專利名稱：以納米金為報告系統(tǒng)的病原體快速檢測基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種以納米金為報告系統(tǒng)的病原體快速檢測基因芯片。
技術(shù)背景病原體的快速檢測和鑒定對于感染性疾病的診斷和治療具有重要的意義。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離、培養(yǎng)及生化反應(yīng)，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對各種病原微生物的診斷以及流行病學(xué)的研究?，F(xiàn)在的細(xì)菌學(xué)研究已從一般的功能水平深入到分子生物學(xué)水平，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的細(xì)菌鑒定方法能夠大大縮短檢測時間，提高檢測靈敏度和特異性，同時分子生物學(xué)方法主要以微生物的基因為檢測靶標(biāo)，對微生物進(jìn)行基因分型，這樣就能夠克服以微生物表型特征為基礎(chǔ)檢測方法的缺點和影響因素，從根本上對微生物進(jìn)行鑒別和特征分型。
基因芯片技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項新的核酸檢測實驗技術(shù)，具有快速、敏感、高效、高通量等優(yōu)點。納米金是指直徑為納米范圍的金顆粒或含金的化合物，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可標(biāo)記于蛋白和核酸。同時，它具有與銀反應(yīng)后形成比原來體積大106倍的黑色顆粒，可以用肉眼觀察或用普通記錄裝置如照相、掃描記錄的特點，近年來受到了科研人員的重視，特別是用不具備吸附能力離散的納米金作為信號報告分子的應(yīng)用則是近年生物信號檢測中的一個重要進(jìn)展。
發(fā)明的內(nèi)容本實用新型的目的是提供一種將納米放大技術(shù)與基因芯片技術(shù)相結(jié)合，能快速、準(zhǔn)確地檢測和鑒定病原體的具有一定通量的、操作簡便、適合臨床使用的以納米金為報告系統(tǒng)的病原體快速檢測基因芯片。
為達(dá)到上述目的，本實用新型采取以下措施該芯片包括固相載體、連接分子、核酸探針；連接分子通過共價鍵結(jié)合于固相載體表面而修飾載體；核酸探針包括病原體特異性寡核苷酸探針、陽性對照探針、陰性對照探針；其中5’端經(jīng)修飾的寡核苷酸探針可與連接分子以共價鍵結(jié)合于固相載體表面；芯片上的探針可與用納米金標(biāo)記的待檢核酸雜交結(jié)合，利用能與納米金標(biāo)記中的金屬顆粒發(fā)生金屬相反應(yīng)的金屬試劑與已雜交結(jié)合在芯片上的核酸上標(biāo)記的納米金屬反應(yīng)，獲得便于進(jìn)行普通光學(xué)檢測的放大雜交信號。為保證檢測可靠性，采用與人類和微生物無任何同源性的植物基因為陽性對照和陰性對照，陽性對照植物基因與樣品并行處理，用于監(jiān)測待檢樣品的制備、標(biāo)記、雜交、顯色及檢測過程，陰性對照用于檢測雜交信號是否正確，空白對照用于檢測芯片制備是否正常。
在上述固相載體上設(shè)有5’端經(jīng)修飾的寡核苷酸探針包括(1)金黃色葡萄球菌探針(2)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因探針(3)大腸埃希菌探針(4)銅綠假單胞菌探針(5)表皮葡萄球菌探針(6)腦膜炎奈瑟氏菌探針(7)化膿性鏈球菌探針(8)肺炎鏈球菌探針(9)傷寒沙門氏菌探針
(10)腸球菌探針(11)白色念珠菌探針(12)乙肝病毒探針(13)丙肝病毒探針(14)陽性對照植物基因探針(15)陰性對照植物基因探針。
本實用新型的優(yōu)點(1)快速病原體特異性基因片段擴增只需2小時，核酸標(biāo)記及基因芯片雜交也僅需8～10小時，而傳統(tǒng)的細(xì)菌分離、培養(yǎng)及生化反應(yīng)的鑒定方法至少需要3～4天，縮短了診斷時間。
(2)特異以公認(rèn)的種、型特異性基因片段為各病原體核酸標(biāo)志，針對其設(shè)計特異性寡核苷酸探針，利用生物信息學(xué)技術(shù)對探針各參數(shù)進(jìn)行評估，計算機模擬篩選，并利用反向膜雜交技術(shù)對探針進(jìn)行篩選和驗證。
(3)敏感最低檢測值可達(dá)100fM，同目前常用的熒光素cy3為報告分子的方法相比，其靈敏度要高出50倍。
(4)準(zhǔn)確采用一段與微生物無任何同源性的植物基因為陽性對照，與樣品并行處理，對檢測進(jìn)行全程監(jiān)控，芯片上還加入了陰性對照及空白對照，從而對芯片檢測實施系統(tǒng)監(jiān)控，確保檢測的可靠性和準(zhǔn)確性。
(5)實用適用于臨床常見感染標(biāo)本的檢測，包括血、腦脊液、尿液、胸水、腹水、膿液等，設(shè)備要求低，檢測結(jié)果可以用肉眼或普通光學(xué)儀器記錄，適合普通實驗室開展。
本實用新型的制作方法(1)各病原體特異性核酸片段擴增引物5’端巰基(SH)修飾。
(2)特異性寡核苷酸探針5’端氨基修飾。
(3)基因芯片陣列的設(shè)計采用計算機輔助設(shè)計，芯片材料采用玻璃片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維膜，這些材料已被證明可行并在國內(nèi)外普遍應(yīng)用于基因芯片片基。
(4)低密度基因芯片的制備采用探針預(yù)先合成后再用點樣儀點于片基上的方法，探針固定采用氨基化探針與醛基活化的玻璃片共價結(jié)合的方法。
(5)核酸的標(biāo)記采用直徑為1.4nm的單順丁烯二乙酰亞胺修飾的納米金(monomaleimido-gold)，該納米微粒在pH6.0-7.0、含20mM NaH2PO4、150mMNaCL、1mM EDTA的緩沖液中，能和游離的巰基反應(yīng)生成穩(wěn)定的共價結(jié)合物，使核酸標(biāo)記上納米金顆粒。
(6)雜交信號檢測方法納米金顆粒與銀反應(yīng)后可形成比原來體積大106倍的黑色顆粒，可以用肉眼觀察或用普通記錄裝置如照相、掃描記錄。


圖1是以納米金為報告系統(tǒng)的病原體快速檢測基因芯片示意圖，包括1固相載體，2病原體特異性寡核苷酸探針，3陽性對照探針，4陰性對照探針，5空白對照探針。
圖2是以納米金為報告系統(tǒng)的病原體快速檢測基因芯片結(jié)構(gòu)示意圖，包括1固相載體，2病原體特異性寡核苷酸探針，6連接分子。
圖3是以納米金為報告系統(tǒng)的病原體快速檢測基因芯片檢測結(jié)構(gòu)示意圖，包括1固相載體，2病原體特異性寡核苷酸探針，6連接分子，7納米金標(biāo)記待檢靶核酸，8納米金顆粒，9銀顆粒。
權(quán)利要求1.一種以納米金為報告系統(tǒng)的病原體快速檢測基因芯片，其特征是該芯片包括固相載體、連接分子、陣列排列的核酸探針；連接分子通過共價鍵結(jié)合于固相載體表面而修飾載體；核酸探針包括病原體特異性寡核苷酸探針、陽性對照探針、陰性對照探針；其中病原體特異性寡核苷酸探針的5’端經(jīng)修飾后可與連接分子以共價鍵結(jié)合于固相載體表面；芯片上的探針可與用納米金標(biāo)記的待檢核酸雜交結(jié)合，利用能與納米金標(biāo)記中的金屬顆粒發(fā)生金屬相反應(yīng)的金屬試劑與已雜交結(jié)合在芯片上的核酸上標(biāo)記的納米金屬反應(yīng)，獲得便于進(jìn)行普通光學(xué)檢測的放大雜交信號。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以納米金為報告系統(tǒng)的病原體快速檢測基因芯片，其特征在于在上述固相載體上陣列設(shè)有的病原體特異性寡核苷酸探針包括(1)金黃色葡萄球菌探針，(2)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因探針，(3)大腸埃希菌探針，(4)銅綠假單胞菌探針，(5)表皮葡萄球菌探針，(6)腦膜炎奈瑟氏菌探針，(7)化膿性鏈球菌探針，(8)肺炎鏈球菌探針，(9)傷寒沙門氏菌探針，(10)腸球菌探針，(11)白色念珠菌探針，(12)乙肝病毒探針，(13)丙肝病毒探針。
3.根據(jù)權(quán)利1、2要求所述的以納米金為報告系統(tǒng)的病原體快速檢測基因芯片，在所述固相載體上的核酸探針陣列中設(shè)置有空白點。
4.根據(jù)權(quán)利1、2要求所述的以納米金為報告系統(tǒng)的病原體快速檢測基因芯片，其特征在于所說的固相載體為玻片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維膜。
專利摘要一種以納米金為報告系統(tǒng)的病原體快速檢測基因芯片，其特征是芯片包括固相載體、連接分子、核酸探針；連接分子通過共價鍵結(jié)合于固相載體表面；核酸探針包括病原菌特異性寡核苷酸探針、陽性對照探針、陰性對照探針；其中5’端經(jīng)修飾的寡核苷酸探針可與連接分子以共價鍵結(jié)合于固相載體表面；芯片上的探針可與用納米金標(biāo)記的待檢核酸雜交結(jié)合，利用能與納米金標(biāo)記中的金屬顆粒發(fā)生金屬相反應(yīng)的金屬試劑與已雜交結(jié)合在芯片上的核酸上標(biāo)記的納米金屬反應(yīng)，獲得便于進(jìn)行普通光學(xué)檢測的放大雜交信號。由于芯片上加入了陽性對照、陰性對照及空白對照，對芯片檢測實施系統(tǒng)監(jiān)控，確保檢測的可靠性和準(zhǔn)確性。具有快速、特異性好、靈敏度高等特點。
文檔編號G01N31/00GK2699290SQ20042003444
公開日2005年5月11日 申請日期2004年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月20日
發(fā)明者周元國, 魯衛(wèi)平, 顧大勇, 王 華 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所