一種心肌功能檢測(cè)用試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫層析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種心肌功能檢測(cè)用試劑盒及其制備方法。該試劑盒包括塑料板、玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜，樣本墊和吸水墊，所述玻璃纖維素膜上包被有量子點(diǎn)標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、肌紅蛋白抗體和肌酸激酶抗體的混合物；硝酸纖維素膜上設(shè)置有檢測(cè)線1、檢測(cè)線2、檢測(cè)線3和控制線，檢測(cè)線1上包被有肌鈣蛋白二抗，檢測(cè)線2上包被有肌紅蛋白二抗，檢測(cè)線3上包被有肌酸激酶二抗，控制線上包被有羊抗鼠lgG。該試劑盒，利用雙抗體/抗原夾心原理結(jié)合量子點(diǎn)的熒光特性實(shí)現(xiàn)了采用熒光免疫層析的方法對(duì)肌鈣蛋白、肌紅蛋白和肌酸激酶進(jìn)行快速、靈敏的聯(lián)合檢測(cè)。
【專利說明】
一種心肌功能檢測(cè)用試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及免疫層析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種心肌功能檢測(cè)用試劑盒及其制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肌紅蛋白（Myoglobin,Mb)是一種氧結(jié)合血紅素蛋白，主要分布于心肌和骨豁肌組 織。在急性心肌損傷時(shí)，Mb最先被釋放入血液中，在癥狀出現(xiàn)約2-3小時(shí)后，血中Mb可超出正 常上限，9-12小時(shí)達(dá)到峰值，24-36小時(shí)后恢復(fù)正常。對(duì)于懷疑ACS的病人建議連續(xù)采樣測(cè) 定，因?yàn)榘Y狀出現(xiàn)和蛋白標(biāo)志物釋放到血液之間有一段延遲。在ACS早期診斷和監(jiān)測(cè)的臨床 效用已有大量文獻(xiàn)報(bào)告。檢測(cè)肌紅蛋白的濃度可以用于一些疾病的早期診斷，如（1)血中升 高：甲狀腺功能減低癥、高醛固酮血癥、腎功能不全、惡性高熱以及劇烈運(yùn)動(dòng)后等；（2)尿中 升高：撲啉病、血紅蛋白尿癥、血尿等；（3)血、尿中肌紅蛋白均升高：見于急性心肌梗死、心 絞痛、心源性休克、心肌病、肌疾病(進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良、多發(fā)性肌炎、重癥肌無力)等。另外， 測(cè)定血清肌紅蛋白可作為急性心肌梗死(AMI)診斷的早期最靈敏的指標(biāo)。但特異性差，骨骼 肌損傷、創(chuàng)傷、腎功能衰竭等疾病，都可導(dǎo)致其升高。Mb陽性雖不能確診AMI，但可用于早期 排除AMI診斷的重要指標(biāo)，如Mb陰性，則基本排除心肌梗死，還可用于再梗死的診斷，結(jié)合臨 床，如Mb重新升高，應(yīng)考慮為再梗死或者梗死延展。
[0003] 肌鈣蛋白，由T、C、I三亞基構(gòu)成，和原肌球蛋白一起通過調(diào)節(jié)鈣離子對(duì)橫紋肌動(dòng)蛋 白ATP酶的活性來調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白相互作用。當(dāng)心肌損傷后，心肌肌鈣蛋白復(fù)合物 釋放到血液中，4-6小時(shí)后，開始在血液中升高，升高的肌鈣蛋白I能在血液中保持很長時(shí)間 6-10天。肌鈣蛋白I具有高度心肌特異性和靈敏度，所以肌鈣蛋白I已成為目前最理想的心 肌梗死標(biāo)志物。
[0004] 對(duì)心肌損傷的診斷在諸多診斷急性心肌梗死(AMI)的臨床生化指標(biāo)中，CK-MB (血 清心肌酶）曾一度被認(rèn)為是診斷AMI的〃金標(biāo)準(zhǔn)〃，已廣泛應(yīng)用多年.隨著對(duì)心肌肌鈣蛋白 (cTn)深入研究，無論是對(duì)心肌的特異性還是診斷敏感性，CK-MB的地位都受到了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。 cTn被認(rèn)為是目前最好的確定標(biāo)志物，正逐步取代CK-MB成為AMI的診斷〃金標(biāo)準(zhǔn)〃。
[0005] 肌鈣蛋白（cTn)出現(xiàn)早，最早可在癥狀發(fā)作后2h出現(xiàn);具有較寬的診斷窗：cTnT(5 ~14天），cTnI (4~10天）。在它們的診斷窗中，cTn增高的幅度要比CK-MB高5~10倍。由于在 無心肌損傷時(shí)cTn在血液中含量很低，因此也可用于minor mycardial damage(MMD，微小心 肌損傷)的診斷，這是以前酶學(xué)指標(biāo)所難以做到的。cTn還具有判斷預(yù)后的價(jià)值，對(duì)任何冠狀 動(dòng)脈疾患病人，即便ECG或其他檢查（如運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)）陰性，只要cTn增高，應(yīng)視為具有高危險(xiǎn) 性。
[0006] 患有各種冠狀動(dòng)脈疾患的病人必然會(huì)發(fā)生心肌細(xì)胞損傷。有些病人的臨床表現(xiàn)可 能不完全符合WHO關(guān)于AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)(不穩(wěn)定心絞痛就是其中之一），但卻伴有某些心肌損傷 標(biāo)志物(如CTnT等)升高，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的組成成分滲漏入外周血循環(huán)，這使得心肌細(xì)胞 損傷標(biāo)志物的檢測(cè)成為可能。cTnT和cTnl在AMI后(3~6h)血中濃度很快升高，和CK-MB(3~ 8h)相當(dāng)或稍早，它們測(cè)定的特異性和靈敏度明顯高于CK-ΜΒκΤη具有相當(dāng)長的診斷窗口期 (cTnI7~9天，cTnT更長），cTn對(duì)急性胸痛病人(無論有無骨豁肌損傷)的診斷均優(yōu)于CK-MB。 研究表明：在對(duì)AMI的診斷方面cTnl和cTnT無顯著差異，都能鑒別出CK-MB所不能檢測(cè)出的 心肌損傷。相對(duì)CTnT而言，cTnl顯示出較低的初始靈敏性和較高的特異性。就上升的相對(duì)值 來說，cTnT比cTnl高；在不穩(wěn)定心絞痛病人中cTnT上升的頻度比cTnl高。在AMI后30天死亡 率的預(yù)報(bào)方面，cTnT優(yōu)于cTnl。
[0007]無論是不穩(wěn)定心絞痛還是無 Q波的心肌梗死，最初24小時(shí)的CTnT最具預(yù)后價(jià)值。對(duì) 不穩(wěn)定冠狀動(dòng)脈疾患病人的隨訪發(fā)現(xiàn)，cTnT和運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)兩項(xiàng)都正常者，死亡或AMI的僅1%; 若異常，死亡或AMI可達(dá)50%。對(duì)急性冠狀動(dòng)脈疾患（包括心肌梗死)病人的隨訪研究發(fā)現(xiàn)， cTnT小于0.1yg/L的病人的死亡率僅4%，相比而言，大于0.1yg/L的病人的死亡率則大3倍， 發(fā)生休克的百分率大3倍，發(fā)生充血性心功能衰竭的百分率也增加1倍。對(duì)cTnl的觀察研究 得到了類似的結(jié)果。不穩(wěn)定冠狀動(dòng)脈疾患病人中，cTnl大于O.Uig/L的病人死亡率較cTnl小 于〇.lyg/L的病人的死亡率大3倍多。因此，任何急性冠狀動(dòng)脈疾患病人同時(shí)測(cè)得cTn增高， 應(yīng)視為尚危險(xiǎn)性。
[0008] 對(duì)圍手術(shù)期心肌梗死的診斷冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)后心肌梗死的診斷在心臟手術(shù)中有 重要作用，CTn是圍手術(shù)期心肌梗死的敏感和特異的標(biāo)志物，能夠鑒別出沒有達(dá)到常規(guī)圍手 術(shù)期心肌梗死判斷標(biāo)準(zhǔn)的微小的圍手術(shù)期心肌損傷。對(duì)心肌炎的診斷與CK活性相比，心肌 炎時(shí)cTnT因其相對(duì)較高的血清檢測(cè)值和較長的上升時(shí)間而具有較高的檢測(cè)敏感性，血清 cTnT可作為急性心肌炎的診斷標(biāo)志物.與腎功能衰竭的關(guān)系缺血性心臟病是晚期腎病病人 發(fā)病和死亡的主要原因之一，占總死亡率的大約40% ;這些缺血性心臟病中的大約25%發(fā) 展為AMI。因此，在晚期腎臟病病人的臨床治療中，心血管并發(fā)癥的診斷成為至關(guān)重要的問 題。在晚期腎臟病病人血清中，cTnT和cTnl的檢測(cè)值存在著差異.晚期腎臟病病人的cTnT升 高的可能原因有3:檢測(cè)方法的交叉反應(yīng);cTnT在骨骼肌中的重表達(dá);存在著微小心肌損傷。 第2代cTnT分析法不會(huì)因?yàn)閏TnT在晚期腎臟病病人骨骼肌中的重表達(dá)而產(chǎn)生假陽性，從而 排除了分析法的交叉反應(yīng).研究結(jié)果認(rèn)為，晚期腎臟病病人血清中cTnT的升高可能是由于 存在一定程度的心肌損傷。
[0009] 肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)通常存在于動(dòng)物的心臟、肌肉以及腦等組織的細(xì) 胞漿和線粒體中，是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶1， 2，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)。肌酸激酶有四種同功酶形式：肌肉型 (麗）、腦型(BB)、雜化型(MB)和線粒體型(MiMi)。麗型主要存在于各種肌肉細(xì)胞中，BB型主 要存在于腦細(xì)胞中，MB型主要存在于心肌細(xì)胞中，MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌線粒體 中。肌肉型肌酸激酶分子是由兩個(gè)相同的亞基組成的二聚體。根據(jù)目前已經(jīng)測(cè)定的兔、人、 雞、鼠肌酸激酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)，M型亞基由387個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為43KDa左右，分子內(nèi) 有8個(gè)巰基，但無二硫鍵。大熊貓肌肉型肌酸激酶也是二聚體酶，每個(gè)亞基由376個(gè)氨基酸殘 基組成，分子量為42KDa。
[0010] 肌酸激酶的同功酶在臨床診斷中有十分重要的意義，在各種病變包括肌肉萎縮和 心肌梗塞發(fā)生時(shí)，人的血清中肌酸激酶水平迅速提高，目前認(rèn)為在心肌梗塞的診斷中測(cè)定 肌酸激酶的活性比做心電圖更為可靠。心肌梗死時(shí)，肌酸激酶在起病6小時(shí)內(nèi)升高，24小時(shí) 達(dá)高峰，3-4日內(nèi)恢復(fù)正常。其中肌酸激酶的同工酶CK-MB診斷的特異性最高。肌酸激酶因其 具有重要的生理功能和臨床應(yīng)用價(jià)值已引起人們廣泛的重視和深入的研究。
[0011]因此，研究開發(fā)出一種能夠同時(shí)檢測(cè)肌鈣蛋白、肌紅蛋白和肌酸激酶的檢測(cè)方法， 對(duì)于臨床判斷心肌功能，初步針對(duì)心肌梗死等疾病具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn) 便、成本低的心肌功能檢測(cè)用試劑盒，實(shí)現(xiàn)對(duì)肌鈣蛋白、肌紅蛋白和肌酸激酶三種成分的同 時(shí)聯(lián)合檢測(cè)。
[0013] 本發(fā)明的目的還在于提供一種心肌功能檢測(cè)用試劑盒的制備方法。
[0014] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0015] -種心肌功能檢測(cè)用試劑盒，包括塑料板、設(shè)置在塑料板上的玻璃纖維素膜、設(shè)置 在玻璃纖維素膜上的硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上一端設(shè)有樣本墊，對(duì)應(yīng)的另一端 設(shè)有吸水墊，所述玻璃纖維素膜上包被有量子點(diǎn)標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅 蛋白抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體的混合物;所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有檢測(cè)線1、檢 測(cè)線2、檢測(cè)線3和控制線，所述檢測(cè)線1上包被有肌鈣蛋白二抗，所述檢測(cè)線2上包被有肌紅 蛋白二抗，所述檢測(cè)線3上包被有肌酸激酶二抗，所述控制線上包被有羊抗鼠 IgG。
[0016] 所述玻璃纖維上包被的量子點(diǎn)標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體 和量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體的混合物中量子點(diǎn)標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅 蛋白抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體的質(zhì)量比為1:1:1。
[0017] 所述量子點(diǎn)為硒化錦或硫化錦量子點(diǎn)。
[0018] 所述硝酸纖維素膜上設(shè)置的檢測(cè)線1與檢測(cè)線2之間、檢測(cè)線2與檢測(cè)線3之間、檢 測(cè)線1與控制線之間的間隔均不小于5mm。
[0019] 上述心肌標(biāo)志物功能檢測(cè)用試劑盒的制備方法，包括以下操作步驟：
[0020] 1)原材料的制備：
[0021] A:制備玻璃纖維素膜:將量子點(diǎn)標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗 體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合包被在玻璃纖維素膜上，干燥，備用；
[0022] B:制備硝酸纖維素膜:取硝酸纖維素膜，間隔劃分出檢測(cè)線1、檢測(cè)線2、檢測(cè)線3和 控制線，然后將肌鈣蛋白二抗、肌紅蛋白二抗、肌酸激酶二抗、羊抗鼠 IgG分別包被在硝酸纖 維素膜的檢測(cè)線1、檢測(cè)線2、檢測(cè)線3和控制線上，之后將包被后的硝酸纖維素膜放入封閉 液中封閉，干燥，備用；
[0023] 2)組裝:在塑料板上放置步驟1)制備的玻璃纖維素模，然后在步驟1)制備的玻璃 纖維素膜上放置步驟1)制備的硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素的一端放置樣品墊，對(duì)應(yīng) 的另一端放置吸水墊，干燥，即完成。
[0024 ]步驟A中還包括首先制備量子點(diǎn)標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗 體和量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體的混合物，具體方法包括以下操作步驟：
[0025] a:在膠乳顆粒懸濁液中加入改性環(huán)糊精，混勻24小時(shí)，純化，得改性環(huán)糊精-膠乳 復(fù)合物懸濁液；
[0026] b:在步驟a制備的改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入量子點(diǎn)，混勻24小時(shí)，純 化，得量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸池液；
[0027] c:在步驟b制備的量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入活化劑，活化15 分鐘，純化，之后加入肌鈣蛋白抗體，混勻2~4小時(shí)后，離心得沉淀物顆粒，將沉淀物顆粒用 封閉液重懸，室溫混勻1小時(shí)，之后再進(jìn)行純化，即得量子點(diǎn)標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體；
[0028] d:按照上述步驟a~c同樣的方法制備量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記 的肌酸激酶抗體，然后將量子點(diǎn)標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子 點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合，備用；
[0029] 所述改性環(huán)糊精為羧甲基化改性環(huán)糊精或氨基化改性環(huán)糊精。
[0030] 所述活化劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。
[0031 ]步驟c中所述量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液與活化劑的質(zhì)量比為1:10。
[0032 ]步驟B中所用的封閉液為牛血清白蛋白溶液。
[0033] 步驟c中所用的封閉液為牛血清白蛋白溶液。
[0034] 步驟a中所述改性環(huán)糊精與膠乳顆粒的質(zhì)量比為20:1;步驟b中所述量子點(diǎn)與環(huán)糊 精-乳膠復(fù)合物的質(zhì)量比為10:1;步驟c中所述肌鈣蛋白抗體與量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù) 合物的質(zhì)量比為1:20。
[0035]步驟a中膠乳顆粒使用前進(jìn)行純化處理，所述純化處理的具體方法為:取膠乳顆粒 加入第一緩沖液中，離心分離，棄去上清，再用第一緩沖液重懸沉淀物顆粒，然后再離心分 離，棄去上清，再用第一緩沖液重懸沉淀物顆粒，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0036] 上述純化后的膠乳顆粒在使用時(shí)取膠乳顆粒，采用第二緩沖液將膠乳顆粒稀釋成 濃度為l〇mg/ml。
[0037] 上述步驟b中還包括首先將步驟a中制備的改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液，采用 第二緩沖液稀釋成濃度為l〇mg/ml的懸濁液，然后再加入量子點(diǎn)。
[0038] 上述步驟c中還包括首先將步驟b中制備的量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁 液，采用第二緩沖液稀釋成濃度為l〇mg/ml的懸濁液，然后再加入活化劑活化。
[0039] 步驟C中所述封閉后進(jìn)行純化的具體方法為：8000rpm條件下離心15min，棄去上 清，沉淀復(fù)溶于分散液中。
[0040 ]步驟A中將量子點(diǎn)標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記 的肌酸激酶抗體混合包被在玻璃纖維素膜上的具體方法為:將將量子點(diǎn)標(biāo)記的肌鈣蛋白抗 體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合物均勻噴涂于玻璃纖維 素膜上。
[0041 ] 步驟a和步驟b中所述純化的具體方法為:8000rpm條件下離心，棄去上清，沉淀用 第一緩沖液進(jìn)行重懸，之后在SOOOrpm條件下離心，棄去上清，沉淀復(fù)溶于第一緩沖液中。 [0042]步驟c中活化后純化的具體方法為 :8000rpm條件下離心棄去上清，沉淀用第一緩 沖液進(jìn)行重懸。
[0043] 步驟B中將肌鈣蛋白二抗、肌紅蛋白二抗、肌酸激酶二抗、羊抗鼠 IgG分別包被在硝 酸纖維素膜的檢測(cè)線1、檢測(cè)線2、檢測(cè)線3和控制線上的具體方法為:分別取濃度均為Img/ ml的肌鈣蛋白二抗、肌紅蛋白二抗、肌酸激酶抗體和羊抗鼠 IgG，以lul/cm，IOcm/秒的速度 分別噴涂到硝酸纖維的檢測(cè)線1、檢測(cè)線2、檢測(cè)線3和控制線上。
[0044] 步驟1)和步驟2)中所述的干燥為37°C干燥3~5小時(shí)。
[0045] 上述第一緩沖液為0.02M，pH7.4的I3B緩沖液。上述第二緩沖液為0.02M，pH6.1的 MES緩沖液。
[0046] 上述心肌標(biāo)志物功能檢測(cè)用試劑盒在使用時(shí)，將待測(cè)樣品加入試劑盒的樣品墊 上，玻璃纖維素膜上的量子化標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo) 記的肌酸激酶抗體混合物首先特異性的捕捉到待測(cè)樣品中的肌鈣蛋白、肌紅蛋白和肌酸激 酶，然后在達(dá)到檢測(cè)線3時(shí)，量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶-肌酸激酶抗體結(jié)合物與檢測(cè)線3上的肌 酸激酶二抗特異性結(jié)合，在檢測(cè)線2時(shí)，量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體-肌紅蛋白結(jié)合物與檢 測(cè)線2上的肌紅蛋白二抗特異性結(jié)合;在檢測(cè)線1時(shí)，量子點(diǎn)標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體-肌鈣蛋白 結(jié)合物與檢測(cè)線1上的肌鈣蛋白二抗特異性結(jié)合;之后通過檢測(cè)檢測(cè)線1、檢測(cè)線2和檢測(cè)線 3上結(jié)合的量子點(diǎn)的熒光效應(yīng)，定量和定性判斷待測(cè)樣品中肌鈣蛋白、肌紅蛋白和肌酸激 酶。
[0047] 本發(fā)明心肌標(biāo)志物功能檢測(cè)用試劑盒，以量子化標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo) 記的肌紅蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合物包被在玻璃纖維素膜上，作為檢測(cè) 探針，利用雙抗體/抗原夾心原理結(jié)合量子點(diǎn)的熒光特性實(shí)現(xiàn)了采用熒光免疫層析的方法 對(duì)肌鈣蛋白、肌紅蛋白和肌酸激酶進(jìn)行快速、特異、簡(jiǎn)便、靈敏的聯(lián)合檢測(cè)。本發(fā)明心肌標(biāo)志 物功能檢測(cè)用試劑盒檢測(cè)線低，檢測(cè)靈敏度高。
[0048] 本發(fā)明心肌標(biāo)志物功能檢測(cè)用試劑盒的制備方法，操作簡(jiǎn)便，易于控制，適于工業(yè) 化推廣應(yīng)用。
[0049] 進(jìn)一步優(yōu)選的，本發(fā)明制備方法中，創(chuàng)新量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)，采用羧甲基化或氨基化 改性的環(huán)糊精修飾量子點(diǎn)，然后將肌鈣蛋白抗體、肌紅蛋白抗體、肌酸激酶抗體分別結(jié)合在 改性環(huán)糊精的羧甲基基團(tuán)或氨基基團(tuán)上，實(shí)現(xiàn)制備獲得量子點(diǎn)標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子 點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體。
【附圖說明】：
[0050] 圖1是采用實(shí)施例1制備的試劑盒檢測(cè)肌鈣蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值與實(shí)際濃度之間 對(duì)應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0051] 圖2是采用實(shí)施例1制備的試劑盒檢測(cè)肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值與實(shí)際濃度之間 對(duì)應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0052] 圖3是采用實(shí)施例1制備的試劑盒檢測(cè)肌酸激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值與實(shí)際濃度之間 對(duì)應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0053] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0054] 實(shí)施例1
[0055]本實(shí)施例心肌標(biāo)志物功能檢測(cè)用試劑盒，包括塑料板、設(shè)置在塑料板上的玻璃纖 維素膜、設(shè)置在玻璃纖維素膜上的硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上一端設(shè)有樣本墊，對(duì) 應(yīng)的另一端設(shè)有吸水墊，所述玻璃纖維素膜上包被有質(zhì)量比為1:1:1的量子點(diǎn)標(biāo)記的肌鈣 蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體的混合物;所述硝酸 纖維素膜上設(shè)置有檢測(cè)線1、檢測(cè)線2、檢測(cè)線3和控制線，所述檢測(cè)線1上包被有肌鈣蛋白二 抗，所述檢測(cè)線2上包被有肌紅蛋白二抗，所述檢測(cè)線3上包被有肌酸激酶二抗，所述控制線 上包被有羊抗鼠 IgG;所述量子點(diǎn)為硒化錦量子點(diǎn)。
[0056]本實(shí)施例心肌標(biāo)志物功能檢測(cè)用試劑盒的制備方法，具體操作步驟為：
[0057] 1)制備玻璃纖維素膜：
[0058] a:取Iml未標(biāo)記膠乳顆粒加入IOml，0.02M，pH7.41?緩沖液中；離心機(jī)1000 Orpm離 心20min;去掉上清液，再用IOml，0.02M，pH7.4PB緩沖液重懸沉淀顆粒物；之后再離心機(jī) 1000 Orpm離心20min，去掉上清并用5ml0.02M，pH7.4JB緩沖液重懸沉淀顆粒物，4°C保存待 用；
[0059] b:取步驟a制備的膠乳顆粒用0.02M，pH6.1的MES緩沖液將膠乳顆粒稀釋至IOmg/ ml，取0.05ml稀釋后的膠乳顆粒懸濁液加入IOmg羧甲基化改性環(huán)糊精，混勻24小時(shí)后，離心 機(jī)8000rpm離心，棄去上清，并用0.02M，pH7.4的I 3B緩沖液重懸沉淀顆粒物，之后再次離心機(jī) 8000rpm離心，棄去上清，沉淀顆粒物復(fù)溶于0.02M，pH7.4的PB緩沖液中，得羧甲基化改性環(huán) 糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液；
[0060] C:取步驟b制備的羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液，用0.02M，pH6.1的MES 緩沖液將其稀釋至l〇mg/ml，取20ml稀釋后的羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合懸濁液，加入 20mg硒化鎘量子點(diǎn)，混勻24小時(shí)，離心機(jī)8000rpm離心，棄去上清，并用0.02M，pH7.4的PB緩 沖液重懸沉淀顆粒物，之后再次離心機(jī)8000rpm離心，棄去上清，沉淀顆粒物復(fù)溶于0.02M， pH7.4的PB緩沖液中，得量子點(diǎn)-羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液；
[0061] d:取步驟c制備的量子點(diǎn)-羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液，用0.02M， pH6.1的MES緩沖液將其稀釋至10mg/ml，然后按照量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物與活化 劑的質(zhì)量比為1:10,加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，活化15分鐘后， 8000rpm離心，棄去上清，并用0.02M，pH7.4的I 3B緩沖液重懸沉淀物顆粒，之后按照肌鈣蛋白 抗體:量子點(diǎn)-羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物= 1:20的比例加入肌鈣蛋白抗體，混勻3小 時(shí)后，8000rpm離心15分鐘，將沉淀物顆粒用封閉液重懸，室溫混勻1小時(shí)，之后8000rpm離心 15min，沉淀顆粒物復(fù)溶于分散液，即得量子點(diǎn)標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體；
[0062] e:按照上述步驟a~c同樣的方法制備量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記 的肌酸激酶抗體，然后將量子點(diǎn)標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子 點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合，噴涂于玻璃纖維素模上，37°C干燥4小時(shí)，即得量子點(diǎn)標(biāo)記的 肌鈣蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合物標(biāo)記的玻 璃纖維素膜；
[0063] 2)制備硝酸纖維素膜:取硝酸纖維素膜，間隔6mm依次劃分檢測(cè)線3、檢測(cè)線2、檢測(cè) 線1和控制線，之后取濃度均為lmg/ml的肌鈣蛋白二抗、肌紅蛋白二抗、肌酸激酶二抗、羊抗 鼠 IgG，以lul/Cm，10cm/秒的速度分別噴涂到硝酸纖維膜的檢測(cè)線1、檢測(cè)線2、檢測(cè)線3和控 制線上，之后將硝酸纖維素膜放入牛血清白蛋白溶液中封閉，37°C干燥3小時(shí)，即得所述的 硝酸纖維素膜；
[0064] 3)組裝:在塑料板上放置步驟1)制備的玻璃纖維素模，在步驟1)制備的玻璃纖維 素膜上放置步驟2)制備的硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素的一端放置樣品墊，對(duì)應(yīng)的另 一端放置吸水墊，37 °C干燥5小時(shí)，即完成。
[0065] 實(shí)施例2
[0066] 本實(shí)施例心肌標(biāo)志物功能檢測(cè)用試劑盒，與實(shí)施例不同的地方在于，采用的量子 點(diǎn)為硫化鎘量子點(diǎn)，采用的改性環(huán)糊精為氨基化干性環(huán)糊精，制備肌鈣蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo) 記的肌紅蛋白抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體的過程中，在活化的量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳懸濁液中加入抗體或抗原的混勻時(shí)間為2小時(shí)，其他同實(shí)施例1。
[0067] 實(shí)施例3
[0068] 本實(shí)施例心肌標(biāo)志物功能檢測(cè)用試劑盒，與實(shí)施例不同的地方在于，制備肌鈣蛋 白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體的過程中，在活化的量 子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳懸濁液中加入抗體或抗原的混勻時(shí)間為4小時(shí)，其他同實(shí)施例1。
[0069] 試驗(yàn)例：
[0070] 將肌紅蛋白稀釋為0 · 1953125ug/L、0 · 390625ug/L、0 · 78125ug/L、1 · 5625ug/L、 3.125ug/L、6.25ug/L、12.5ug/L、25ug/L、50ug/L、100ug/L、200ug/L;肌鈣蛋白稀釋為 0·1953125ug/L、0·390625ug/L、0·78125ug/L、1·5625ug/L、3·125ug/L、6·25ug/L、12·5ug/ 1、251^/1、50呢/1、100耶/1 ;肌酸激酶稀釋為0.1953125呢/1、0.3906251^/1、0.78125邶/1、 I · 5625ug/L、3 · 125ug/L、6 · 25ug/L、12 · 5ug/L、25ug/L、50ug/L、lOOug/L作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并 同時(shí)配制空白溶液。
[0071] 分別取各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品IOOul分別加入到實(shí)施例1制備的試劑盒的樣品墊上，5min 后將顯色完成的試劑盒放入熒光免疫層析讀數(shù)儀(南京美寧康誠生物科技有限公司）重，讀 取相應(yīng)檢測(cè)線的發(fā)光值，并記錄各濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)的發(fā)光值與實(shí)際濃度之間的對(duì)應(yīng)關(guān) 系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1~圖3所示，肌鈣蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y = _〇.〇〇〇〇〇〇04x2+ 0·00088χ+0· 09312，R2 = 0.99862;肌紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y = -0 ·0000005χ2+ 0.00336χ+0.02718，R2 = 0.99967 ;肌酸激酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y = -0.00005x2+ 0.2899x+0.0573，R2 = 0.99974，由上述標(biāo)準(zhǔn)曲線可知本發(fā)明制備的試劑盒針對(duì)肌紅蛋白的 最低檢測(cè)限為21yg/L、肌鈣蛋白的最低檢測(cè)限為3ng/L、肌酸激酶最低檢測(cè)限為0.3yg/L。
[0072] 另外，取空白溶液加入到實(shí)施例1制備的試劑盒中，未檢測(cè)到熒光效應(yīng)。
[0073] 取100例隨機(jī)的臨床樣本，采用本發(fā)明實(shí)施例1制備的試劑盒對(duì)血清中肌鈣蛋白、 肌紅蛋白和肌酸激酶的濃度進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)。檢測(cè)方法為：IOOul待測(cè)樣品（50ul樣品+50ul樣 品稀釋液)滴入試劑盒樣本墊上，5min后將顯色完成的標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品的試紙條放入熒 光免疫層析讀數(shù)儀(南京美寧康誠生物科技有限公司）中，讀取T/C線的發(fā)光值，并記錄，將 待測(cè)樣品T/C值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到肌鈣蛋白、肌紅蛋白、肌酸激酶的濃度，結(jié)果如下表1 所示：
[0074] 表 1





[0081] 由此可見，本方法可以直接定量檢測(cè)心肌三項(xiàng)，不需專業(yè)培訓(xùn)，操作方便，快速， IOmin即可獲得結(jié)果，適合在基層醫(yī)院和體檢中心推廣和運(yùn)用。
[0082] 最后應(yīng)說明的是：以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制;盡管 參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可 以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換； 而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精神和 范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種心肌功能檢測(cè)用試劑盒，包括塑料板、設(shè)置在塑料板上的玻璃纖維素膜、設(shè)置在 玻璃纖維素膜上的硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上一端設(shè)有樣本墊，對(duì)應(yīng)的另一端設(shè) 有吸水墊，其特征在于，所述玻璃纖維素膜上包被有量子點(diǎn)標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo) 記的肌紅蛋白抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體的混合物;所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有檢 測(cè)線1、檢測(cè)線2、檢測(cè)線3和控制線，所述檢測(cè)線1上包被有肌鈣蛋白二抗，所述檢測(cè)線2上包 被有肌紅蛋白二抗，所述檢測(cè)線3上包被有肌酸激酶二抗，所述控制線上包被有羊抗鼠 lgG。2. 如權(quán)利要求1所述的心肌功能檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，所述玻璃纖維上包被的量 子點(diǎn)標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體的混 合物中量子點(diǎn)標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶 抗體的質(zhì)量比為1:1:1。3. 如權(quán)利要求1所述的心肌功能檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，所述量子點(diǎn)為硒化鎘或硫 化錦量子點(diǎn)。4. 如權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的心肌功能檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，所述硝酸纖維 素膜上設(shè)置的檢測(cè)線1與檢測(cè)線2之間、檢測(cè)線2與檢測(cè)線3之間、檢測(cè)線1與控制線之間的間 隔均不小于5mm。5. -種如權(quán)利要求1所述的心肌功能檢測(cè)用試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下 操作步驟： 1) 原材料的制備： A:制備玻璃纖維素膜:將量子點(diǎn)標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體、量 子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合包被在玻璃纖維素膜上，干燥，備用； B:制備硝酸纖維素膜:取硝酸纖維素膜，間隔劃分出檢測(cè)線1、檢測(cè)線2、檢測(cè)線3和控制 線，然后將肌鈣蛋白二抗、肌紅蛋白二抗、肌酸激酶二抗、羊抗鼠 lgG分別包被在硝酸纖維素 膜的檢測(cè)線1、檢測(cè)線2、檢測(cè)線3和控制線上，之后將包被后的硝酸纖維素膜放入封閉液中 封閉，干燥，備用； 2) 組裝:在塑料板上放置步驟1)制備的玻璃纖維素膜，然后在步驟1)制備的玻璃纖維 素膜上放置步驟1)制備的硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素的一端放置樣品墊，對(duì)應(yīng)的另 一端放置吸水墊，干燥，即完成。6. 如權(quán)利要求5所述的心肌功能檢測(cè)用試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟A中還包 括首先制備量子點(diǎn)標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸 激酶抗體的混合物，具體方法包括以下操作步驟： a:在膠乳顆粒懸濁液中加入改性環(huán)糊精，混勻24小時(shí)，純化，得改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合 物懸濁液； b:在步驟a制備的改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入量子點(diǎn)，混勻24小時(shí)，純化，得 量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸池液； c:在步驟b制備的量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入活化劑，活化15分 鐘，純化，之后加入肌鈣蛋白抗體，混勻2~4小時(shí)后，離心得沉淀物顆粒，將沉淀物顆粒用封 閉液重懸，室溫混勻1小時(shí)，之后再進(jìn)行純化，即得量子點(diǎn)標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體； d:按照上述步驟a~c同樣的方法制備量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的肌 酸激酶抗體，然后將量子點(diǎn)標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點(diǎn)標(biāo) 記的肌酸激酶抗體混合，備用。7. 如權(quán)利要求6所述的心肌功能檢測(cè)用試劑盒的制備方法，其特征在于，所述改性環(huán)糊 精為羧甲基化改性環(huán)糊精或氨基化改性環(huán)糊精。8. 如權(quán)利要求6所述的心肌功能檢測(cè)用試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟a中所述 改性環(huán)糊精與膠乳顆粒的質(zhì)量比為20:1;步驟b中所述量子點(diǎn)與環(huán)糊精-乳膠復(fù)合物的質(zhì)量 比為10:1;步驟c中所述肌鈣蛋白抗體與量子點(diǎn)-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物的質(zhì)量比為1:20。9. 如權(quán)利要求6所述的心肌功能檢測(cè)用試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟A中將量 子點(diǎn)標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合 包被在玻璃纖維素膜上的具體方法為:將量子點(diǎn)標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的肌紅 蛋白抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合物均勻噴涂于玻璃纖維素膜上。10. 如權(quán)利要求6所述的心肌功能檢測(cè)用試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟B中將肌 鈣蛋白二抗、肌紅蛋白二抗、肌酸激酶二抗、羊抗鼠 lgG分別包被在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線 1、檢測(cè)線2、檢測(cè)線3和控制線上的具體方法為:分別取濃度均為lmg/ml的肌鈣蛋白二抗、肌 紅蛋白二抗、肌酸激酶二抗和羊抗鼠 IgG，以lul/cm，10cm/秒的速度分別噴涂到硝酸纖維的 檢測(cè)線1、檢測(cè)線2、檢測(cè)線3和控制線上。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105842463SQ201610326801
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月17日
【發(fā)明人】金鑫, 曾濱, 趙正道
【申請(qǐng)人】北京美康基因科學(xué)股份有限公司