專利名稱：一種細(xì)胞生物技術(shù)、試劑盒及制備裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的細(xì)胞生物技術(shù)、試劑盒及制備裝置。該技術(shù)靈敏快速、信息量大，制備方法簡便、成本低，能同時(shí)分析基因、蛋白和抗原等生物分子在多種不同組織細(xì)胞或細(xì)胞樣品中的分布和表達(dá)調(diào)控；也可以用于樣品中多種不同的化學(xué)物質(zhì)、生物分子、微生物或細(xì)胞等成分的高通量并行檢測分析，可廣泛地用于生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、動植物學(xué)、農(nóng)牧業(yè)、食品與衛(wèi)生、能源與化工、環(huán)境監(jiān)測以及醫(yī)學(xué)診斷與檢測等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細(xì)胞和細(xì)胞系是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域最常用的活體實(shí)驗(yàn)材料，常被用于基因、蛋白等生物分子的組織分布、細(xì)胞定位和表達(dá)調(diào)控以及藥物篩選等。大部分情況下需要在同時(shí)進(jìn)行多個(gè)不同組織來源的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以便對特點(diǎn)基因或蛋白在多種不同組織細(xì)胞中的表達(dá)與否、表達(dá)量和調(diào)控機(jī)制等做出平行的定性、定量、定位等檢測分析。在此情況下，傳統(tǒng)的細(xì)胞鋪片試驗(yàn)所存在的問題是對超過2種或以上的不同組織細(xì)胞，由于難以區(qū)分，很難同時(shí)進(jìn)行。也就是說，用傳統(tǒng)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，在一個(gè)試驗(yàn)中所要分析的組織細(xì)胞的數(shù)量和種類受到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的限制或制約。采用細(xì)胞點(diǎn)陣的方法，將不同組織或物種來源的細(xì)胞，呈點(diǎn)狀有序地排列在同一張載玻片上，則可以解決上述的問題。
在單克隆抗體的制備中，抗原表位的確定與抗原設(shè)計(jì)是制備單克隆抗體成功與否的基礎(chǔ)?？贵w識別的抗原表位分為一級結(jié)構(gòu)表位和構(gòu)象表位2種形式，一級結(jié)構(gòu)表位由連續(xù)的氨基酸序列組成，構(gòu)象表位則是由不連續(xù)的氨基酸序列或翻譯后修飾基團(tuán)所形成的具有一定結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象組成。由于構(gòu)象表位具有更高的分子特異性，因此在免疫組化、免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)等研究中，需要用抗構(gòu)象表位的抗體才能獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為了獲得抗構(gòu)象表位的抗體，用作免疫動物和抗體篩選的抗原必需保持生物活性或天然構(gòu)象，而原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的某些重組蛋白不能正確折疊或修飾而失去構(gòu)象表位，故必需用真核或哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)才能獲得理想的免疫原和篩選用抗原。此外，由于基因轉(zhuǎn)染的生物工程細(xì)胞，重組蛋白不僅表達(dá)量高，而且能正確折疊或修飾，故抗原活性好，因此還可直接用于免疫檢測分析和單抗的篩選以及醫(yī)學(xué)診斷。
在現(xiàn)代免疫檢測和蛋白組學(xué)分析和研究中，需要對同一未知樣品中大量的、多種不同化學(xué)物質(zhì)、抗原、抗體或蛋白質(zhì)等成分進(jìn)行快速、靈敏的高通量檢測，以分析化學(xué)物質(zhì)、抗原、抗體或蛋白的種類、數(shù)量、組成、變異以及多態(tài)性、翻譯后修飾、個(gè)體的感染狀態(tài)或個(gè)體免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)等。在大部分情況下，需要在同一個(gè)容器里、同時(shí)進(jìn)行兩項(xiàng)或多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，以便對樣品中多種不同成分的有無、含量和來源等做出平行的定性、定量、定位等檢測分析；或?qū)我环N分子的多種不同特性(如單一蛋白分子具有多個(gè)不同的表位或抗原決定簇)進(jìn)行平行檢測與分析。在此情況下，傳統(tǒng)的固相吸附試驗(yàn)所存在的問題是對超過3種以上的不同被檢測物，由于難以區(qū)分，很難同時(shí)進(jìn)行。也就是說，用傳統(tǒng)的固相吸附試驗(yàn)方法，在一個(gè)試驗(yàn)中所要檢測或分析被檢測物的數(shù)量受固相系統(tǒng)的限制或制約。譬如，傳統(tǒng)的辦法是首先通過分離純化等技術(shù)和工藝，分別純化大量的各種不同的生物探針，如藥物分子、蛋白酶分子、生長因子與受體、抗原和各種不同特異性的抗體等，再分別將生物探針固相化在不同的微孔板或微珠等固相基質(zhì)的表面，分別與樣品中對應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)、抗體或/和抗原分別反應(yīng)，再分別進(jìn)行檢測分析，因此如要檢測十幾種成分就需進(jìn)行十幾次不同的實(shí)驗(yàn)，異常繁瑣復(fù)雜。將基因轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化與位序編碼技術(shù)相結(jié)合，把轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的工程細(xì)胞/菌以點(diǎn)陣的方式排列在同一固相載體表面，將誘導(dǎo)、表達(dá)和檢測分析集成為一體，并省略分離純化等操作，則可以使樣品的高通量檢測更簡單，操作更簡便，并大大提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡便靈敏、快速及時(shí)，可同時(shí)對多種不同組織細(xì)胞或物質(zhì)成分進(jìn)行檢測分析的技術(shù)。
本發(fā)明的主要技術(shù)特征是，將單層生長并融合成片的不同細(xì)胞或細(xì)胞系點(diǎn)狀排列在片基上，形成細(xì)胞點(diǎn)陣，以便對樣品中未知的化學(xué)物質(zhì)、生物靶分子、細(xì)胞和微生物等多種不同成分的有無、性質(zhì)、含量、來源；或?qū)σ阎暮怂帷⒌鞍着c抗原等生物分子在組織與細(xì)胞中的分布和定位等同時(shí)進(jìn)行鑒定、分析或檢測的生物技術(shù)。各細(xì)胞點(diǎn)的反應(yīng)結(jié)果可用目測、顯微鏡或掃描儀等儀器記錄分析，根據(jù)細(xì)胞點(diǎn)在細(xì)胞片中的排列位置和順序，完成樣品中核酸、蛋白與抗原等分子的檢測和組織細(xì)胞的分布、表達(dá)調(diào)控。本項(xiàng)發(fā)明同時(shí)還提供了一種基于本生物檢測技術(shù)的試劑盒及用于細(xì)胞片的制備裝置和方法。利用試劑盒中所提供的試劑和方法可對細(xì)胞片中各點(diǎn)所捕獲的樣品成分，做進(jìn)一步分析。該試劑盒不僅大大簡化了同一樣品進(jìn)行多因素檢測分析的操作步驟，縮短了操作時(shí)間，降低了工作強(qiáng)度，更增加了檢測結(jié)果的精確性、靈敏度、重現(xiàn)性和可比性，而且還可同時(shí)對檢測樣品中多種不同的物質(zhì)成分做進(jìn)一步的不同分析，使用更方便，操作更快捷，并且可廣泛地應(yīng)用于環(huán)境檢測、疾病診斷、新藥開發(fā)、疫苗研究、基因組和蛋白組學(xué)等技術(shù)研究領(lǐng)域。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案，其基本特征在于基因、蛋白和抗原的組織細(xì)胞分布、表達(dá)調(diào)控分析及被檢樣品中的化學(xué)/生物分子、細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等的高通量生物檢測至少包括下述成分和操作①一種細(xì)胞片由片基(1)和細(xì)胞(2)組成。細(xì)胞片用制備裝置將細(xì)胞(2)或兩個(gè)及以上不同物種、同一物種不同組織來源、不同狀態(tài)或完全相同的細(xì)胞，通過表面涂層或手臂分子的不同活性基團(tuán)(3)，一同附著在片基的表面并呈點(diǎn)狀有序地排列，經(jīng)生物固定劑處理后，固著在片基(1)的表面；②樣品處理對被檢樣品，如固/液體標(biāo)本、生物體液、組織、細(xì)胞、微生物等進(jìn)行稀釋、濃縮、梯度密度分離、組織/細(xì)胞的勻漿、裂解、去除顆粒性物質(zhì)、分離純化、反轉(zhuǎn)錄、PCR或RT-PCR擴(kuò)增等處理或不進(jìn)行處理；③標(biāo)記用熒光素(如FITC，Cy3，Cy5，Texas Red等)、酶(如HRP，AP，半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，尿素梅和熒光素酶等)、膠體金、同位素(如125I，32P，35S等)、稀土離子(如Eu，Sm，Tb和Dy等)及其螯合物(如Eu3+-DTPA)等物質(zhì)或其衍生物(如Cy5-dCTP，32P-dCTP等)等指示性標(biāo)記分子直接標(biāo)記被檢樣品；或?qū)⒁豢?、生物素、地高辛等示蹤性?biāo)記分子或其不同標(biāo)記物(如熒光抗體、酶標(biāo)抗體、生物素化抗體、生物素化酶、Eu3+-DTPA-抗體等標(biāo)記物)用公知的技術(shù)或方法標(biāo)記(直接或間接標(biāo)記)被檢樣品或不經(jīng)過標(biāo)記處理直接使用；④特異結(jié)合標(biāo)記或未標(biāo)記的被檢樣品與片基上固著的細(xì)胞或其核酸、蛋白、抗原等生物分子相互作用或特異性結(jié)合；未經(jīng)標(biāo)記的樣品或用一抗、生物素、地高辛等示蹤性標(biāo)記分子標(biāo)記的樣品與細(xì)胞反應(yīng)后，加入用指示性標(biāo)記分子標(biāo)記的抗體、抗抗體或親和素等指示性標(biāo)記物，使之與樣品或示蹤性標(biāo)記分子結(jié)合；⑤漂洗上述各步驟中，細(xì)胞片上未結(jié)合的、非特異性結(jié)合的或殘留的樣品、樣品標(biāo)記物、示蹤性或指示性標(biāo)記物等用洗液(如含0.03-0.1％的Tween20或Triton X-100等的PBS，Tris-HCl，HEPES等緩沖液)漂洗去除；⑥結(jié)果觀察結(jié)果觀察用顯微鏡、掃描儀或目測等觀察細(xì)胞片上各細(xì)胞點(diǎn)標(biāo)記分子(如熒光、顯色產(chǎn)物或發(fā)光產(chǎn)物、放射性)的有無、強(qiáng)弱、顏色的深淺，對照排列順序以分析樣品中被檢物的有無、含量、組成、來源、組織/細(xì)胞分布與定位等；⑦指示性標(biāo)記物為酶時(shí)，如HRP(辣根過氧化物酶)，AP(堿性磷酸酶)、熒光素酶(Luciferase)等，觀察結(jié)果前需加入酶的對應(yīng)底物，如DAB(二氨基聯(lián)苯胺)，OPD(鄰苯二胺)或魯米諾、甲基傘形酮磷酸酯、對羥基苯乙酸等顯色劑或發(fā)光試劑以顯示結(jié)果；⑧染色與脫色可用蘇木素、伊紅、吉姆薩或其它公知的組織細(xì)胞染色液復(fù)染顯示細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)；⑨原位雜交和原位PCR探針或被檢測物為核酸時(shí)，可采用公知的原位雜交、PCR或RT-PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增、標(biāo)記和檢測。
本發(fā)明的特征還在于細(xì)胞片由片基(1)和細(xì)胞(2)組成；細(xì)胞成單層生長并融合成片，在片基上成點(diǎn)狀排列；在一張細(xì)胞片上至少有2個(gè)或以上的細(xì)胞點(diǎn)，細(xì)胞點(diǎn)可組成不同的點(diǎn)；在一張細(xì)胞片上可以有一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞點(diǎn)陣，點(diǎn)與點(diǎn)之間可以是相同的細(xì)胞也可以是不同的細(xì)胞；點(diǎn)陣之間可以相同，也可以不同；細(xì)胞點(diǎn)與點(diǎn)，點(diǎn)陣與點(diǎn)陣之間的空隙，可以有間隔(4)，圍繞細(xì)胞點(diǎn)或細(xì)胞點(diǎn)陣形成彼此獨(dú)立的微反應(yīng)池(5)；本發(fā)明的特征還在于細(xì)胞片中的細(xì)胞(2)可以是腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞系，如Hela，HepG2等；也可以是正常細(xì)胞、傳代細(xì)胞、原代細(xì)胞、基因轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化細(xì)胞、微生物感染細(xì)胞，經(jīng)特定的化學(xué)分子、生物制劑、生物活性分子或任何可產(chǎn)生生物效應(yīng)的理化因素、藥物等處理的細(xì)胞，可以是原核(如E.Coli)、真核(酵母細(xì)胞)、昆蟲、哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞或其它不同或相同物種，相同或不同組織來源的細(xì)胞，或者是完全相同的細(xì)胞；本發(fā)明的特征還在于片基(1)可以是玻璃、陶瓷、金屬材料，纖維素、乳膠、硅膠等天然或人工合成的高分子材料或任何可加工成型的、透光的、不透光的或反光的，被加工成方形、長方形、園盤型的平板、薄片或薄膜，或是被加工成帶有微孔或帶有微孔及由微管、進(jìn)/出液孔及蓋板等形成的微流路或其它外觀形狀的硬質(zhì)或軟質(zhì)材料；其表面本身具有，或經(jīng)不同的物理處理、化學(xué)修飾或表面處理，如①用多聚賴氨酸浸泡處理；②硅烷化處理，如丙氨基-三乙基硅烷(APES)等；③用白膠，商售的專用固著劑；④用膠原蛋白或細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原，纖粘連蛋白等涂布載玻片、塑料片/膜；⑤通過化學(xué)修飾在片基表面形成一層由活性基團(tuán)組成的表面分子層，如氨基、醛基、環(huán)氧基、羧基、羥基、巰基、溴乙酰基、酰肼基、環(huán)化亞胺碳酸鹽基團(tuán)等化學(xué)活性基團(tuán)；⑥通過辛胺、泰富隆(Teflon)涂層、硅化等處理獲得惰性化學(xué)涂層；
以獲得具有惰性或活性基團(tuán)的化學(xué)分子或生物分子表面或涂層(3)；片基材料自身，涂層或其表面的分子活性基團(tuán)有助于細(xì)胞的附著或固著，可以保證細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)操作中不會脫落；或減少樣品和/或標(biāo)記物等在微流路表面等非細(xì)胞附著區(qū)的非特異性吸附；本發(fā)明的特征還在于細(xì)胞片制備裝置，為全自動、半自動或手動實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)裝置，可由有或無凹槽的底層托盤(6)、密封墊/圈(7)、通孔板(8)、緊固裝置、單或多通路微量液體分注器和操作控制系統(tǒng)等組件共同或分別組成；密封墊/圈與通孔板可以是一體式也可以是分體式；底層托盤、密封墊/圈、通孔板等是由任何可加工成型的材質(zhì)，經(jīng)加工而成的，具有不同外觀形狀的組件；通孔板、密封墊/圈通過緊固裝置、加壓或粘貼等方式，與片基共同或分別組成的、帶有相互獨(dú)立的微孔的多孔微孔板，微孔膜或微孔片；與單或多通路微量液體分注器、操作控制系統(tǒng)等以一體式或分體式等方式組裝而成；在實(shí)施中，細(xì)胞可與細(xì)胞培養(yǎng)基、緩沖液以及各種添加劑與水配制成一定濃度的細(xì)胞懸液，借助操作控制系統(tǒng)可將一定體積的不同細(xì)胞懸液，通過單或多通路微量液體分注器分別加入各微孔中，靜置或離心等使細(xì)胞分別沉積在片基上，細(xì)胞經(jīng)孵育成單層生長并融合成片，形成點(diǎn)狀排列在片基上；本發(fā)明的特征還在于細(xì)胞片的制備至少包括以下部分或全部操作①細(xì)胞的分離純化與培養(yǎng)擴(kuò)增新鮮的組織標(biāo)本，經(jīng)剪切、消化(如胰酶、膠原酶)等處理獲得單個(gè)分散細(xì)胞，再經(jīng)梯度和/或密度沉降、離心，或磁性微球，流式細(xì)胞術(shù)分選等公知方法分離和純化，分別培養(yǎng)或擴(kuò)增；②細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)擴(kuò)增引種或低溫保存的，傳代的正常細(xì)胞系、胚胎細(xì)胞系、腫瘤細(xì)胞系、感染、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、原代細(xì)胞等經(jīng)復(fù)蘇后，分別用公知的技術(shù)方法培養(yǎng)擴(kuò)增；③細(xì)胞的收集和計(jì)數(shù)分離純化的或擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞，收集，再經(jīng)離心、計(jì)數(shù)和漂洗等操作后分別用培養(yǎng)基、平衡鹽溶液、緩沖液等配成一定濃度的單個(gè)細(xì)胞懸液；貼壁生長的細(xì)胞需經(jīng)胰酶、EDTA等試劑消化分散，制備成單個(gè)細(xì)胞后配制成細(xì)胞懸液；④微孔板的準(zhǔn)備將片基(1)放入底層托盤(6)的定位凹槽中，依次加裝密封墊/圈(7)、通孔板(8)，加壓緊固，形成以片基為底的，各孔相互獨(dú)立的多孔微孔板；⑤單或多通路微量液體分注器將一定體積的細(xì)胞懸液，依序分別加入各微孔中；⑥經(jīng)過放置或離心等使細(xì)胞分別沉積在片基上，用公知的方法孵育至細(xì)胞附著在片基上，形成單層并融合成片，以點(diǎn)狀在片基上排列；⑦傾去各微孔中的液體，取下已附著細(xì)胞的片基，漂洗去除未附著的細(xì)胞、死細(xì)胞、細(xì)胞碎片和殘留的細(xì)胞液，并將附著在片基上的細(xì)胞用公知的方法進(jìn)行固定，同時(shí)或分別進(jìn)行過氧化物酶、磷酸酶、核酸酶等內(nèi)源性酶的滅活和非特異性結(jié)合位點(diǎn)的封閉等處理；⑧漂洗去除殘留的細(xì)胞固定液等，加入聚乙二醇—乙醇、甘油、蔗糖或其它公知的組織細(xì)胞保存液處理細(xì)胞片；本發(fā)明的特征還在于片基可以是微孔板，在板體(9)和板蓋(10)上可分別具有微孔(11)、微流路(12)、驅(qū)動孔(18)、定位孔(19)和視窗(20)等部分或全部結(jié)構(gòu)；微孔按一定的格式排列，通過微流路與外界相通或形成閉合環(huán)路。微流路由進(jìn)液孔(13)、出液孔(14)、微槽/管(15)、密封圈(16)、蠕動管(17)等結(jié)構(gòu)組成，可分別位于板體或板蓋上，也可全部位于板體或板蓋上；微流路通過微管與微孔相連，并通過進(jìn)液孔和出液孔與外界相通；蠕動管位于進(jìn)液孔和出液孔之間，將微流路連接成閉合環(huán)路，使樣品和標(biāo)記物等液體可以在微流路中循環(huán)流動，以促進(jìn)樣品和標(biāo)記物等與細(xì)胞及其生物分子等的相互作用及結(jié)合；蠕動管可位于板體或板蓋上，也可以外置；當(dāng)片基具有微流路時(shí)優(yōu)選專利號為00120798.9，01207812.3和02125914.3所述的檢測板或微孔板；本發(fā)明的特征還在于間隔(4)是指在制備過程中或之后添加的，圍繞細(xì)胞點(diǎn)或細(xì)胞點(diǎn)陣，使之形成彼此獨(dú)立的微反應(yīng)池的結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)可以是高分子材料、纖維素、薄膜、油漆或涂料等，可以通過粘貼，噴刷、熱壓、熨燙或超聲等方法使之附著、粘貼于片基上或與片基融為一體。
本發(fā)明的特征還在于試劑盒至少裝有一張細(xì)胞片，并與下述成分或試劑分別或共同組成不同的試劑盒，這些成分或試劑可以是液體、固體、干粉或膠體①至少有一管組織/細(xì)胞或微生物樣品處理液，用于核酸、蛋白、多糖的分離；處理液中可根據(jù)需要至少含有核酸、蛋白、多糖或糖等的水解/分解/裂解酶等的酶抑制劑(如異硫氰酸胍、鹽酸胍、PMSF TPCK，TLCK，aprotinin，leupeptin，antipain等)，去垢劑(NP40，Tween，SDS，膽酸等)，還原劑(如二巰基乙醇，二巰基蘇糖醇等)，金屬離子螯合劑(如EDTA，EGTA)，密度梯度(如氯化銫、BSA、泛影葡胺、聚蔗糖等)分層液、沉淀劑等；②至少有一種樣品標(biāo)記試劑，含指示性/示蹤性標(biāo)記分子或其標(biāo)記物，可用于樣品中待檢成分的標(biāo)記；③至少有一管洗滌液、稀釋液或其濃縮液，如含有適量BSA或小牛血清、脫脂牛奶、Tween等的PBST，或TBST等緩沖液，用于樣品、標(biāo)記物等的稀釋，或各步驟間殘留物和非特異性附著物的漂洗和去除；④至少有一管為指示性標(biāo)記物，核酸探針、抗原或抗體、蛋白、多糖或凝集素，或其標(biāo)記物；其中核酸可以是RNA，DNA或cDNA片段、全序列的單鏈或雙鏈等；其中抗體可以是一抗、二抗等；⑤至少有一管為蛋白、核酸、脂或酯、糖和多糖等的濃度測定試劑，如Folin酚、蒽酮等試劑；⑥在標(biāo)記物為酶類時(shí)，至少有一種顯色底物或發(fā)光底物，如OPD或DAB與過氧化氫/脲、魯米諾，甲基傘形酮磷酸酯，ATP等；⑦至少有一管為PCR或RT-PCR引物、核酸探針、分子雜交液或預(yù)雜交液，用于核酸的擴(kuò)增、雜交或預(yù)雜交；⑧至少有一管為核酸聚合酶、蛋白水解酶、蛋白酶抑制劑或聚合酶底物，如DNA/RNA聚合酶，細(xì)菌堿性磷酸酶，馬鈴薯磷酸酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，羧肽酶，或糖基修飾分析酶PNGase F及核酸聚合酶的底物dNTP等；⑨至少有一管為生物微球，其表面有抗體、蛋白分子、藥物、核酸或引物等，以對細(xì)胞片特定細(xì)胞點(diǎn)的細(xì)胞或細(xì)胞結(jié)合物等成分的分離用于進(jìn)一步分析；⑩至少有一管為組織細(xì)胞染色液，如蘇木素、伊紅、吉姆薩等，用于細(xì)胞的復(fù)染；本發(fā)明的特征還在于可以用試劑盒中的試劑通過下述不同的方法對樣品或細(xì)胞片不同細(xì)胞點(diǎn)中的細(xì)胞及其所結(jié)合的樣品成分分別做PCR、RT-PCR、基因克隆、質(zhì)譜分析、序列測定、電泳等進(jìn)一步分析或分析前的處理①直接在感興趣的細(xì)胞點(diǎn)中加入PCR試劑或電泳樣品緩沖液、染色液等試劑，對結(jié)合物在原位做進(jìn)一步分析前的樣品處理；
②將細(xì)胞片上的細(xì)胞取出，在微量反應(yīng)器中加入PCR試劑或電泳樣品緩沖液或染色液等試劑對結(jié)合物做進(jìn)一步分析前的樣品處理；③將新鮮樣品分別與感興趣細(xì)胞點(diǎn)的生物微球或包被相同結(jié)合特性分子單體的微球共育，以同樣的條件重復(fù)細(xì)胞片的操作步驟，將樣品中感興趣的成分吸附在生物微球上，充分漂洗去除未結(jié)合的樣品混合物，加入PCR試劑、核酸內(nèi)切酶或蛋白水解酶、磷酸酶、電泳樣品緩沖液、蛋白質(zhì)糖基化分析或染色液等試劑，對結(jié)合物做進(jìn)一步電泳、質(zhì)譜和系列測定等分析或分析前的處理；④樣品的PCR，RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)和標(biāo)記等處理可在細(xì)胞片上進(jìn)行，也可在試管中進(jìn)行。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1信息量大。在一張載玻片大小的片基上，排列數(shù)十甚至數(shù)百種不同特性的細(xì)胞，一次實(shí)驗(yàn)操作就可獲得被分析物在片基上所有細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)定位、組織分布與表達(dá)調(diào)控等數(shù)據(jù)資料，或完成對成百上千種不同被檢物的高通量定性、定量并行分析。2.易于制備、成本低。本發(fā)明所述的細(xì)胞片可選用各種商售產(chǎn)品為原材料，如載玻片，聚苯乙烯、聚碳酯、尼龍、硅膠、纖維素等膜片或薄板等作為片基成本低廉；生產(chǎn)所需的專用設(shè)備采用本發(fā)明所述的自制裝置，不僅成本低，而且可滿足一般生產(chǎn)的需要。所需細(xì)胞可通過培養(yǎng)擴(kuò)增大量獲得；與細(xì)胞的感染、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)表達(dá)及固相分離純化等技術(shù)相結(jié)合，將細(xì)胞或其產(chǎn)物作為抗原直接用于生物檢測分析和診斷，還可以實(shí)現(xiàn)將基因的重組表達(dá)、蛋白的制備、分離純化、解吸附以及變性、復(fù)性等復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)操作融為一體，省略了繁瑣的重復(fù)性操作等過程。3.自由組合，靈活易變。可完全依照使用目的的不同，自由組合，或靈活地改變細(xì)胞片中細(xì)胞的種類和生物學(xué)特性以改變檢測的內(nèi)容，而無需變動全部排列順序和格式。4.靈敏度高。經(jīng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可作為抗原，直接用于生物檢測分析和診斷。由于表達(dá)的重組蛋白未經(jīng)過分離純化等過程，因此保留了生物分子的天然構(gòu)象等生物特性；此外，采用真核細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞表達(dá)，可完全模擬基因表達(dá)的自然過程，如翻譯后的折疊和糖基修飾等。因此，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞直接作為抗原用于檢測分析，不僅反應(yīng)特異性與親和力得到提高，而且由于抗原都能更好的保留其生物活性，還可以大大提高檢測靈敏度。當(dāng)采用帶有微流路的片基制備細(xì)胞片時(shí)，種植在微孔內(nèi)的細(xì)胞分別作為固相(相當(dāng)于固化了配基/配體的親和層析基質(zhì))，與沿微流路逐一流經(jīng)各孔的流動相中的被檢物(如抗體、蛋白、多糖或核酸分子)特異結(jié)合或雜交，同時(shí)被固相吸附后的樣品液不再與樣品原液混合(具有過濾、親和層析、分離與濃縮效用)，去除了被檢測物(如抗原/抗體等)在反應(yīng)中因反復(fù)擴(kuò)散、平衡而被稀釋的影響，故更加靈敏。5.操作簡便，節(jié)省樣品與試劑。采用本發(fā)明所述的細(xì)胞片進(jìn)行基因、蛋白、抗原等組織細(xì)胞的分布、定位與調(diào)控分析或用于檢測分析，將幾十個(gè)甚至幾百個(gè)實(shí)驗(yàn)集成在一起，并行操作，改變了傳統(tǒng)和現(xiàn)有技術(shù)分別清洗、分別分離純化、分別制備、分別反應(yīng)，分別檢測或在較大的容器中反應(yīng)和浸洗的操作方式，因此可大量節(jié)約試劑，解決因樣品不易獲得和標(biāo)記物價(jià)格昂貴所帶來的困擾；同時(shí)還簡化了繁瑣的重復(fù)性操作，并且易于實(shí)現(xiàn)全自動化。6.定量分析更準(zhǔn)確。本方法將數(shù)十種甚至數(shù)千種表達(dá)不同生物分子的細(xì)胞種植在片基的微孔中，將檢測分析集中在一塊細(xì)胞片上同時(shí)進(jìn)行，不僅可以確定樣品的組成及各組分的來源、含量，組織/細(xì)胞定位，同時(shí)又便于不同樣品間和同一樣品不同成分間的平行比對。微孔中種植的細(xì)胞或微生物體可同時(shí)在同一培養(yǎng)器皿中一次性大量制備，從而可保證各復(fù)孔和各細(xì)胞片之間的檢測結(jié)果的平行一致。在需要對某一成分進(jìn)行定量分析時(shí)，只需增加種植相同細(xì)胞等微生物體的復(fù)孔數(shù)，配合單向的微流路，比較前后各復(fù)孔熒光、發(fā)光的強(qiáng)弱變化或膠體金沉積、成色產(chǎn)物生成多少的變化，對照標(biāo)準(zhǔn)物，即可實(shí)現(xiàn)對被檢物的定量分析，解決了定量分析的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和不同實(shí)驗(yàn)室及不同批次檢測分析結(jié)果的不可比對性等問題。7.保留了傳統(tǒng)和現(xiàn)有檢測方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高、可靠性強(qiáng)等優(yōu)特點(diǎn)。8.結(jié)果易于分析。由于細(xì)胞點(diǎn)和微孔的形狀和尺寸相同，封閉式微流路結(jié)構(gòu)可避免灰塵等引起的噪聲信號，因而能獲得均勻和最小的圖像背景強(qiáng)度，同時(shí)每個(gè)細(xì)胞點(diǎn)或微孔的排列可與光電信號轉(zhuǎn)換元件的排列一致，因此可獲得最佳的細(xì)胞芯片圖像。9.用途更廣泛。本發(fā)明不僅可用于基因、蛋白和抗原等組織/細(xì)胞定位與表達(dá)調(diào)控等研究，還可以直接用于疾病的診斷、新藥的開發(fā)和蛋白質(zhì)組學(xué)等現(xiàn)代生命科學(xué)的研究與開發(fā)；而且對感興趣的細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)還可借助激光顯微切割捕獲技術(shù)，直接進(jìn)行質(zhì)譜分析；獲得的結(jié)合物的不同洗脫條件等數(shù)據(jù)資料還可用于后續(xù)的靶分子的分離純化等。
附圖簡要說明

圖1為細(xì)胞片基本結(jié)構(gòu)示意圖。
圖中所示為片基(1)、細(xì)胞(2)，細(xì)胞呈點(diǎn)狀排列，形成點(diǎn)陣。
圖2是細(xì)胞片的截面微細(xì)結(jié)構(gòu)示意圖。
圖中所示為片基(1)，細(xì)胞(2)和片基表面可促進(jìn)細(xì)胞附著的活性基團(tuán)或分子形成的表面分子層或稱涂層(3)。借助片基(1)表面的涂層(3)，成單層生長并融合成片的細(xì)胞(2)較牢固地吸附在片基(1)的表面。
圖3為不同排列格式的細(xì)胞片圖中3.1和3.2所示為片基(1)、細(xì)胞(2)，間隔(4)，細(xì)胞呈點(diǎn)狀排列，形成不同密度的點(diǎn)陣和微反應(yīng)池(5)。
圖4是細(xì)胞片制備專用裝置結(jié)構(gòu)與工作原理示意圖。
圖中所示為片基1、底層托盤(6)、密封墊/圈(7)、通孔板(8)。通孔板、密封墊/圈通過加壓緊固使之形成以片基為底的多孔微孔板。操作控制系統(tǒng)借助多通路微量液體分注器將不同的細(xì)胞懸液分別加入各微孔中，經(jīng)靜置或離心等使細(xì)胞分別沉積在片基上，細(xì)胞經(jīng)孵育成單層生長并融合成片形成點(diǎn)狀，排列在片基上；圖5是帶有微孔和微流路的細(xì)胞片基本結(jié)構(gòu)示意圖。
圖中所示為片基(1)，細(xì)胞(2)、板體(9)和板蓋(10)。在板體(9)上具有微孔(11)，其間有微槽/管(12)相連；進(jìn)液孔(13)、出液孔(14)、密封圈(16)、蠕動管(17)等結(jié)構(gòu)與板蓋(10)形成微流路(15)。微孔(11)按一定的格式排列，其內(nèi)可種植不同的細(xì)胞(2)，通過微流路(15)與外界相通或借助蠕動管(17)形成閉合環(huán)路。
圖6是圓盤式細(xì)胞片的外觀結(jié)構(gòu)示意圖。
圖中所示為片基(1)，進(jìn)液孔(13)、出液孔(14)、驅(qū)動孔(18)、定位孔(19)；細(xì)胞點(diǎn)陣以驅(qū)動孔(18)為中心呈環(huán)形或扇形排列，通過進(jìn)液孔(13)、出液孔(14)與外界相通；分析結(jié)果時(shí)，動力裝置借助驅(qū)動孔(18)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞片的自動旋轉(zhuǎn)和位移，并借助定位孔(19)完成掃描儀等分析系統(tǒng)的自動尋址和定位。圖7是視窗式細(xì)胞片的外觀結(jié)構(gòu)示意圖。
圖中所示為片基1，進(jìn)液孔(13)、出液孔(14)、視窗(20)；細(xì)胞點(diǎn)陣在視窗區(qū)的片基上排列，表面覆以透明材質(zhì)的薄膜或薄片形成視窗(20)，在視窗與片基間留有微隙，通過進(jìn)液孔(13)、出液孔(14)與外界相通，以有利于樣品、洗液等與細(xì)胞及其生物分子的相互作用；分析結(jié)果時(shí)，可通過視窗直接觀察結(jié)果。
本發(fā)明在實(shí)施中的基本操作步驟和方法如下一.細(xì)胞片的制備細(xì)胞片的制備方法包括以下基本方法和步驟1.表面處理表面處理因所選片基材料的不同而略有不同，每種材料其具體處理方法和條件都有多種，本發(fā)明在此將《生物分子固定化技術(shù)及應(yīng)用》(蔣中華等，1998年，化學(xué)出版社)及中國專利號為01207812.3和申請?zhí)枮?0120798.9的專利為主要參考文獻(xiàn)。運(yùn)用公知的各種生物大分子固相化技術(shù)，處理各種材料的片基，使其表面帶有特定的活性基團(tuán)，可與細(xì)胞、化學(xué)分子、藥物分子和生物分子上的活性基團(tuán)反應(yīng)，而具有特定的吸附能力。如載玻片經(jīng)嚴(yán)格清洗后用二甲苯浸洗，再經(jīng)70％的乙醇漂洗、烘干；然后在2％丙氨基-三乙基硅烷無水丙酮溶液(APES，3-Aminopropyltriethoxysilane，Sigma公司，目錄號A3648)中浸泡30秒，用無水丙酮和蒸餾水順序漂洗，干燥(Weetall，H.H.，Biochem.Biophys.Acta，1970；2121)?；蛞陨淌鄣慕?jīng)表面處理的各種材料作為片基。
2.裝片將經(jīng)過處理的片基(1)放入細(xì)胞片生產(chǎn)制備專用裝置底層托盤(6)的凹槽中，然后依次是密封墊/圈(7)、通孔板(8)，調(diào)整緊固裝置，使之形成以片基為底、孔與孔間互不相通的多孔板。
3.細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增依據(jù)細(xì)胞來源的不同，可以有多種不同的基本操作方式①單個(gè)的細(xì)胞引種的細(xì)胞，低溫保存復(fù)蘇后的細(xì)胞；②新鮮的組織標(biāo)本細(xì)胞的分離純化與培養(yǎng)擴(kuò)增需先進(jìn)行剪切、消化等處理獲得單個(gè)分散細(xì)胞和③經(jīng)感染、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化處理的細(xì)胞系或原代細(xì)胞，或經(jīng)梯度和/或密度沉降、離心，或磁性微球，流式細(xì)胞術(shù)分選等方法分離和純化的細(xì)胞。分別用公知的技術(shù)方法培養(yǎng)擴(kuò)增。擴(kuò)增后的細(xì)胞分別收集到離心管中，貼壁生長的細(xì)胞需經(jīng)胰酶、EDTA等試劑消化處理；離心和漂洗，同時(shí)取少量計(jì)數(shù)，然后分別用培養(yǎng)基、平衡鹽溶液、緩沖液等根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果配成一定濃度的單個(gè)細(xì)胞懸液；4.細(xì)胞片的制備用單或多通路微量液體分注器將一定體積的細(xì)胞懸液，依序分別加入或種植在準(zhǔn)備好的多孔微孔板的各微孔中，靜置或離心等使細(xì)胞分別沉積在片基上，溫箱或培養(yǎng)箱孵育至細(xì)胞在片基上成單層附著或貼壁并融合成片。傾去各微孔中的液體，取下附著細(xì)胞的片基，漂洗去除未附著的細(xì)胞、死細(xì)胞、細(xì)胞碎片和殘留細(xì)胞液。
5.固定將附著在片基上的細(xì)胞用甲醛、多聚甲醛、冷丙酮、甲醇、乙醇、苦味酸等公知的方法進(jìn)行固定，漂洗去除殘留的固定液。
6.封閉將片基浸入分別含有動物血清或BSA、脫脂奶粉、酪蛋白、白明膠、聚蔗糖、Tween、NP40，疊氮鈉和去垢劑等試劑的封閉溶液中處理，以封閉片基上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)或分別進(jìn)行過氧化物酶、磷酸酶、核酸酶、蛋白酶等內(nèi)源性酶滅活，以降低結(jié)果觀察時(shí)的背景影響或特異性信號的減弱。
7.封片在片基上加入聚乙二醇-乙醇、甘油、蔗糖或其它公知的組織細(xì)胞保存液，使之覆蓋各細(xì)胞點(diǎn)，待干燥即獲得了由不同細(xì)胞組成，呈點(diǎn)狀排列的細(xì)胞片。
二.樣品的檢測分析樣品的檢測分析一般包括以下基本步驟和方法1.樣品的制備與處理根據(jù)檢測目的的不同，生物樣品在檢測前將分別進(jìn)行不同的處理。常見樣品處理方法包括①可溶性樣品加入適量緩沖液以調(diào)節(jié)樣品濃度或蛋白濃度，離子強(qiáng)度和酸堿度等；②組織、細(xì)胞、微生物等用裂解緩沖液配合勻漿或超聲粉碎等處理使之成為真性溶液；③離心或過濾去除懸浮物或顆粒物，如血細(xì)胞等。④新鮮組織經(jīng)剪切、消化等處理獲得單個(gè)分散細(xì)胞，再經(jīng)梯度和/或密度沉降、離心，或磁性微球，流式細(xì)胞術(shù)分選等分離和純化；⑤核酸提取物用DNA或RNA抽提液處理各種生物樣品、生物體液或培養(yǎng)物以提取樣品中的DNA或RNA等；⑥上述方法的不同組合。
2.樣品的標(biāo)記①直接標(biāo)記。運(yùn)用公知的生物分子標(biāo)記技術(shù)，分別用生物素、酶、熒光素、膠體金、同位素或稀土離子及其螯合劑等物質(zhì)或其衍生物等標(biāo)記分子作為指示劑直接標(biāo)記樣品或待檢標(biāo)本。②采用間接標(biāo)記。用上述標(biāo)記分子的標(biāo)記物標(biāo)記樣品，但標(biāo)記反應(yīng)是在完成加待檢樣品和漂洗等步驟后進(jìn)行。③摻入標(biāo)記，運(yùn)用各種合成技術(shù)，如固相合成技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄合成、PCR或RT-PCR擴(kuò)增等將標(biāo)記分子或標(biāo)記物摻入被標(biāo)記分子中。
3.加待檢樣品將樣品、處理樣品或標(biāo)記樣品加至細(xì)胞片上，使之與各點(diǎn)的細(xì)胞及其生物分子等進(jìn)行反應(yīng)。被檢樣品中與細(xì)胞對應(yīng)的生物分子被捕獲并特異結(jié)合或吸附，未結(jié)合的部分可被漂洗去除。②將寡核苷酸引物、dNTP，可摻入標(biāo)記物和耐熱DNA聚合酶等加至細(xì)胞片，進(jìn)行至少一個(gè)循環(huán)的PCR或RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。③樣品中的抗原抗體、配基配體、細(xì)胞因子或藥物分子等與片基表面附著細(xì)胞或其不同的生物分子結(jié)合。
4.漂洗或流洗在細(xì)胞片上加入洗液或借助微流路用洗液流洗，以去除細(xì)胞片中殘留的被檢樣品(未結(jié)合物或稱游離物)或標(biāo)記物等。
5.結(jié)果分析根據(jù)標(biāo)記分子的不同用目測或顯微鏡、掃描儀等儀器觀察并記錄各細(xì)胞點(diǎn)反應(yīng)的有無以及強(qiáng)弱(如生成產(chǎn)物顏色的深淺、膠體金沉積、熒光強(qiáng)度、放射強(qiáng)度等的強(qiáng)弱變化)。對照細(xì)胞點(diǎn)的排列位置，借助計(jì)算機(jī)分析即可以確定該樣品中，被檢測物的有無，組成以及各組分的含量，組織分布，細(xì)胞定位與表達(dá)調(diào)控。但是在標(biāo)記物為酶時(shí)，實(shí)施中則必須添加對應(yīng)的底物才能觀察檢測結(jié)果，其檢測結(jié)果為呈色反應(yīng)或發(fā)光反應(yīng)。
本發(fā)明在實(shí)施中，上述操作步驟依據(jù)細(xì)胞等微生物體、探針、被檢測物、標(biāo)記物和顯示結(jié)果以及檢測目的的等的不同，可有多種不同的組合方式。各種生物反應(yīng)可全部在細(xì)胞片上進(jìn)行，也可部分在試管中進(jìn)行。
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例I在單克隆抗體開發(fā)中的應(yīng)用。
在小鼠單克隆抗體的研究中，通常需要對抗體識別的抗原靶分子的組織細(xì)胞分布進(jìn)行鑒定，如細(xì)胞表面的各種受體分子或CD分子等，在實(shí)施中的具體操作步驟如下
1.載玻片處理經(jīng)嚴(yán)格清洗的載玻片用二甲苯浸洗，再經(jīng)70％的乙醇漂洗、烘干；然后在2％丙氨基-三乙基硅烷無水丙酮溶液(APES，3-Aminopropyltriethoxysilane)中浸泡30秒，用無水丙酮和蒸餾水順序漂洗，干燥。
2.裝片將經(jīng)過處理的載玻片放入細(xì)胞片制備裝置底層托盤的凹槽中，然后依次是密封墊/圈、通孔板，旋緊緊固裝置后備用。
3.細(xì)胞片的制備將貼壁生長的人不同腫瘤細(xì)胞系接種入培養(yǎng)瓶中，至對數(shù)生長期，用EDTA-胰酶消化分散，收集至離心管中，混勻計(jì)數(shù)，離心漂洗數(shù)次后加入新鮮培養(yǎng)液，配制成一定濃度的細(xì)胞懸液。依序?qū)⒓?xì)胞種植入多孔板的微孔中，置二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞貼壁后，傾去培養(yǎng)液，Hank’s液或無血清培養(yǎng)液漂洗數(shù)次，加入固定液(如含3.7％的多聚甲醛和4％的蔗糖的PBS)適當(dāng)固定(10-30分鐘)后，漂洗數(shù)次后用封閉緩沖液(如含1-3％牛血清白蛋白的PBS)處理，以封閉去除載玻片表面可能殘留的活性基團(tuán)或非特異性結(jié)合位點(diǎn)，即獲得細(xì)胞片，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4.加入樣品取適量體積(50-150ul)的待鑒定雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液(含小鼠抗體)，加至細(xì)胞片的微反應(yīng)池中，孵育適當(dāng)時(shí)間(5-90分鐘)，使抗體與細(xì)胞表面的抗原分子充分作用。
5.漂洗用洗液(PBS含1％的BSA，0.03-0.05％的Tween20或Triton X-100)漂洗去除微反應(yīng)池中殘留的被檢樣品(未結(jié)合的抗體)。
6.標(biāo)記加入100-200ul的FITC標(biāo)記的抗小鼠Ig抗體，孵育適當(dāng)時(shí)間(15-60分鐘)。
7.漂洗漂洗以去除細(xì)胞片中殘留的標(biāo)記物(FITC-抗小鼠Ig)。
8.結(jié)果分析熒光顯微鏡或生物芯片掃描儀等儀器觀察并記錄各細(xì)胞點(diǎn)熒光反應(yīng)的有無，對照陽性孔的排列位置或細(xì)胞點(diǎn)陣的位序編碼，即可以確定該單克隆抗體所識別的抗原分子的組織細(xì)胞分布特性，或其組織細(xì)胞反應(yīng)的特異性。根據(jù)熒光反應(yīng)的強(qiáng)弱差異，可以推測不同細(xì)胞的抗原表達(dá)密度。
實(shí)施例II在優(yōu)生優(yōu)育方面的應(yīng)用。
真核基因和病毒蛋白在原核宿主細(xì)胞中的表達(dá)不但行之有效，而且成本低廉。然而，表達(dá)的蛋白因折疊方式不正確或效率的低下，常?；钚院艿?，甚至沒有活性。特別是蛋白的翻譯后加工與修飾，原核細(xì)胞根本不能進(jìn)行。風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、柯薩基病毒和弓形蟲等是引起宮內(nèi)感染并導(dǎo)致胎兒畸形的主要病原體；乙肝、梅毒和艾滋病等是可以通過垂直傳播引起新生兒感染的傳染性疾病的病原體。因此，對育齡和妊娠婦女開展上述病原體感染的檢測診斷成為預(yù)防先天性畸形和新生兒感染的重要手段。在實(shí)施中具體操作步驟如下1.細(xì)胞片的制備將貼壁生長的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種入培養(yǎng)瓶中，至對數(shù)生長期，用EDTA-胰酶消化分散，收集至離心管中，混勻計(jì)數(shù)，離心漂洗2-3次后加入新鮮培養(yǎng)液，配制成一定濃度的細(xì)胞懸液。將轉(zhuǎn)染不同病原體抗原基因的細(xì)胞依序分別直接種植入微流路片基的微孔中，置二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞貼壁后，傾去培養(yǎng)液，Hank’s液或無血清培養(yǎng)液漂洗數(shù)次，加入固定液(如含3.7％的多聚甲醛和4％的蔗糖的PBS)適當(dāng)固定(10-30分鐘)后，漂洗數(shù)次后，加蓋板或蓋膜使之形成完整的微流路，用封閉緩沖液(如含1-3％牛血清白蛋白的PBS)以封閉去除片基和微流路表面可能殘留的活性基團(tuán)或非特異性結(jié)合位點(diǎn)，即獲得細(xì)胞片，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.加入樣品取10-50ul的被檢者血清適量稀釋，經(jīng)微流路加入細(xì)胞片中，孵育適當(dāng)時(shí)間(5-90分鐘)，使血清中的抗體與轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的抗原分子充分作用。
3.漂洗用洗液經(jīng)微流路漂洗去除細(xì)胞片中殘留的被檢血清(未結(jié)合的抗體)。
4.標(biāo)記加入100-200ul的Cy3和Cy5分別標(biāo)記的抗人IgG和IgM抗體混合液，孵育適當(dāng)時(shí)間(15-60分鐘)。
5.漂洗漂洗以去除細(xì)胞片中殘留的標(biāo)記物。
6.結(jié)果分析熒光顯微鏡或生物芯片掃描儀等儀器觀察并記錄各細(xì)胞點(diǎn)熒光反應(yīng)的有無及顏色變化，對照陽性孔的排列位置或細(xì)胞點(diǎn)陣的位序編碼，即可以確定該被檢者血清中有無被檢抗體，以確定該患者或被檢者有無相應(yīng)的病毒感染；根據(jù)復(fù)孔Cy3和Cy5熒光強(qiáng)弱的差異和變化對照標(biāo)準(zhǔn)參照物，可以計(jì)算出抗原特異性IgG和IgM的含量，由此確定被檢者是否處于感染的早期，以及有無傳染性和被檢者的免疫力狀況等。
實(shí)施例III在原位雜交中的應(yīng)用。
原位雜交實(shí)驗(yàn)是分子生物學(xué)、組織和病理學(xué)研究中，特別是在基因的表達(dá)調(diào)控和組織細(xì)胞定位中最常用的技術(shù)方法，在實(shí)施中的具體操作步驟如下1.取DEPC-PBS(用DEPC處理過的雙蒸水配制的磷酸鹽緩沖液)處理的細(xì)胞片用Triton-X100處理15分鐘，經(jīng)DEPC-PBS洗25分鐘后，用Rnase-free的蛋白酶K或胃蛋白酶于37℃孵育10-30分鐘，經(jīng)甘氨酸PBS或DEPC-PBS漂洗后用多聚甲醛固定，用DEPC-PBS漂洗后醋酸酐三乙醇胺溶液孵育，再用2xSSC洗3分鐘；2.用隨機(jī)引物、缺口翻譯或PCR等方法標(biāo)記或制備探針；3.用不含探針的寡核甘酸探針雜交緩沖液在37℃孵育2小時(shí)，2xSSC洗5分鐘；用含探針的雜交緩沖液37℃孵育約18小時(shí)，依次用1xSSC室溫漂洗，55℃水浴搖洗，0.5xSSC在55℃水浴搖洗，室溫漂洗，用Tris緩沖液搖洗，封閉液室溫孵育30分鐘；4.除去封閉液，用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體室溫孵育2-4小時(shí)，Tris緩沖液漂洗；5.用含MgCL2的Tris緩沖液室溫孵育10分鐘，BCIP/NBT避光顯色2-24小時(shí)；6.用TE緩沖液終止顯色后，將細(xì)胞片在蒸餾水中浸洗，核固紅套染，水溶性封片劑封片，顯微鏡觀察結(jié)果。
本發(fā)明把細(xì)胞的體外培養(yǎng)、重組基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)與生物芯片的高通量快速并行分析技術(shù)相結(jié)合，集數(shù)種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)于一身，是一種全新概念的高通量生物學(xué)分析檢測技術(shù)；把先進(jìn)技術(shù)與自制生產(chǎn)專用設(shè)備相結(jié)合，融高新技術(shù)與低生產(chǎn)開發(fā)成本于一體。具有信息量大、定量準(zhǔn)確、靈敏度高、制造成本低，用途廣等突出優(yōu)點(diǎn)，可廣泛用于生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)，環(huán)境科學(xué)、能源與材料科學(xué)等領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種可分析基因、蛋白和抗原等生物分子的組織細(xì)胞分布、表達(dá)調(diào)控及檢測樣品中的化學(xué)/生物分子、細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等的細(xì)胞生物技術(shù)、試劑盒及制備裝置，該技術(shù)和試劑盒至少包括下述成分和操作①一種細(xì)胞片由片基和細(xì)胞組成。細(xì)胞片用制備裝置將細(xì)胞或兩個(gè)及以上不同物種、同一物種不同組織來源、不同狀態(tài)或完全相同的細(xì)胞，通過表面涂層或手臂分子的不同活性基團(tuán)，一同附著在片基的表面并呈單層點(diǎn)狀有序地排列，經(jīng)生物固定劑處理后，固著在片基表面；②樣品處理對被檢樣品進(jìn)行稀釋、濃縮或梯度密度分離、勻漿、裂解、去除顆粒性物質(zhì)、分離純化、反轉(zhuǎn)錄、PCR或RT-PCR擴(kuò)增等處理，或不進(jìn)行處理；③標(biāo)記用熒光素、酶、膠體金、同位素等指示性標(biāo)記分子，或一抗、生物素、地高辛等示蹤性標(biāo)記分子或其不同標(biāo)記物標(biāo)記樣品；④特異結(jié)合標(biāo)記或未標(biāo)記的被檢樣品與片基上固著的細(xì)胞或其核酸、蛋白、抗原等生物分子相互作用或特異性結(jié)合；未經(jīng)標(biāo)記的樣品或用一抗、生物素、地高辛等示蹤性標(biāo)記分子標(biāo)記的樣品與細(xì)胞反應(yīng)后，加入用指示性標(biāo)記分子標(biāo)記的抗體、抗抗體或親和素等指示性標(biāo)記物，使之與樣品或示蹤性標(biāo)記分子結(jié)合；⑤漂洗上述各步驟中，細(xì)胞片上未結(jié)合的、非特異性結(jié)合的或殘留的樣品、樣品標(biāo)記物、示蹤性或指示性標(biāo)記物等用洗液漂洗去除；⑥結(jié)果觀察用顯微鏡、掃描儀或目測等檢測細(xì)胞片上各細(xì)胞點(diǎn)標(biāo)記分子的有無、強(qiáng)弱、顏色的深淺，對照排列順序等，以分析樣品中被檢物的有無、含量、組成、來源、組織/細(xì)胞分布與定位等；⑦指示性標(biāo)記物為酶時(shí)，觀察結(jié)果前需加入酶的對應(yīng)底物以顯示結(jié)果；⑧染色與脫色細(xì)胞的結(jié)構(gòu)可用蘇木素、伊紅或其它公知的組織細(xì)胞染色液復(fù)染顯示；⑨原位雜交和原位PCR探針或被檢測物為核酸時(shí)，可采用公知的原位雜交、PCR或RT-PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增、標(biāo)記和檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞片，由片基和細(xì)胞組成；細(xì)胞成單層生長并融合成片，在片基上成點(diǎn)狀排列；在一張細(xì)胞片上至少有2個(gè)或以上的細(xì)胞點(diǎn)，細(xì)胞點(diǎn)可組成不同的點(diǎn)陣；點(diǎn)與點(diǎn)之間可以是相同的細(xì)胞也可以是不同的細(xì)胞，點(diǎn)陣之間可以相同，也可以不同；細(xì)胞點(diǎn)與點(diǎn)，點(diǎn)陣與點(diǎn)陣之間的空隙可以有間隔，圍繞細(xì)胞點(diǎn)或細(xì)胞點(diǎn)陣形成彼此獨(dú)立的微反應(yīng)池；
3.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的細(xì)胞，可以是腫瘤細(xì)胞，也可以是正常細(xì)胞、傳代細(xì)胞、原代細(xì)胞、基因轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化細(xì)胞、微生物感染細(xì)胞，經(jīng)特定的化學(xué)分子、生物制劑、生物活性分子或任何可產(chǎn)生生物效應(yīng)的理化因素、藥物處理的細(xì)胞，還可以是真核、原核、昆蟲、哺乳動物細(xì)胞或其它不同或相同物種，相同或不同組織來源的細(xì)胞，或者是完全相同的細(xì)胞；
4.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2所述的片基，可以是玻璃、陶瓷、硅片、天然或人工合成的高分子材料，或任何可加工成型的、透光的、不透光的或反光的，被加工成方形、長方形、園盤型的平板、薄片或薄膜，微孔板或其它外觀形狀的硬質(zhì)或軟質(zhì)材料；其表面本身具有，或經(jīng)不同的物理處理、化學(xué)修飾或表面處理，獲得具有惰性或活性基團(tuán)的化學(xué)分子或生物分子表面或涂層；片基材料自身，涂層或其表面的分子活性基團(tuán)有助于細(xì)胞的附著或固著，減少或降低非細(xì)胞附著區(qū)的非特異性吸附；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞片生產(chǎn)制備專用裝置，為全自動、半自動或手動實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)裝置，可由有或無凹槽的底層托盤、密封墊/圈、通孔板、緊固裝置、單或多通路微量液體分注器和操作控制系統(tǒng)等組件共同或分別組成；其中密封墊/圈與通孔板可以是分體式也可以是一體式；底層托盤、密封墊/圈、通孔板等是由任何可加工成型的材質(zhì)，經(jīng)加工而成的，具有不同外觀形狀的組件；通孔板、密封墊/圈通過緊固裝置、加壓或粘貼等方式，與片基共同或分別組成的、帶有相互獨(dú)立的微孔的多孔微孔板，微孔膜或微孔片；與單或多通路微量液體分注器、操作控制系統(tǒng)以一體式或分體式等方式組裝而成；
6.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2和權(quán)利要求5所述的細(xì)胞片，其制備至少包括以下部分或全部操作①細(xì)胞的分離純化與培養(yǎng)擴(kuò)增新鮮的組織標(biāo)本，經(jīng)剪切、消化等處理獲得單個(gè)分散細(xì)胞，再經(jīng)梯度和/或密度沉降、離心，或磁性微球，流式細(xì)胞術(shù)分選等公知方法分離和純化，分別培養(yǎng)或擴(kuò)增；②細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)擴(kuò)增引種或低溫保存的，傳代的正常細(xì)胞系、胚胎細(xì)胞系、腫瘤細(xì)胞系、感染、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、原代細(xì)胞等經(jīng)復(fù)蘇后，分別用公知的技術(shù)方法培養(yǎng)擴(kuò)增；③細(xì)胞的收集和計(jì)數(shù)分離純化的或培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞，收集，再經(jīng)離心、計(jì)數(shù)和漂洗等操作后分別用培養(yǎng)基、平衡鹽溶液、緩沖液等配成一定濃度的單個(gè)細(xì)胞懸液；貼壁生長的細(xì)胞需經(jīng)胰酶、EDTA等試劑消化分散，制備成單個(gè)細(xì)胞，并配成一定濃度的細(xì)胞懸液；④微孔板的準(zhǔn)備將片基放入底層托盤的定位凹槽中，依次加裝密封墊/圈、微孔板，緊固加壓，形成以片基為底的，各孔相互獨(dú)立的多孔微孔板；⑤單或多通路微量液體分注器將細(xì)胞懸液，依序分別加入各微孔中；⑥經(jīng)靜置或離心等使細(xì)胞分別沉積在片基上，用公知的方法孵育至細(xì)胞附著在片基上形成單層并融合成片，在片基上呈點(diǎn)狀排列；⑦傾去各微孔中的液體，取下附著細(xì)胞的片基，漂洗去除未附著的細(xì)胞、死細(xì)胞、細(xì)胞碎片和殘留的細(xì)胞液，并將附著在片基上的細(xì)胞用公知的方法進(jìn)行固定，同時(shí)或分別進(jìn)行過氧化物酶、磷酸酶、核酸酶等內(nèi)源性酶的滅活和非特異性結(jié)合位點(diǎn)的封閉等處理；⑧漂洗去除殘留的細(xì)胞固定液等，加入聚乙二醇-乙醇、甘油、蔗糖或其它公知的組織細(xì)胞保存液處理細(xì)胞片；
7.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2和權(quán)利要求4所述的片基，可以是微孔板，在板體和板蓋上可分別具有微孔、微流路、驅(qū)動孔、定位孔和視窗等部分或全部結(jié)構(gòu)；微孔按一定的格式排列，通過微流路與外界相通或形成閉合環(huán)路。微流路由進(jìn)液孔、出液孔、微槽/管、密封圈、蠕動管等結(jié)構(gòu)組成，可分別位于板體或板蓋上，也可全部位于板體或板蓋上；微流路通過微管與微孔相連，并通過進(jìn)液孔和出液孔與外界相通；蠕動管位于進(jìn)液孔和出液孔之間，將微流路連接成閉合環(huán)路；蠕動管可位于片基上也可以外置；
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的間隔，是指在制備過程中或之后添加的，圍繞細(xì)胞點(diǎn)或細(xì)胞點(diǎn)陣形成的，使之彼此獨(dú)立的微反應(yīng)池的結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)可以是高分子材料、纖維素、薄膜、油漆或涂料等，可以通過粘貼，噴刷、熱壓、熨燙或超聲等方法使之附著、粘貼于片基上或與片基融為一體；
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，至少裝有一張細(xì)胞片，并與下述成分或試劑分別或共同組成不同的試劑盒，這些成分或試劑可以是液體、固體、干粉或膠體①至少有一管組織/細(xì)胞或微生物樣品處理液，用于核酸、蛋白、多糖的分離；②至少有一種樣品標(biāo)記試劑，其中含指示性或示蹤性標(biāo)記分子或其標(biāo)記物；③至少有一管為洗滌液、稀釋液或其濃縮液；④至少有一管為核酸探針、抗原或抗體、蛋白、多糖或凝集素，或其標(biāo)記物；⑤至少有一管為蛋白、核酸、脂或酯、糖和多糖等的濃度測定或分析試劑；⑥在標(biāo)記物為酶類時(shí)，至少有一種顯色底物或發(fā)光底物；⑦至少有一管為PCR或RT-PCR引物、核酸探針、分子雜交液；⑧至少有一管為核酸聚合酶、蛋白水解酶蛋白酶抑制劑或聚合酶底物；⑨至少有一管為細(xì)胞微球；⑩至少有一管為組織細(xì)胞染色液；
10.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求9所述的檢測方法和試劑盒，可以用試劑盒中的試劑通過下述不同的方法對樣品或細(xì)胞片不同細(xì)胞點(diǎn)中的細(xì)胞及其所結(jié)合的樣品成分分別做PCR、RT-PCR、基因克隆、質(zhì)譜分析、序列測定、電泳等進(jìn)一步分析或分析前的處理①直接在感興趣的細(xì)胞點(diǎn)中加入PCR試劑或電泳樣品緩沖液、染色液等試劑，對結(jié)合物在原位做進(jìn)一步分析前的樣品處理；②將細(xì)胞片上的細(xì)胞取出，在微量反應(yīng)器中加入PCR試劑或電泳樣品緩沖液或染色液等試劑對結(jié)合物做進(jìn)一步分析前的樣品處理；③將新鮮樣品分別與感興趣細(xì)胞點(diǎn)的生物微球或包被相同結(jié)合特性分子單體的微球共育，以同樣的條件重復(fù)細(xì)胞片的操作步驟，將樣品中感興趣的成分吸附在生物微球上，充分漂洗去除未結(jié)合的樣品混合物，加入PCR試劑、核酸內(nèi)切酶或蛋白水解酶、磷酸酶、電泳樣品緩沖液、蛋白質(zhì)糖基化分析或染色液等試劑，對結(jié)合物做進(jìn)一步分析或分析前的處理；④樣品的PCR，RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)和標(biāo)記等處理可在試管中進(jìn)行，也可在細(xì)胞片上進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型的細(xì)胞生物技術(shù)、試劑盒及制備裝置。該技術(shù)靈敏快速、信息量大，制造簡便、成本低，可對樣品中多種不同的核酸、蛋白和化學(xué)分子等同時(shí)進(jìn)行檢測分析。主要特征在于將不同的細(xì)胞附著在片基上或種植在微孔板的不同微孔中，被檢樣品與細(xì)胞或其所攜帶的生物分子雜交或結(jié)合，檢測結(jié)果可用目測或儀器記錄分析。本發(fā)明可廣泛地用于生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、動植物學(xué)、農(nóng)牧業(yè)、食品與衛(wèi)生、能源與化工、環(huán)境監(jiān)測以及醫(yī)學(xué)診斷與檢測等領(lǐng)域的醫(yī)藥研究、環(huán)境檢測、疾病診斷、基因組/蛋白質(zhì)組學(xué)和分子文庫等的研究與開發(fā)。
文檔編號G01N1/28GK1920559SQ20051009099
公開日2007年2月28日 申請日期2005年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月24日
發(fā)明者趙翀 申請人:趙翀