專利名稱：快速檢測異丙草胺、異丙甲草胺殘留的膠體金試紙的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于果蔬及原糧類食品中異丙草胺、異丙甲草胺殘留檢測試紙及其檢測方法，屬膠體金免疫檢測領域。
背景技術：
由于蔬菜生長期短且病蟲害較為嚴重，因而，在蔬菜種植過程中常常需要連續(xù)多次施藥。現(xiàn)代化蔬菜種植中用除草劑除草代替人工除草，提高勞動效率。而不少蔬菜需要多次采收，采收與施藥的時間間隔短，造成采收時蔬菜中的農(nóng)藥殘留量往往較高，很容易超過國家規(guī)定的標準。而蔬菜中農(nóng)藥殘留量超標會嚴重影響人類健康水平，已成為不容忽視的食品污染源。政府和各職能部門對食品的農(nóng)藥殘留問題十分關注。但由于農(nóng)藥的毒性和害蟲的抗藥性形成一個惡性循環(huán)，因此全面徹底禁止高劇毒農(nóng)藥的使用將有一個較長的過程，即使是全面使用中、低毒農(nóng)藥，農(nóng)藥惡性中毒事件仍然發(fā)生。因此對分析檢測的對象、種類、數(shù)量、范圍、指標等諸多方面都提出了新的要求和更高標準。
異丙草胺、異丙甲草胺均為低毒除草劑，對光不易分解，對皮膚輕微刺激，被列為農(nóng)藥殘留的重要檢測對象。異丙草胺(2-氯-N-(2-乙基-6-甲基苯)-N-[(1-甲基乙氧基)甲基]乙酰胺)，選擇性酰胺類除草劑，可被植物幼芽吸收，進入植物體內(nèi)抑制蛋白酶合成。芽前芽后早期土壤噴霧處理，可防除玉米、大豆、馬鈴薯等作物田中一年生禾本科雜草和某些闊葉雜草。異丙甲草胺(2-乙基-6-甲基-N-(1′-甲基-2′-甲氧乙基)氯代乙酰替苯胺)，選擇性酰胺類除草劑，作用特點與異丙草胺相似。適用于花生、大豆、蔬菜、玉米、甘蔗、瓜地等旱地作物除草，主要防除馬唐、牛筋草、狗尾草及馬齒莧、野莧菜、碎米莎草、油莎草等。
目前，檢測農(nóng)藥殘留的分析方法主要是依靠、氣相色譜法(GC)或氣相色譜與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用法(GC/MS)。“酶抑制率法+分光光度法”已被列為國家推薦標準(GB/T 5009.199-2003)。該法快速、靈敏、操作簡便且成本低廉，可實現(xiàn)快速初篩，但受檢測范圍和精度的限制。而氣相色譜法(GC)可實現(xiàn)精度的定量分析但速度較慢，檢測成本較高?？傊@些方法普遍存在著樣品前處理過程復雜，靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響很大，耗時，檢測設備昂貴，并要求有專業(yè)的技術人員及較長的分析周期。
因此，利用競爭法原理，在傳統(tǒng)免疫檢測法的基礎上引入了膠體金快速檢測技術，研制出異丙草胺、異丙甲草胺膠體金競爭法檢測試紙。該方法具有快速、靈敏、操作簡便、成本低、無需專業(yè)人員檢測，真正達到復雜原理與簡易操作的有機統(tǒng)一，同時具有保存方便，有效期長的特點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述存在的一些問題，提供了一種適用于檢測農(nóng)藥異丙草胺、異丙甲草胺是否超標的膠體金測定試紙。
為解決上述技術問題，本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的在農(nóng)藥殘留檢測試紙底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗線和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線，在底板一端端頭為吸水層，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水層和單克隆抗體金標墊相互交疊連接(交疊連接部分在1-2毫米范圍)，在單克隆抗體金標墊上壓有樣品吸液層。關于底板、硝酸纖維素膜、吸水紙、膠體金標墊的組合方法按專利CN 2741052Y執(zhí)行。
農(nóng)藥異丙草胺或異丙甲草胺殘留檢測試紙的控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被而成，試驗線檢測異丙草胺是由異丙草胺合成免疫原包被、檢測異丙甲草胺是由異丙甲草胺合成免疫原包被。把檢測異丙草胺或異丙甲草胺殘留的膠體金試紙的樣品吸液層端放入果汁、蔬菜浸汁中，由于毛細管作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，當移動至單克隆抗體金標墊時，樣品中的異丙草胺與異丙草胺單克隆抗體金標探針、異內(nèi)甲草胺與異丙甲草胺單克隆抗體金標探針發(fā)生特異結合，當移動至固定有異丙草胺合成免疫原試驗線、異丙甲草胺合成免疫原試驗線時，由于異丙草胺單克隆抗體金標墊中的抗體與樣品中異丙草胺、異丙甲草胺單克隆抗體金標墊中的抗體與樣品中異丙甲草胺優(yōu)先結合成復合物而失去其與異丙草胺或異丙甲草胺合成免疫原結合，因此其膠體金不能滯留于試驗線上，試驗線處沒有紅色線顯示，即只有一條紅色控制線為陽性；相反如果樣品中沒有異丙草胺、異丙甲草胺，單克隆抗體金標墊中的抗體移動到試驗線上，異丙草胺單克隆抗體就會與異丙草胺合成免疫原、異丙甲草胺單克隆抗體就會與異丙甲草胺合成免疫原發(fā)生特異結合，使膠體金滯留于試驗線上，即二條紅色線為陰性，這就是免疫競爭法原理。試驗線的顏色深淺與樣品中異丙草胺或異丙甲草胺含量高低成反比。從陽性過渡到陰性，由于所測異丙草胺或異丙甲草胺含量不同，試驗線的顏色也不同，形成一個紅色顏色梯度差，以這種原理檢測出OD值，從而推斷出試驗線所反應實際異丙草胺或異丙甲草胺的量。
用競爭法制成試紙其檢測農(nóng)藥設定檢出量以上，觀察窗處出現(xiàn)一條紅線為陽性；設定檢出量以下出現(xiàn)雙紅線為陰性；設定檢出量時在試驗線處為一條模糊陰影線為界限值，從而得出判斷。
當移動至羊抗鼠多克隆抗體控制線時，無論樣品中有無異丙草胺、異丙甲草胺，標記的金標探針都會與已設定好的羊抗鼠多克隆抗體結合滯留，使控制線顯示紅色。因此控制線無色帶產(chǎn)生則代表操作有誤，檢測時樣品液面超過MAX線或試紙已經(jīng)過期。
由于采用上述技術方案，本發(fā)明所提供的一種快速檢測異丙草胺、異丙甲草胺殘留的膠體金試紙具有這樣的有益效果，即特異性強，靈敏度高，易儲存，無須專門技術人員操作，而且結果易讀。


圖1為本發(fā)明一種快速檢測異丙草胺、異丙甲草胺殘留的膠體金試紙的主視結構圖。
圖2為發(fā)明圖1的側視結構圖。
圖3為檢測顯示陽性結果圖。
圖4為檢測顯示陰性結果圖。
圖中1、吸水板，2、硝酸纖維素膜，3、羊抗鼠多克隆抗體控制線，4、試驗線，5、單克隆抗體金標墊，6、樣品吸液層，7、底板，8、MAX線。
具體實施例1.根據(jù)異丙草胺分子結構，推斷其分子中的抗原決定區(qū)，選用異丙草胺農(nóng)藥原藥經(jīng)化學反應合成一種與異丙草胺分子結構相近的且具有羧基或氨基等易于蛋白質(zhì)大分子相連接基團的分子結構(半抗原)。在縮合劑作用下使半抗原小分子與蛋白質(zhì)大分子相連接制得異丙草胺免疫抗原。異丙甲草胺抗原制備方法同異丙草胺。
2.單克隆抗體的制備(1)將制備的異丙草胺合成免疫原、異丙甲草胺合成免疫原免疫BALB/c小鼠。用SP2/0細胞融合建立瘤株進行篩選，取瘤細胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其產(chǎn)生腹水。
(2)提取小鼠腹水純化篩選，獲得能與異丙草胺結合的單克隆抗體用于膠體金標記。異丙甲草胺單克隆抗體制備方法同異丙草胺。
3.膠體金的制備及與單克隆抗體的結合(1)取雙蒸水加適量的氯金酸磁力攪拌加溫到85～95℃，加入適量檸檬酸三納繼續(xù)加熱攪拌至沸騰3～10分鐘，冷卻后避光保存?zhèn)溆谩?br> (2)把異丙草胺單克隆抗體標記的膠體金液，吸附纖維材料上，干燥后備用。
異丙甲草胺單克隆抗體結合膠體金方法同異丙草胺。
4.制膜機制膜利用電腦控制傳動速度，保證每單位膜上包被的抗體量相等。
5.試紙條組合見說明書附圖圖2，方法同專利CN 2741052Y。
6.使用方法把試紙的樣品吸液層端放入蔬菜浸汁中(液面不得超過MAX線圖中8)，1分鐘后取出試紙平放，由于毛細管和虹吸作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，5分鐘時觀察結果。
7.結果判斷若該試紙的最低檢出量設定為0.1mg/kg，則檢測異丙草胺濃度0.1mg/kg以上，觀察窗處出現(xiàn)一條紅線為陽性；0.1mg/kg以下出現(xiàn)雙紅線為陰性；0.1mg/kg時在試驗線處為一條模糊陰影線為界限值，此界限值為國家頒布的蔬菜農(nóng)藥殘留檢測標準0.1mg/kg。從而得出判斷。低于0.1mg/kg以下的界限值采取色標對比方法判斷劑量。
權利要求1.一種快速檢測異丙草胺、異丙甲草胺殘留的膠體金試紙，其特征在于是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、異丙草胺或異丙甲草胺單克隆抗體金標墊(5)、樣品吸液層(6)、MAX線(8)組成；底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗線(4)和一條多克隆抗體控制線(3)，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和單克隆抗體金標墊相互交疊連接，在單克隆抗體金標墊上壓有樣品吸液層。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種快速檢測異丙草胺殘留的膠體金試紙、異丙甲草胺殘留的膠體金試紙，其特征在于控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被制成。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種快速檢測異丙草胺、異丙甲草胺殘留的膠體金試紙，其特征在于試驗線是由異丙草胺或異丙甲草胺合成免疫原包被制成。
4.根據(jù)權利要求1或3所述的一種快速檢測異丙草胺、異丙甲草胺殘留的膠體金試紙，其特征在于根據(jù)調(diào)節(jié)金標墊和試驗線包被物的成分，此試紙可以檢測異丙草胺、異丙甲草胺原藥或混合物。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種快速檢測異丙草胺、異丙甲草胺殘留的膠體金試紙，其特征在于金標墊是由異丙草胺單克隆抗體、異丙甲草胺單克隆抗體作為膠體金標記。
6.根據(jù)權利要求1所述一種快速檢測異丙草胺、異丙甲草胺殘留的膠體金試紙，其特征在于試驗線的檢測值設定為最低檢出量為異丙草胺0.02～0.5mg/kg、異丙甲草胺0.5～1mg/kg。
專利摘要一種快速檢測異丙草胺、異丙甲草胺殘留的膠體金試紙，由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、單克隆抗體金標墊、樣品吸液層組成。底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有異丙草胺合成免疫原試驗線或異丙甲草胺合成免疫原試驗線和一條多克隆抗體控制線，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和單克隆抗體金標墊相互交疊連接，在單克隆抗體金標墊上壓有樣品吸液層，通過膠體金免疫競爭方法制成試紙，利用免疫膠體金法來檢測果蔬中的異丙草胺或異丙甲草胺殘留量是否超標。該方法具有快速、靈敏、操作簡便、成本低、無需專業(yè)人員檢測，真正達到復雜原理與簡易操作的有機統(tǒng)一，同時具有保存方便，有效期長的特點。
文檔編號G01N21/78GK2869867SQ20052014262
公開日2007年2月14日 申請日期2005年12月6日 優(yōu)先權日2005年12月6日
發(fā)明者萬積成 申請人:萬積成