥不敏感。提取方法(農藥學學報，2001，329～31)為已有技術，經過頭部分離、勻漿、離心、冷凍干燥、活性測定、分裝等過程，一份酯酶1mg，使用時可加提取試劑或蒸餾水2mL，搖勻，配制成酯酶溶液，一份酯酶可以檢測20個樣品。
應用農藥殘留快速檢測程序以下操作可在20℃～35℃溫度下進行。25℃～30℃最佳。
1試樣的制備樣品擦去表面泥水，取代表性食部，取2g置于10mL燒杯中，加5mL緩沖液，浸泡5min，不時振搖。作為提取液備用。
2檢測步驟a)取比色板，分別將并排4個眼標記為A、CKA、B、CKB，CKA、CKB分別為A、B的空白對照。
b)用移液器或滴管分別在A、B中加入提取液0.1mL(或2滴)，在CKA、CKB中加入緩沖液0.1mL(或2滴)。
c)分別在A、CKA中加酶液0.1mL(或2滴)，搖勻，放置10min，再加入底物溶液0.1mL(或2滴)。
d)分別在A、CKA中加顯色劑1#0.1mL(或2滴)，在B、CKB中加顯色劑2#0.1mL(或2滴)，放置10min后觀察顏色的變化情況。
3結果的判斷當A、B的顏色與CKA、CKB基本一致時，為未檢出。
當A、B的顏色比CKA、CKB略深，為可能檢出。
當A、B的顏色明顯比CKA、CKB深時，為檢出。
當A呈現(xiàn)蘭色時，說明存在氨基甲酸酯類農藥殘留。當B呈現(xiàn)黃色或黃褐色時，說明存在有機磷農藥殘留。顏色的深淺度與農藥殘留量呈正相關，顏色越深時，說明農藥殘留量越高。
實施例2 100型農藥殘留快速檢測平板比色試劑盒冰瓶1個，直徑15cm、高30cm，內裝可以檢測100個樣品的酯酶凍干粉1份(5mg)。紙盒1個，11cm長×8cm寬×13cm高，內裝白色陶瓷平板2塊，12cm長×10cm寬×1cm高，共12個孔。100mL燒杯1只，10mL燒杯2只，25mL量筒1只，玻璃棒1只。滴管5支。提取試劑5袋，每份包括2.1gNa2HPO4、0.1g KH2PO4和1g Triton X-100，放于塑料袋中。底物1瓶，0.0125％的碘化硫代乙酰膽堿溶液，共10mL。顯色劑1#1瓶，顯色劑2#1瓶，各10mL。
以下試劑可滿足100個樣品中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留的快速檢測提取試劑包括10.5gNa2HPO4、0.5g KH2PO4和5g Triton X-100?？梢苑庞谒芰洗校部梢苑旁?00mL容量瓶或試劑瓶中，使用時加入蒸餾水至500mL，攪拌溶解即可，或事先就配制好。
底物溶液可用提取試劑或蒸餾水配制成0.0125％的碘化硫代乙酰膽堿溶液，一份10mL，可以檢測100個樣品。
顯色劑顯色劑1#溶液可用提取試劑或蒸餾水配制成0.003％的2，6-二氯靛酚鈉溶液，一份10mL，可以檢測100個樣品。顯色劑2#溶液可用提取試劑或蒸餾水配制成0.02％的二氯化鈀溶液，一份10mL，可以檢測100個樣品。
酯酶是從采自南京馬群，飼養(yǎng)2年的家蠅品系的頭部提取的膽堿酯酶，該酯酶的特點是對氨基甲酸酯類農藥敏感，而對有機磷類農藥不敏感。提取方法為已有技術，經過頭部分離、勻漿、離心、冷凍干燥、活性測定、分裝等過程，一份酯酶5mg，使用時可用提取試劑或蒸餾水10mL，搖勻，配制成酯酶溶液，一份酯酶可以檢測100個樣品。
實施例3 最低檢出限測定研究了快速檢測試劑盒對10種有代表性的有機磷和氨基甲酸酯殺蟲劑的最低檢出限，其范圍在0.1～3mg/kg之間。測定結果如下

實施例4 準確度試驗采用氣相色譜(GC)法驗證了農藥殘留快速檢測試劑盒的準確度，陽性結果的符合率達到100％。測定方法是在青菜、四季豆、黃瓜中添加一定量的敵敵畏(10.0mg/kg)、樂果(5.0mg/kg)、呋喃丹(0.5mg/kg)，24小時后使用農藥殘留快速檢測試劑盒，根據(jù)農藥殘留快速檢測程序進行測定，同時用GC驗證。結果如下

實施例5 試劑盒的實際應用使用快速檢測試劑盒對市場上12個蔬菜和水果品種的20個樣品進行了實際應用。檢測結果表明，有2個樣品顯示存在有機磷農藥殘留(大于10mg/kg)，另有2個樣品顯示存在少量有機磷農藥殘留(0.5～10mg/kg)，1個樣品顯示存在少量氨基甲酸酯農藥殘留(0.05～1mg/kg)。該快速檢測試劑盒適用于青菜、白菜、菠菜、韭菜、黃瓜、土豆、四季豆、番茄、蘆蒿、梨、蘋果、獼猴桃等常見蔬菜和水果的農藥殘留快速檢測。測定結果如下

綜上所述本發(fā)明專利產品農藥殘留快速檢測試劑盒有下列幾個特點a、制作簡便。試劑盒由比色板、滴管、提取劑、酶粉、底物與顯色劑等組成。
b、靈敏度高。對有機磷和氨基甲酸酯殺蟲劑的最低檢出限可達0.1～3mg/kg。并能確定農藥類型是有機磷還是氨基甲酸酯。
c、成本低。單一樣品的檢測試劑消耗成本0.10元。
d、操作簡單、快速。整個操作過程使用5種試劑，樣品檢測時間在20分鐘左右，能夠滿足現(xiàn)場快速檢測的要求。
權利要求
1.一種農藥殘留快速檢測試劑盒，包括提取試劑、底物、顯色劑、酶，其中提取試劑是指試劑和乳化劑，包括Na2HPO4、KH2PO4和Triton X-100，或加入蒸餾水配制成的磷酸鹽緩沖液，濃度0.1％～10％；底物是指碘化硫代乙酰膽堿或其配制成的溶液，濃度0.001％～0.1％；顯色劑1#是指2，6-二氯靛酚、靛酚、2，6-二氯靛酚鹽、靛酚鹽或其他靛酚衍生物，或配制成的溶液，濃度0.0001％～0.01％；顯色劑2#是指二氯化鈀，或其配制成的溶液，濃度0.001％～0.1％；酯酶是指從實驗室長期飼養(yǎng)的特定家蠅品系的頭部提取的，對氨基甲酸酯類農藥敏感而對有機磷類農藥不敏感的膽堿酯酶或其粗酶，或配制成的溶液，配制方法為每mg酯酶加0.1mL～100mL上述提取試劑。
2.權利要求1所述的一種農藥殘留檢測試劑盒的用法，其特征在于，1)試樣的制備取2g樣品置于10mL燒杯中，加5mL緩沖液，浸泡5min，振搖，作為提取液備用；2)檢測步驟a.取比色板，分別將并排4個眼標記為A、CKA、B、CKB，CKA、CKB分別為A、B的空白對照；b.用移液器或滴管分別在A、B中加入提取液0.1mL或2滴，在CKA、CKB中加入緩沖液0.1mL或2滴；c.分別在A、CKA中加酯酶液0.1mL或2滴，搖勻，放置10min，再加入底物溶液0.1mL或2滴；d.分別在A、CKA中加顯色劑1#0.1mL或2滴，在B、CKB中加顯色劑2#0.1mL或2滴，放置10min后觀察顏色的變化情況；3)結果的判斷當A、B的顏色與CKA、CKB基本一致時，為未檢出氨基甲酸酯類農藥小于0.05mg/kg，有機磷類農藥小于0.5mg/kg；當A、B的顏色比CKA、CKB略深，為可能檢出氨基甲酸酯類農藥0.05～1mg/kg，有機磷類農藥0.5～10mg/kg；當A、B的顏色明顯比CKA、CKB深時，為檢出氨基甲酸酯類農藥大于1mg/kg，有機磷類農藥大于10mg/kg；當A呈現(xiàn)蘭色時，說明存在氨基甲酸酯類農藥殘留，當B呈現(xiàn)黃色或黃褐色時，說明存在有機磷農藥殘留。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種農藥殘留快速檢測的試劑盒及其用法，適用于有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留快速檢測，并能確定農藥類型是有機磷還是氨基甲酸酯。盒體內的試劑包括提取試劑、底物、顯色劑、酶。通過比色反應，來判斷有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留是否超標。試劑盒制作簡便，靈敏度高，對有機磷和氨基甲酸酯殺蟲劑的最低檢出限可達0.1～3mg/kg。成本低，單一樣品的檢測試劑消耗成本0.10元。操作簡單、快速，整個操作過程使用5種試劑，樣品檢測時間在20分鐘左右，能夠滿足現(xiàn)場快速檢測的要求。
文檔編號G01N21/77GK1687756SQ20041010183
公開日2005年10月26日 申請日期2004年12月27日 優(yōu)先權日2004年12月27日
發(fā)明者楊春龍, 張德琴, 胡秋輝, 王海峰, 楊紅, 陳守勇, 李燕, 安辛欣 申請人:南京農業(yè)大學, 南京市六合區(qū)農業(yè)技術推廣中心