專利名稱：赤潮毒素腹瀉性貝毒的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用抗腹瀉性貝毒的單克隆抗體與腹瀉性貝毒抗原結(jié)合，而分析檢測(cè)環(huán)境樣品中的腹瀉性貝毒含量的快速方便檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
目前腹瀉性貝毒的分析方法有生物小鼠法、高效液相色譜法和免疫化學(xué)方法。生物小鼠法是將藻或貝等生物組織的萃取液注射進(jìn)小鼠腹腔內(nèi)，根據(jù)小鼠死亡時(shí)間，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)表，查得腹瀉性貝毒的含量，該方法誤差大、重現(xiàn)性差、費(fèi)時(shí)麻煩；高效液相色譜法是將藻或貝等生物組織的萃取液經(jīng)前處理，衍生反應(yīng)后，進(jìn)行液相色譜分離，結(jié)合熒光檢測(cè)器或直接經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)器，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品的值對(duì)照，計(jì)算得出腹瀉性貝毒的含量，該方法準(zhǔn)確、成熟，并能分析鑒定不同的異構(gòu)體，但缺點(diǎn)是前處理麻煩，儀器昂貴，需要專門的分析技術(shù)人員，不適合現(xiàn)場(chǎng)及大批量樣品的分析；免疫化學(xué)方法是通過(guò)免疫動(dòng)物制得特異性抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)，利用抗體對(duì)腹瀉性貝毒的結(jié)合反應(yīng)，按照酶聯(lián)免疫分析方法制成檢測(cè)試劑盒，用于腹瀉性貝毒的分析檢測(cè)，該方法簡(jiǎn)便、快速，可同時(shí)分析大批量樣品，國(guó)外有售成品試劑盒，但價(jià)格昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決腹瀉性貝毒的現(xiàn)場(chǎng)、快速、大批量樣品的分析問(wèn)題，本技術(shù)發(fā)明提供一種國(guó)產(chǎn)、利用抗腹瀉性貝毒的單克隆抗體研制的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析腹瀉性貝毒的試劑盒，價(jià)格比同類進(jìn)口試劑盒便宜5-10倍，適于現(xiàn)場(chǎng)、快速、大批量樣品的檢測(cè)。
本技術(shù)發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是用水溶性碳二亞胺方法，將腹瀉性貝毒的主要成分軟海綿酸(OA)偶聯(lián)到血藍(lán)蛋白(KLH)上，加佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選穩(wěn)定分泌抗軟海綿酸單克隆抗體(MAb-OA)的細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)，小鼠體內(nèi)誘生腹水，蛋白G柱純化，制得抗軟海綿酸的單克隆抗體，用合成的軟海綿酸-卵清蛋白(OA-OVA)包被96孔酶標(biāo)板，加入OA標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，再加入Mab-OA，包被抗原OA與自由的OA競(jìng)爭(zhēng)抗體Mab-OA，自由的OA和抗體復(fù)合物被洗去，與包被抗原OA結(jié)合的抗體Mab-OA再與酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，經(jīng)底物顯色，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光值(OD)，OD值越大，樣品中自由的OA含量越少，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品回歸的方程，計(jì)算樣品OA的含量。
本技術(shù)發(fā)明的有益效果是利用得到的陽(yáng)性細(xì)胞可大量制得抗軟海綿酸的單克隆抗體，所研制的試劑盒成本低廉、價(jià)格便宜，該試劑盒的靈敏度可達(dá)0.1ng/mL。
具體實(shí)施例方式
以過(guò)量的碳二亞胺和OA與KLH反應(yīng)的方法，制得高分子比的OA-KLH偶聯(lián)物，多次免疫，得到免疫良好的脾細(xì)胞，融合后，應(yīng)盡早檢測(cè)，篩選分泌抗體能力強(qiáng)的細(xì)胞株以得到優(yōu)良的抗體，選擇合適的包被比例(1∶1000)和抗體稀釋度(1∶20000)，以得到最佳的檢測(cè)靈敏度(0.1ng/mL)。
權(quán)利要求
一種快速簡(jiǎn)易分析檢測(cè)赤潮毒素腹瀉性貝毒的試劑盒，在包裝盒內(nèi)有已包被檢測(cè)抗原的可拆96孔酶標(biāo)板、濃縮洗液、特異性檢測(cè)抗體、酶標(biāo)二抗、腹瀉性貝毒標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋液、顯色劑、終止液，其特征是按說(shuō)明書制得的待分析樣品和系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品分別加在不同孔中與檢測(cè)抗體反應(yīng)，經(jīng)孵育、洗滌，順序與酶標(biāo)二抗、顯色液和終止液反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)得各孔的吸光值，將標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值回歸分析得到方程，計(jì)算得出樣品中的毒素含量。
全文摘要
一種能夠快速靈敏檢測(cè)環(huán)境樣品中的赤潮毒素腹瀉性貝毒的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。它是利用合成的高分子比的抗原OA－KLH，經(jīng)多次免疫BLAB/c鼠，通過(guò)細(xì)胞融合，篩選、誘生腹水和蛋白柱提純得到特異性的抗軟海綿酸(腹瀉性貝毒的主要成分)的單克隆抗體，選擇1∶1000的包被比例和1∶20000的抗體稀釋度，研制出間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析赤潮毒素腹瀉性貝毒軟海綿酸的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒成本低廉、價(jià)格便宜，操作簡(jiǎn)便快速，適合大批量樣品的分析，靈敏度可達(dá)0.1ng/ml。
文檔編號(hào)G01N33/531GK1892225SQ200510081659
公開日2007年1月10日 申請(qǐng)日期2005年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月6日
發(fā)明者劉仁沿, 許道艷, 梁玉波 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心