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      偏諾皂苷類化合物的體內(nèi)含量測(cè)定方法

      文檔序號(hào):5880371閱讀:157來源:國(guó)知局
      專利名稱:偏諾皂苷類化合物的體內(nèi)含量測(cè)定方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種化合物的體內(nèi)含量測(cè)定方法,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
      背景技術(shù)
      中國(guó)專利85108520公開了兩種偏諾皂苷類化合物在婦科血癥方面的應(yīng)用。但是一個(gè)突出的問題是偏諾皂苷類化合物服用劑量很小,體內(nèi)含量無法直接用普通的——盡管是高靈敏的方法,如高效液相、氣相方法等測(cè)定。因此偏諾皂苷類化合物的吸收、代謝和動(dòng)力學(xué)特征從未被研究和報(bào)道。在已有的研究中,我們證實(shí)偏諾皂苷類化合物是以原形在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮藥理作用。由于其服用劑量極小,體內(nèi)含量極低,迫切需要一種能快速、簡(jiǎn)單、干擾小,并且能用于人體的體內(nèi)含量測(cè)定方法。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種可以用于偏諾皂苷類化合物各種劑型的生物利用度的測(cè)定及偏諾皂苷類化合物體內(nèi)代謝時(shí)間測(cè)定的偏諾皂苷類化合物的體內(nèi)含量測(cè)定方法。
      本發(fā)明所述的體內(nèi)含量測(cè)定方法可分為半定量和定量測(cè)定,其方法分別如下本發(fā)明所述的偏諾皂苷類化合物的體內(nèi)含量測(cè)定方法由以下步驟組成一、收集給藥前試驗(yàn)動(dòng)物的生物樣本,作為對(duì)照組;二、將偏諾皂苷類化合物給予人或試驗(yàn)動(dòng)物,劑量為0.005-100mg/kg動(dòng)物體重,再收集上述試驗(yàn)動(dòng)物的生物樣本,作為試驗(yàn)組;三、分別固相萃取或液相萃取處理步驟一、二所得樣本;四、將步驟三所得樣本逐一進(jìn)行液相色譜分離;五、緊接步驟四進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。
      本發(fā)明所述的偏諾皂苷類化合物的體內(nèi)含量測(cè)定方法由以下步驟組成一、收集給藥前試驗(yàn)動(dòng)物的生物樣本,作為對(duì)照組;二、將偏諾皂苷類化合物給予人或試驗(yàn)動(dòng)物,劑量為0.005-100mg/kg動(dòng)物體重,再收集上述試驗(yàn)動(dòng)物的生物樣本,作為試驗(yàn)組;
      三、分別固相萃取或液相萃取處理步驟一、二所得樣本;四、配制已知分子量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)0.01-0.001mg/mL的溶液,且該溶與步驟三所得樣本相混溶;五、精密稱取偏諾皂苷類化合物配成0.1-5mg/mL的溶液做為儲(chǔ)備液,再進(jìn)一步配成1-100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液;六、繪制工作曲線分別精密吸取步驟五所得標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1μL至200μL若干個(gè)梯度以及1-10μL內(nèi)標(biāo)液于試管底部,惰性氣體吹干后分別加入步驟一所得生物樣本0.1-10ml,按步驟三所述樣品處理方法與步驟二所得樣本做平行處理;以偏諾皂苷類化合物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比對(duì)生物樣本中偏諾皂苷類化合物濃度進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程;七、步驟三所得樣本分別加入含已知分子量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)0.01-0.001mg/mL的溶液1-10μL,使步驟二所得樣品中內(nèi)標(biāo)濃度在1-20ng/mL;八、將步驟七所得樣本逐一進(jìn)行液相色譜分離;九、緊接步驟八進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè);十、以偏諾皂苷類化合物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比代入工作曲線中求出偏諾皂苷類化合物的含量。
      本發(fā)明所述的偏諾皂苷(pennogenin)類化合物,結(jié)構(gòu)通式為 通式中R2=H,CH3,CH2OH,=CH2X=O,N,SC17位為R-構(gòu)型或S-構(gòu)型R1=由單糖、雙糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖所組成的各種型式的直鏈糖鏈或支鏈糖鏈,其糖鏈組成糖的類型包括β-D-葡萄糖(β-D-glucose)、α-D-葡萄糖(α-D-glucose)、α-L-鼠李糖(α-L-rhamnose)、β-D-半乳糖(β-D-galactose)、α-D-半乳糖(α-D-galactose)、β-D-甘露糖(β-D-mannose)、α-D-甘露糖(β-D-mannose)、α-D-阿拉伯糖(α-D-aradinose)、β-D-阿拉伯糖(α-D-aradinose)、α-D-木糖(α-D-xylose)、β-D-木糖(α-D-xylose)、α-D-核糖(α-D-ribose)、β-D-核糖(β-D-ribose)、α-D-來蘇糖(α-D-lyxose)、β-D-來蘇糖(β-D-lyxose)、α-L-夫糖(α-L-fucose)。
      所述的偏諾皂苷類化合物位于甾體骨架第3位的糖不可缺少,并且不限于七糖。
      包括4個(gè)活性較強(qiáng)的偏諾皂苷類化合物X=O,R2=H,[I]R1=-3-O-α-L-rha·py(1→4)-α-L-rha·py(1→4)-[α-L-rha-py(1→2)]-β-D-glc·py[II]R1=-3-O-α-L-rha·py(1→2)-[α-L-rha·py(1→4)]-β-D-glc·py[III]R1=-3-O-α-L-ara·fura-(1→4)-[α-L-rha·py(1→2)]-β-D-glc·py[IV]R1=-3-O-α-L-rha·py(1→2)-β-D-glc·py。
      所述的固相萃取方法為采用市售的固相萃取柱,其填料可為C18、C8、CN和苯基等鍵合相硅膠或大孔樹脂等吸附性材料,其裝量規(guī)格可為0.01-1克,按固相萃取柱使用說明書方法對(duì)柱子進(jìn)行活化,通??捎眉状肌⑺?mL過柱活化,然后(A)取1mL液體的生物樣本,如血漿、血清、尿、膽汁、臟器勻漿過濾液等等,上柱,(B)再用1mL甲醇洗脫1-4次,收集甲醇洗脫液,(C)于40℃水浴中用氮?dú)饬鞔蹈?,殘?jiān)?00-1000μL甲醇溶解,得到待測(cè)樣品。
      所述的液相萃取方法為(A)在生物樣本血漿、血清、尿樣、膽汁、干燥糞便、臟器勻漿中加入濃度為70%以上的含碳數(shù)在6及6以下的低級(jí)醇2-5倍于樣品體積,浸泡提取,離心得到沉淀,再用相同的醇2-5倍重量重復(fù)提取沉淀1-4次,合并醇溶液,60℃以下減壓濃縮得粗浸膏;B、加適量水使粗浸膏溶解,加氯仿10-300倍重量于粗浸膏萃取,共1-5次,各次氯仿層洗脫液用1/10體積水洗一次,合并氯仿萃取層,減壓回收溶劑,得濃縮浸膏,供檢測(cè)用。
      上述處理方法中可加入含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)0.01-0.001mg/mL的相混溶的溶液5-10μL,使待測(cè)樣品中內(nèi)標(biāo)濃度在1-20ng/mL,內(nèi)標(biāo)物質(zhì)可以為維拉帕米[MW=455.2904],溶劑為甲醇。內(nèi)標(biāo)的作用為校正分子量及含量測(cè)定參比。內(nèi)標(biāo)還可以為其它分子量已知的且大小適中的物質(zhì)。
      (1)、色譜分離條件反相色譜柱,如C18、C8、CN等硅膠鍵合相色譜柱。
      (2)、流動(dòng)相∶甲醇-水(60-95∶5-40)固定比例或梯度洗脫;流速0.2-2mL/min,柱溫10-42℃。
      (3)質(zhì)譜儀條件電噴霧離子化接口飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)器,質(zhì)譜工作站;正離子檢測(cè),噴嘴電壓5000-6000V,噴管電壓300-400V,檢測(cè)電壓1500-2500V,噴管溫度110-170℃,采樣范圍(m/z)10-1000;離子選擇通道為[M+Na]+、[M+K]+,M表示偏諾皂苷類化合物,[M+Na]+為主峰,離子通道范圍可為±0.5amu。
      本發(fā)明所述的方法對(duì)人體無害,可以應(yīng)用于人體和各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
      本發(fā)明可以用于偏諾皂苷類化合物各種劑型的生物利用度的測(cè)定。
      本發(fā)明可以用于偏諾皂苷類化合物體內(nèi)代謝時(shí)間測(cè)定。
      本方法的檢測(cè)限可以達(dá)到0.2ng/mL,線性范圍2-3個(gè)數(shù)量級(jí),相關(guān)系數(shù)r在0.99以上,日內(nèi)及日間精密度小于15%,絕對(duì)回收率在80%以上,相對(duì)回收率92%-115%。
      本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)靈敏度高,樣本處理過程即是一濃縮過程,其檢測(cè)器為質(zhì)譜檢測(cè)器,遠(yuǎn)高于一般液相和氣相的紫外檢測(cè)器,檢測(cè)限可以達(dá)到0.2ng/mL;(2)選擇性好,抗干擾性強(qiáng),生物樣本由于有各種有機(jī)雜質(zhì),極難分離,采用質(zhì)譜選擇性離子檢測(cè)方式,以[M+Na]+和[M+K]+兩個(gè)峰為離子選擇通道,有效排除干擾;(3)樣品處理簡(jiǎn)單;(4)檢測(cè)時(shí)間短,僅為十幾分鐘,適用于大批量檢測(cè);(5)對(duì)人體無害,放射法由于引入放射性元素,雖然靈敏度很高,用于人體卻受到限制。本發(fā)明方法尤其適合做偏諾皂苷類化合物各種劑型的生物利用度測(cè)定。
      具體實(shí)施例方式
      1、偏諾皂苷類化合物生物利用度的測(cè)定從志愿者身上取血將,測(cè)定血漿中偏諾皂苷化合物IV的含量,計(jì)算藥-時(shí)曲線下面積AUC,與等量偏諾皂苷肌注產(chǎn)生的藥-時(shí)曲線下面積AUC相比,計(jì)算相對(duì)生物利用度(%)。未處理過的偏諾皂苷、偏諾皂苷各種制劑的生物利用度的比較液相色譜條件Waters 2690 HPLC(美國(guó)Waters公司),含四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱,碳-18反相色譜柱KromasilC18(5μm,4.6×250mm)。流動(dòng)相∶甲醇-水(80∶20)、(90∶10)、(85∶15)梯度洗脫;流速0.8mL/min,柱溫30℃。二極管陣列檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)203nm。
      質(zhì)譜儀條件MarinerTM5410質(zhì)譜儀(美國(guó)Applied Biosystem公司),電噴霧離子化接口飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)器,質(zhì)譜工作站MarinerTM工作站4.0版。質(zhì)譜儀參數(shù)正離子檢測(cè),噴嘴電壓5500V,噴管電壓340V,檢測(cè)電壓2200V,噴管溫度140℃,采樣范圍(m/z)10-1000。
      離子選擇通道為[M+Na]+、[M+K]+,M表示偏諾皂苷類化合物,[M+Na]+為主峰,離子通道范圍可為±0.5amu,即761.4,777.4。
      內(nèi)標(biāo)取適量維拉帕米用甲醇溶解并稀釋至0.2mg/mL作為儲(chǔ)備液,用前再稀釋至0.01mg/mL。
      標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)精密稱取偏諾皂苷類化合物IV配成1mg/mL的甲醇溶液做為儲(chǔ)備液,再進(jìn)一步配成10ng/mL。
      工作曲線分別精密吸取上述10ng/mL標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.3μL、0.5μL、1μL、2μL、5μL、10μL、20μL、50μL、100μL以及5μL內(nèi)標(biāo)液于具塞尖底試管中,氮?dú)獯蹈珊蟾骷尤肷飿颖狙獫{1.0ml,按上文所述樣品處理方法采用固相萃取法處理;以偏諾皂苷類化合物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比對(duì)生物樣本中偏諾皂苷類化合物濃度進(jìn)行線性回歸。
      精密度和回收率分別取0.3μL、1μL、5μL、20μL及5μL內(nèi)標(biāo)液于具塞尖底試管中,氮?dú)獯蹈珊蟾骷尤肷飿颖狙獫{1.0ml,按上文所述樣品處理方法采用固相萃取法處理;各濃度日內(nèi)重復(fù)處理測(cè)定6次得日內(nèi)精密度,連續(xù)處理測(cè)定三天得日間精密度。將偏諾皂苷類化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比代入線性回歸方程,計(jì)算相對(duì)回收率。另將偏諾皂苷類化合物標(biāo)準(zhǔn)品配成相應(yīng)濃度的甲醇溶液,直接進(jìn)樣,以此為標(biāo)準(zhǔn),將兩組峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比進(jìn)行比較,計(jì)算絕對(duì)回收率。
      結(jié)果本方法檢測(cè)速度快,只需15分鐘就可完成一次檢測(cè)。
      表1偏諾皂苷類化合物生物利用度的測(cè)定

      同法也可測(cè)量其它制劑在人或動(dòng)物身上的生物利用度。
      實(shí)施例2偏諾皂苷類化合物代謝時(shí)間研究口服給藥后,每四小時(shí)取血漿一次,固相萃取法萃取,LC-MS法分析。結(jié)果如下

      給藥后第4、8小時(shí)可明顯檢出偏諾皂苷化合物IV[M+Na]+質(zhì)譜峰(m/z761.4),給藥后第24小時(shí),原形藥濃度極低,已接近檢測(cè)下限,再次富集一倍后才能檢出質(zhì)譜峰。血漿中再次富集后也未能檢出PS-M1與PS-M2代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜峰。
      結(jié)果顯示,偏諾皂苷化合物達(dá)峰時(shí)間長(zhǎng),一般藥物給藥后1-2小時(shí)即達(dá)峰值,偏諾皂苷化合物需要8小時(shí)左右,說明其生物吸收不佳,生物利用度低;而且半衰期較短,達(dá)峰后當(dāng)日即已基本排泄完畢。
      權(quán)利要求
      1.一種偏諾皂苷類化合物的體內(nèi)含量測(cè)定方法,其特征在于由以下步驟組成一、收集給藥前試驗(yàn)動(dòng)物的生物樣本,作為對(duì)照組;二、將偏諾皂苷類化合物給予人或試驗(yàn)動(dòng)物,劑量為0.005-100mg/kg動(dòng)物體重,再收集上述試驗(yàn)動(dòng)物的生物樣本,作為試驗(yàn)組;三、分別固相萃取或液相萃取處理步驟一、二所得樣本;四、將步驟三所得樣本逐一進(jìn)行液相色譜分離;五、緊接步驟四進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。
      2.一種偏諾皂苷類化合物的體內(nèi)含量測(cè)定方法,其特征在于由以下步驟組成一、收集給藥前試驗(yàn)動(dòng)物的生物樣本,作為對(duì)照組;二、將偏諾皂苷類化合物給予人或試驗(yàn)動(dòng)物,劑量為0.005-100mg/kg動(dòng)物體重,再收集上述試驗(yàn)動(dòng)物的生物樣本,作為試驗(yàn)組;三、分別固相萃取或液相萃取處理步驟一、二所得樣本;四、配制已知分子量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)0.01-0.001mg/mL的溶液,且該溶與步驟三所得樣本相混溶;五、精密稱取偏諾皂苷類化合物配成0.1-5mg/mL的溶液做為儲(chǔ)備液,再進(jìn)一步配成1-100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液;六、繪制工作曲線分別精密吸取步驟五所得標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1μL至200μL若干個(gè)梯度以及1-10μL內(nèi)標(biāo)液于試管底部,惰性氣體吹干后分別加入步驟一所得生物樣本0.1-10ml,按步驟三所述樣品處理方法與步驟二所得樣本做平行處理;以偏諾皂苷類化合物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比對(duì)生物樣本中偏諾皂苷類化合物濃度進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程;七、步驟三所得樣本分別加入含已知分子量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)0.01-0.001mg/mL的溶液1-10μL,使步驟二所得樣品中內(nèi)標(biāo)濃度在1-20ng/mL;八、將步驟七所得樣本逐一進(jìn)行液相色譜分離;九、緊接步驟八進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè);十、以偏諾皂苷類化合物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比代入工作曲線中求出偏諾皂苷類化合物的含量。
      3.按照權(quán)利要求1、2所述的偏諾皂苷類化合物的體內(nèi)含量測(cè)定方法,其特征在于所述的偏諾皂苷類化合物結(jié)構(gòu)通式為 通式中R2=H,CH3,CH2OH,=CH2X=O,N,SC17位為R-構(gòu)型或S-構(gòu)型R1=由單糖、雙糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖所組成的各種型式的直鏈糖鏈或支鏈糖鏈,其糖鏈組成糖的類型包括β-D-葡萄糖(β-D-glucose)、α-D-葡萄糖(α-D-glucose)、α-L-鼠李糖(α-L-rhamnose)、β-D-半乳糖(β-D-galactose)、α-D-半乳糖(α-D-galactose)、β-D-甘露糖(β-D-mannose)、α-D-甘露糖(β-D-mannose)、α-D-阿拉伯糖(α-D-aradinose)、β-D-阿拉伯糖(α-D-aradinose)、α-D-木糖(α-D-xylose)、β-D-木糖(α-D-xylose)、α-D-核糖(α-D-ribose)、β-D-核糖(β-D-ribose)、α-D-來蘇糖(α-D-lyxose)、β-D-來蘇糖(β-D-lyxose)、α-L-夫糖(α-L-fucose)。
      4.按照權(quán)利要求3所述的偏諾皂苷類化合物,其特征在于所述的通式中X=O,R2=H,R1=-3-O-α-L-rha·py(1→4)-α-L-rha·py(1→4)-[α-L-rha-py(1→2)]-β-D-glc·py。
      5.按照權(quán)利要求3所述的偏諾皂苷類化合物,其特征在于所述的通式中X=O,R2=H,R1=-3-O-α-L-rha·py(1→2)-[α-L-rha·py(1→4)]-β-D-glc·py。
      6.按照權(quán)利要求3所述的偏諾皂苷類化合物,其特征在于所述的通式中X=O,R2=H,R1=-3-O-α-L-ara·fura-(1→4)-[α-L-rha·py(1→2)]-β-D-glc·py。
      7.按照權(quán)利要求3所述的偏諾皂苷類化合物,其特征在于所述的通式中X=O,R2=H,R1=-3-O-α-L-rha·py(1→2)-β-D-glc·py。
      8.按照權(quán)利要求1、2所述的偏諾皂苷類化合物的體內(nèi)含量測(cè)定方法,其特征在于所述的固相萃取中所用的萃取材料其填料為C18、C8、CN和苯基等鍵合相硅膠或大孔樹脂等吸附性材料,其裝量規(guī)格為0.01-10克。
      9.按照權(quán)利要求1、2所述的偏諾皂苷類化合物的體內(nèi)含量測(cè)定方法,其特征在于所述的固相萃取步驟為固相萃取柱活化后(A)取1mL液體的生物樣本上柱,(B)再用1mL甲醇洗脫1-4次,收集甲醇洗脫液,(C)于40℃水溶中用氮?dú)饬鞔蹈?,殘?jiān)?00-1000μL甲醇溶解。
      10.按照權(quán)利要求1、2所述的偏諾皂苷類化合物的體內(nèi)含量測(cè)定方法,其特征在于所述的液相萃取步驟為A在生物樣本中加入濃度為70%以上的含碳數(shù)在6及6以下的低級(jí)醇2-5倍于樣品體積,浸泡提取,離心得到沉淀,再用相同的醇2-5倍重量重復(fù)提取沉淀1-4次,合并醇溶液,60℃以下減壓濃縮得粗浸膏;B、加適量水使粗浸膏溶解,加氯仿10-300倍重量于粗浸膏萃取,共1-5次,各次氯仿層洗脫液用1/10體積水洗一次,合并氯仿萃取層,減壓回收溶劑,得濃縮浸膏。
      11.按照權(quán)利要求1、2所述的偏諾皂苷類化合物的體內(nèi)含量測(cè)定方法,其特征在于所述的色譜分離過程中使用反相色譜柱。
      12.按照權(quán)利要求1、2所述的偏諾皂苷類化合物的體內(nèi)含量測(cè)定方法,其特征在于所述的色譜分離過程中使用的流動(dòng)相是甲醇-水(60-95∶5-40)按固定比例或梯度洗脫。
      13.按照權(quán)利要求1、2所述的偏諾皂苷類化合物的體內(nèi)含量測(cè)定方法,其特征在于所述的質(zhì)譜檢測(cè)過程中離子選擇通道為[M+Na]+、[M+K]+,M為偏諾皂苷類化合物,離子通道范圍為±0.5amu。
      14.權(quán)利要求1、2所述含量測(cè)定方法可以用于偏諾皂苷類化合物各種劑型的生物利用度的測(cè)定。
      15.權(quán)利要求1、2所述含量測(cè)定方法可以用于偏諾皂苷類化合物體內(nèi)代謝時(shí)間測(cè)定。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及一種化合物的體內(nèi)含量測(cè)定方法,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述的偏諾皂苷類化合物的體內(nèi)含量測(cè)定方法由以下步驟組成1.收集給藥前試驗(yàn)動(dòng)物的生物樣本,作為對(duì)照組;2.將偏諾皂苷類化合物給予人或試驗(yàn)動(dòng)物,劑量為0.005-100mg/kg動(dòng)物體重,再收集上述試驗(yàn)動(dòng)物的生物樣本,作為試驗(yàn)組;3.分別固相萃取或液相萃取處理步驟一、二所得樣本;4.將步驟三所得樣本逐一進(jìn)行液相色譜分離;5.緊接步驟四進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。本發(fā)明可以用于偏諾皂苷類化合物各種劑型的生物利用度的測(cè)定。本發(fā)明可以用于偏諾皂苷類化合物體內(nèi)代謝時(shí)間測(cè)定。
      文檔編號(hào)G01N30/06GK1940551SQ20051001104
      公開日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
      發(fā)明者唐書明, 馮有, 高崇昆 申請(qǐng)人:云南白藥集團(tuán)股份有限公司
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