專(zhuān)利名稱(chēng)：評(píng)價(jià)培養(yǎng)基分離回收微生物類(lèi)群能力的快速檢測(cè)方法
專(zhuān)利說(shuō)明評(píng)價(jià)培養(yǎng)基分離回收微生物類(lèi)群能力的快速檢測(cè)方法 本發(fā)明涉及一種利用聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DENATURINGGRADIENT GEL ELECTROPHORESIS其縮寫(xiě)為PCR-DGGE)評(píng)價(jià)不同培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件回收分離微生物類(lèi)群能力的快速檢測(cè)方法。自然環(huán)境中微生物資源極為豐富，然而到目前為止，可以人工培養(yǎng)的微生物極為有限，不到總量的1％。由于培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法的不足，許多在環(huán)境中占優(yōu)勢(shì)的菌至今為止還未在實(shí)驗(yàn)室里被分離出來(lái)，或分離出來(lái)的根本不是環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌。因此評(píng)價(jià)不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件回收分離微生物類(lèi)群的能力極為重要。
在評(píng)價(jià)培養(yǎng)基回收分離微生物類(lèi)群能力的效果時(shí)，分離到的微生物類(lèi)群是否與環(huán)境樣品中的微生物類(lèi)群一致是一個(gè)核心問(wèn)題。以往對(duì)于不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件回收分離微生物類(lèi)群能力的評(píng)價(jià)方法是建立在傳統(tǒng)的平板菌落計(jì)數(shù)和形態(tài)觀察技術(shù)上的。但因?yàn)槲⑸锞湫螒B(tài)比較簡(jiǎn)單，有些比較相似，僅憑顯微鏡無(wú)法判斷準(zhǔn)確，容易產(chǎn)生誤判，故單憑形態(tài)學(xué)分析進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)是不準(zhǔn)確的。而依據(jù)生理生化特征對(duì)培養(yǎng)的微生物進(jìn)行分類(lèi)鑒定，由于工作量大，耗時(shí)，也幾乎是不可能的。因此傳統(tǒng)的評(píng)價(jià)培養(yǎng)基分離回收微生物類(lèi)群能力的方法存在很大的弊端。
本發(fā)明的目的在于通過(guò)利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)不同培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件分離回收微生物類(lèi)群能力進(jìn)行快速檢測(cè)。
本發(fā)明的快速檢測(cè)方法包括以下步驟(1)選擇用于實(shí)驗(yàn)的樣品；(2)分離和純化樣品中的微生物將樣品制備成10-1～10-5不同的稀釋度，分別在不同培養(yǎng)基上涂平板，適溫下或不同條件下培養(yǎng)；(3)提取和純化樣品中所有微生物的基因組DNA稱(chēng)取10.0g樣品，放入盛有10粒無(wú)菌玻璃珠(直徑3mm～5mm)的三角瓶中，加15mL提取緩沖液(100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA-Na2，200mmol/L NaCl，1％PVP，2％CTAB，pH 8.0)；在180r/min，37℃條件下振蕩30min，然后加入2mL20％SDS繼續(xù)振蕩10min；65℃水浴1h后6000r/min離心15min，收集上清液，加入0.5倍體積PEG-NaCl溶液(其中含30％PEG和1.6mol/L NaCl)，混勻后室溫下靜置2h，10000r/min離心20min，沉淀用2mL TE重新懸浮；加4mol/L NaAC(pH5.4)至終濃度0.3mol/L，用酚/氯仿/異戊醇溶液(25∶24∶1)抽提一次，加入0.6倍體積異丙醇沉淀2h，12000r/min離心20min，沉淀干燥后，用200μl TE溶解，再用Wizard@DNA clean-up system(Promega)純化后，置于-20℃保存，待用；(4)提取不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下的平板回收菌總DNA分別用10ml無(wú)菌水洗滌平板，收集菌體，然后提取菌體總DNA；(5)所有樣品的16SrDNA V3區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增取10倍緩沖液5μl，dNTP(10mM)1μl，F(xiàn)341-357(GC)(10μM)1μl，R534-518(10μM)1μl，Taq(5U/μl)0.4μl，模板DNA 2μl，補(bǔ)足ddH2O至50μl；反應(yīng)程序?yàn)?4℃5min預(yù)變性；94℃1min，60℃30s，72℃2min，10個(gè)循環(huán)；94℃30S，60～55℃30s(-0.5℃/循環(huán))，72℃2min，10個(gè)循環(huán)；94℃30S，55℃30s，72℃2min，15個(gè)循環(huán)；72℃7min；擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5％瓊脂糖分析檢驗(yàn)；(6)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(DGGE)電泳PCR產(chǎn)物濃縮后，采用D-Code突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)樣品進(jìn)行DGGE分析；所用的聚丙烯酰胺凝膠濃度為8％，變性梯度為35％～60％(100％的變性劑為7mol/L尿素，40％甲酰胺)，180V，60℃恒溫，0.5×TAE中電泳4.0h，GoldView染料染色30min，UVI成像系統(tǒng)拍照；用UVIBand分析軟件幫助確定樣品電泳條帶的多少和條帶的亮度峰值；(7)DGGE譜帶相似性系數(shù)(Cs)分析用Sorenson配對(duì)比較不同樣品的DGGE指紋圖譜的相似性；Cs＝2j/(a+b)，其中a、b表示兩個(gè)比較對(duì)象中的DNA條帶數(shù)目，j表示a和b中相同的條帶數(shù)量；(8)評(píng)價(jià)方法根據(jù)DGGE電泳圖譜及譜帶相似性系數(shù)(Cs)分析，綜合評(píng)價(jià)不同培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件回收分離微生物類(lèi)群能力；DGGE電泳圖譜中一般每個(gè)條帶可以看作是一個(gè)微生物類(lèi)群，條帶的強(qiáng)度可以反映這個(gè)類(lèi)群的數(shù)量的多寡，電泳條帶越多，譜帶相似性系數(shù)(Cs)越高，說(shuō)明該種培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件回收分離樣品中的微生物類(lèi)群的能力較好；利用本發(fā)明的快速檢測(cè)方法，可以直觀的篩選出能更好的分離回收樣品中的微生物類(lèi)群的培養(yǎng)基，與傳統(tǒng)的用形態(tài)和生理生化特征鑒定的方法相比，具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，是傳統(tǒng)技術(shù)不可比擬的，為開(kāi)發(fā)新的培養(yǎng)基和培養(yǎng)技術(shù)提供了一種分子水平的評(píng)價(jià)方法，此外該檢測(cè)方法還可以用于快速分析環(huán)境微生物種群多樣性和群落動(dòng)態(tài)的變化。番茄土壤樣品在4種不同培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)肉湯，YG，土壤浸汁液，根系分泌物)和不同培養(yǎng)條件下的DGGE指紋圖譜比較。其中L1-L4為營(yíng)養(yǎng)肉湯，YG，土壤浸汁液，根系分泌物等4種培養(yǎng)基在28℃培養(yǎng)2天的DGGE圖譜；L6-L9為營(yíng)養(yǎng)肉湯，YG，土壤浸汁液，根系分泌物等4種培養(yǎng)基在20℃培養(yǎng)12天后的DGGE圖譜。L5為番茄根際土壤的DGGE圖譜。從DGGE電泳結(jié)果可以看出，不同樣品的電泳圖譜有很大的區(qū)別4種培養(yǎng)基在28℃培養(yǎng)12天的DGGE指紋圖譜比較接近，回收到的細(xì)菌菌群較相似；而在20℃培養(yǎng)的DGGE指紋圖譜中各樣品的條帶數(shù)均多，于28℃培養(yǎng)的樣品所分離到的類(lèi)群較多，更接近于根際土壤中的細(xì)菌類(lèi)群。實(shí)施例1一種評(píng)價(jià)培養(yǎng)基分離回收微生物類(lèi)群能力的快速檢測(cè)試劑盒包括10倍緩沖液，dNTP(10mM)，F(xiàn)341-357(GC)(10μM)，R534-518(10μM)，Taq(5U/μl)及ddH2O。
該檢測(cè)試劑盒用于評(píng)價(jià)不同培養(yǎng)基分離回收微生物類(lèi)群能力的方法(1)選擇用于實(shí)驗(yàn)的環(huán)境樣品土壤采自廣東省農(nóng)科院大豐試驗(yàn)基地，在番茄結(jié)果期，按五點(diǎn)取樣法選取番茄植株，將其根系連同土壤挖出，自然風(fēng)干，研磨過(guò)1mm篩；(2)分離和純化環(huán)境樣品中的細(xì)菌采用營(yíng)養(yǎng)肉湯，YG(酵母葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)、根系分泌物、土壤浸漬液4種培養(yǎng)基；將土樣充分振蕩，制備10-1～10-5不同稀釋度的樣品，分別在4種培養(yǎng)基上涂平板，置于兩種不同溫度下培養(yǎng)；28℃培養(yǎng)2天，20℃培養(yǎng)12天；(3)提取和純化環(huán)境樣品中所有微生物的基因組DNA稱(chēng)取10.0g土樣，放入盛有10粒無(wú)菌玻璃珠(直徑3mm～5mm)的三角瓶中，加15mL提取緩沖液(100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA-Na2，200mmol/L NaCl，1％PVP，2％CTAB，pH 8.0)。在180r/min，37℃條件下振蕩30min，然后加入2mL 20％SDS繼續(xù)振蕩10min；65℃水浴1h后6000r/min離心15min，收集上清液，加入0.5倍體積PEG-NaCl溶液(其中含30％PEG和1.6mol/L NaCl)，混勻后室溫下靜置2h，10000r/min離心20min，沉淀用2mL TE重新懸浮；加4mol/L NaAC(pH5.4)至終濃度0.3mol/L，用酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，加0.6倍體積異丙醇沉淀2h，12000r/min離心20min，沉淀干燥后，用200μlTE溶解，再用Wizard@DNA clean-up system(Promega)純化后，置于-20℃保存，待用；(4)提取平板回收菌總DNA分別用10ml無(wú)菌水洗滌平板，收集菌體；采用CTAB法提取菌體總DNA；(5)所有樣品的16SrDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為10倍緩沖液5μl，dNTP(10mM)1μl，引物F341-357(GC)(10μM)和R534-518(10μM)各1μl，Taq(5U/μl)0.4μl，模板DNA 2μl，補(bǔ)足ddH2O至50μl；反應(yīng)程序?yàn)?4℃5min預(yù)變性；94℃1min，60℃30s，72℃2min，10個(gè)循環(huán)；94℃30S，60～55℃30s(-0.5℃/循環(huán))，72℃2min，10個(gè)循環(huán)；94℃30S，55℃30s，72℃2min，15個(gè)循環(huán)；72℃7min；擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5％瓊脂糖分析檢驗(yàn)；(6)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(DGGE)電泳PCR產(chǎn)物濃縮后，采用D-Code突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)樣品進(jìn)行DGGE分析；所用的聚丙烯酰胺凝膠濃度為8％，變性梯度為35％～60％(100％的變性劑為7mol/L尿素，40％甲酰胺)，180V，60℃恒溫，0.5×TAE中電泳4.0h，GoldView染料染色30min，UVI成像系統(tǒng)拍照；用UVIBand分析軟件幫助確定樣品電泳條帶的多少和條帶的亮度峰值；DGGE譜帶相似性系數(shù)(Cs)用Sorenson配對(duì)比較相似性系數(shù)(Cs)比較不同樣品DGGE指紋圖譜的相似性；Cs＝2j/(a+b)，其中a、b表示兩個(gè)比較對(duì)象中的DNA條帶數(shù)目，j表示a和b中相同的條帶數(shù)量。結(jié)果(見(jiàn)表1)顯示番茄根際樣品與在28℃培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)肉湯、YG、土壤浸漬液、根系分泌物培養(yǎng)基相似指數(shù)較低，Cs值分別為0.21、0.10、0.20、0.11，與在20℃培養(yǎng)的4種培養(yǎng)基相似指數(shù)分別為0.34、0.43、0.36、0.44。可見(jiàn)在20℃培養(yǎng)下根系分泌物和YG培養(yǎng)基能更多的分離出番茄根際的細(xì)菌類(lèi)群，優(yōu)于其它的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
表1不同樣品的Cs值Table 1 Cs values of different samples
L1-L4營(yíng)養(yǎng)肉湯，YG，土壤浸汁液，根系分泌物；28℃培養(yǎng)。
L6-L9營(yíng)養(yǎng)肉湯，YG，土壤浸汁液，根系分泌物；20℃培養(yǎng)。
L5根際土壤將DGGE電泳圖譜及譜帶相似性系數(shù)(Cs)綜合起來(lái)分析評(píng)價(jià)4種不同培養(yǎng)基回收分離微生物類(lèi)群能力的大小YG培養(yǎng)基在較低的培養(yǎng)溫度20℃下進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，比營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基產(chǎn)生更多、更具代表性的細(xì)菌；而以根系分泌物為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基從番茄根際回收到的細(xì)菌菌群最多。
權(quán)利要求
1.一種評(píng)價(jià)培養(yǎng)基分離回收微生物類(lèi)群能力的快速檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)選擇用于實(shí)驗(yàn)的樣品；(2)分離和純化環(huán)境樣品中的微生物將樣品制備成10-1～10-5不同的稀釋度，分別在不同培養(yǎng)基上涂平板，適溫下或不同條件下培養(yǎng)；(3)提取和純化環(huán)境樣品中所有微生物的基因組DNA稱(chēng)取10.0g樣品，放入盛有10粒無(wú)菌玻璃珠(直徑3mm～5mm)的三角瓶中，加15mL提取緩沖液(100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA-Na2，200mmol/L NaCl，1％PVP，2％CTAB，pH8.0)；在180r/min，37℃條件下振蕩30min，然后加入2mL 20％SDS繼續(xù)振蕩10min；65℃水浴1h后6000r/min離心15min，收集上清液，加入0.5倍體積PEG-NaCl溶液(其中含30％PEG和1.6mol/L NaCl)，混勻后室溫下靜置2h，10000r/min離心20min，沉淀用2mL TE重新懸??；加4mol/L NaAC(pH5.4)至終濃度0.3mol/L，用酚/氯仿/異戊醇溶液(25∶24∶1)抽提一次，加入0.6倍體積異丙醇沉淀2h，12000r/min離心20min，沉淀干燥后，用200μl TE溶解，再用Wizard@DNA clean-up system(Promega)純化后，置于-20℃保存，待用；(4)提取不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下的平板回收菌總DNA分別用10ml無(wú)菌水洗滌平板，收集菌體；然后提取菌體總DNA；(5)所有樣品的16SrDNA V3區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增取10倍緩沖液5μl，dNTP(10mM)1μl，F(xiàn)341-357(GC)(10μM)1μl，R534-518(10μM)1μl，Taq(5U/μl)0.4μl，模板DNA 2μl，補(bǔ)足ddH2O至50μl。反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5min預(yù)變性；94℃ 1min，60℃ 30s，72℃ 2min，10個(gè)循環(huán)；94℃ 30S，60～55℃ 30s(-0.5℃/循環(huán))，72℃ 2min，10個(gè)循環(huán)；94℃ 30S，55℃ 30s，72℃ 2min，15個(gè)循環(huán)；72℃ 7min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5％瓊脂糖分析檢驗(yàn)；(6)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳聚丙烯酰胺凝膠濃度為8％，變性梯度為35％～60％(100％的變性劑為7mol/L尿素，40％甲酰胺)，180V，60℃恒溫，0.5×TAE中電泳4.0h，GoldView染料染色30min，UVI成像系統(tǒng)拍照；用UVIBand分析軟件幫助確定樣品電泳條帶的多少和條帶的亮度峰值；(7)DGGE譜帶相似性系數(shù)(Cs)分析用Sorenson配對(duì)比較不同樣品的DGGE指紋圖譜的相似性；Cs＝2j/(a+b)，其中a、b表示兩個(gè)比較對(duì)象中的DNA條帶數(shù)目，j表示a和b中相同的條帶數(shù)量。
2.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，可用于快速評(píng)價(jià)不同培養(yǎng)基對(duì)各種環(huán)境中微生物類(lèi)群的回收分離能力。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用聚合酶鏈反應(yīng)－變性梯度凝膠電泳(PCR－DGGE)，根據(jù)DGGE電泳圖譜及譜帶相似性系數(shù)(Cs)分析，綜合評(píng)價(jià)不同培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件回收分離微生物類(lèi)群能力。本發(fā)明可以直觀的篩選出能更好的分離回收樣品中的微生物類(lèi)群的培養(yǎng)基，與傳統(tǒng)的用形態(tài)和生理生化特征鑒定的方法相比，具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，該檢測(cè)方法還可以用于快速分析環(huán)境微生物種群多樣性和群落動(dòng)態(tài)的變化。
文檔編號(hào)G01N1/28GK1873404SQ20051003726
公開(kāi)日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2005年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月16日
發(fā)明者朱紅惠, 孫曉棠, 姚青, 龍良鯤 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所