專利名稱：酶法快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的制作方法
背景技術：
發(fā)明領域本發(fā)明涉及一種用于快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽(γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸)的方法，更特定地涉及一種方法，通過將GSH誘捕劑處理樣品的步驟引入到采用氧化劑和谷胱甘肽還原酶的常規(guī)酶法分析谷胱甘肽中，可同時定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽(GSSG·GSH)。
盡管正常生理條件下產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)(ROS)持續(xù)氧化谷胱甘肽，但還原型谷胱甘肽由使用了胞內(nèi)谷胱甘肽還原酶和NADPH的胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)在體內(nèi)維持了恒定分布。在正常的好氧微生物中，ROS作用受到細胞抗氧化防御系統(tǒng)的控制，即當細胞由于ROS變成氧化態(tài)時，ROS將GSH氧化成GSSG，因而細胞中GSH水平下降，然后正常細胞分泌GSSG到細胞外以維持GSH/GSSG比率恒定。然而，多種因素如輻射、疾病或藥物所引發(fā)的過量生成ROS導致了氧化性應力、ROS和抗氧化防御系統(tǒng)嚴重不平衡，這又反過來導致疾病狀態(tài)如發(fā)炎、免疫損傷、局部缺血、藥物和毒素誘導的反應以及衰老。因此，細胞抗氧化系統(tǒng)是細胞內(nèi)維持穩(wěn)態(tài)重要控制機理之一。
由于細胞中谷胱甘肽狀態(tài)反映了細胞的還原/氧化狀態(tài)，因此測定還原型和氧化型谷胱甘肽將指示細胞還原/氧化狀態(tài)。為使谷胱甘肽用作細胞還原/氧化狀態(tài)的指數(shù)，不僅谷胱甘肽總量重要，而且GSH/GSSG比率即氧化程度也同樣重要，因此必須準確定量測定GSH和GSSG。
定量測定谷胱甘肽的方法劃分為色譜法、酶法和化學法，即使用HPLC(高效液相色譜)法、采用分光光度計分析酶活性方法以及使用已知與谷胱甘肽特異性反應的鄰苯二醛(OPT)法(參見Sies，H.，生物樣品中谷胱甘肽、谷胱甘肽二硫化物和谷胱甘肽混合二硫化物的分析，Methods Enzymol.，77373-383，1981；Tietze，酶法定量測定納克量的總谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽哺乳動物血和其它組織中的應用，Anal.Biochem.，27502-522，1969；Mokrasch，l.C.和Teschike，E.J.，培養(yǎng)細胞和嚙齒動物腦區(qū)域的谷胱甘肽含量一種特異性的熒光測定法，Anal.Biochem.，140506-509，1984)。
使用HPLC的色譜法為一種定量測定方法，采用光吸收物質(zhì)或熒光物質(zhì)處理含谷胱甘肽的樣品，然后測定由HPLC分離的物質(zhì)的熒光或吸光度，它能檢測谷胱甘肽10-9摩爾的較低水平，但也有一些缺點如每個HPLC分析循環(huán)耗時超過30分鐘，一個樣品需要兩次HPLC循環(huán)分析來單獨測定GSH和GSSG，因此該法費時而且不適用分析大批量樣品。
酶法為另一種定量測定方法，包括使用氧化劑如DTNB(5，5′-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸))和谷胱甘肽還原酶的方法、乙二醛酶法即測定由乙二醛酶I催化GSH和甲基乙二醛間反應所產(chǎn)生的乳酰谷胱甘肽以及使用GSH轉移酶生產(chǎn)氯代二硝基苯和GSH混合物的方法。酶法具有樣品分析快速的優(yōu)點(僅幾分鐘)。然而在一些意義上證明這些方法不令人滿意，如處理樣品困難，為偶爾需要的一些反應步驟費力準備許多試劑，各種試劑僅能在每次樣品分析時加入分析前混合，對溫度和環(huán)境條件敏感的酶和試劑每隔一些時間應重新制備。
另一個用于定量測定谷胱甘肽相對簡單的方法是熒光法，在沒有其它巰基化合物情況下其應用了OPT與GSH或GSSG形成熒光復合體的特性。使用OPT的熒光法簡單而且可用于分析大批量樣品，但是也暴露出由于胞內(nèi)存在其它含硫化合物和氨基酸抑制了OPT與GSH或GSSG的反應從而導致特異性降低，以及不適用于組織樣品，因為使用OPT測定經(jīng)NEM(N-乙基馬來酰亞胺)處理的樣品中的GSSG是在高pH條件下進行的。近來將如前所述的方法應用到多孔板中的方法也不合適。
在這些狀況下，強烈需要探索和開發(fā)可同時定量測定GSH和GSSG的簡便而準確的方法。
因此本發(fā)明的主要目的就是提供一種方法，其通過采用氧化劑、谷胱甘肽還原酶和GSH誘捕劑同時定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽。


圖1b為經(jīng)NEM處理的樣品中GSSG和GSH的HPLC層析譜。
圖2為用DTNB和谷胱甘肽還原酶處理一定時間的樣品中所產(chǎn)生的TNB吸光度測定圖。
圖3a為Bradford法建立的蛋白標準曲線。
圖3b為表示吸光度曲線的斜率變化的GSH標準曲線。
圖3c為表示吸光度曲線的斜率變化的GSSG標準曲線。
圖4a表示隨著組織樣品量的增加，代表測定的總谷胱甘肽量的吸光度曲線斜率變化。
圖4b表示隨著組織樣品量的增加，代表測定的GSSG量的吸光度曲線斜率變化。
發(fā)明詳述用于快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法包括下列步驟獲取組織樣品然后制備代謝阻斷的組織勻漿；用和不用GSH誘捕劑的情況下制備等體積的勻漿級分，并在每個級分中加入磷酸緩沖液、蒸餾水和NADPH溶液；在每個級分中加入谷胱甘肽還原酶和氧化劑以啟動反應；和采用和不用GSH誘捕劑的情況下測定包含所述級分的反應混合物的吸光度，以分別定量氧化型谷胱甘肽(GSSG)和總谷胱甘肽，然后從總谷胱甘肽中減去GSSG量以確定還原型GSH量。
定量測定胞內(nèi)谷胱甘肽的方法用下列步驟進一步闡述。步驟1樣品制備組織樣品制備產(chǎn)生代謝阻斷的組織勻漿組織樣品從動物和植物來源中獲得，-70℃冷凍干燥，并用5％PCA(高氯酸)溶液處理產(chǎn)生代謝阻斷的組織勻漿。步驟2GSH失活在使用和不用GSH誘捕劑的情況下制備等體積的勻漿級分，然后將磷酸緩沖液、蒸餾水和NADPH溶液加入到每個級分中N-乙基馬來酰亞胺(NEM)優(yōu)選用作GSH誘捕劑，其優(yōu)選加入到級分中使終濃度達到20-100mM，2-3個體積的磷酸緩沖液優(yōu)選加入到級分中使終濃度達到50-150mM，6-7個體積的蒸餾水優(yōu)選加入到級分中，以及20-30％(v/v)的NADPH溶液優(yōu)選加入到級分中使終濃度達到0.1-0.3mM。步驟3反應每個級分中加入谷胱甘肽還原劑和氧化劑啟動反應10-15％(v/v)的谷胱甘肽還原酶優(yōu)選加入到級分中使終濃度達到0.05-0.2U/ml，5，5’-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)優(yōu)選用作氧化劑，其以10-15％(v/v)的濃度優(yōu)選加入到級分中，使終濃度達到0.02-01mM。步驟4吸光度測定氧化型谷胱甘肽(GSSG)和總谷胱甘肽分別通過在采用和不用GSH誘捕劑的情況下測定含有級分的分析混合物的吸光度來進行定量，然后從總谷胱甘肽中減去GSSG的量來確定還原型谷胱甘肽(GSH)的量吸光度優(yōu)選在405nm處測定。
由于組織或細胞中的谷胱甘肽在抽提過程中易受到胞內(nèi)谷胱甘肽代謝相關酶的破壞，因此必須留意在使用本發(fā)明方法進行定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽時，分析結果可能不反映組織樣品中的本質(zhì)狀態(tài)。本發(fā)明方法存在的另一個問題是樣品中存在的氧和金屬離子在為測定谷胱甘肽量處理樣品的步驟過程中將與還原型谷胱甘肽(GSH)的硫氫基團反應從而產(chǎn)生氧化型谷胱甘肽(GSSG)。在這種情況下，總谷胱甘肽的量保持不變，但可以預期與組織實際存在的量相比GSH值偏低而GSSG值偏高。因此，所述問題應被克服以正確測定出胞內(nèi)GSH和GSSG量。為此，本發(fā)明采用了一個策略以阻斷從動物獲得的組織樣品中谷胱甘肽的變化，從而準確測定組織樣品中GSH和GSSG量。即，由于組織樣品中谷胱甘肽的還原/氧化比率在組織樣品從動物獲得后受到代謝相關酶如谷胱甘肽還原酶和NADPH的影響，因此本發(fā)明中，這些由代謝引起的谷胱甘肽還原型/氧化型比率的變化通過立即冷凍-固定(freeze-clamp)取出的組織樣品而阻斷。組織樣品用液態(tài)氮固定和冷凍并儲存于-70℃直到使用。根據(jù)本發(fā)明，阻斷取出的組織樣品的代謝的另一個策略就是在蛋白變性劑5％(v/v)PCA溶液存在下通過使冷凍組織樣品勻漿化而將代謝相關酶變性。
定量測定GSSG的方法需要預先去除樣品中GSH。為準確定量測定胞內(nèi)氧化型谷胱甘肽，還應預防組織樣品從動物獲得后GSH人工氧化成GSSG，而預防GSH氧化能通過掩蔽GSH的硫氫基團達到。為此目的，本發(fā)明人采用了掩蔽樣本中GSH策略，采用GSH誘捕劑如NEM，通過與谷胱甘肽的硫氫基團形成共價鍵而抑制硫氫基團間形成二硫鍵連接。NEM在中性pH時反應速率快至少于1分鐘，使得其用途很有效。由于NEM也抑制了谷胱甘肽還原酶的活性，殘余NEM在完成掩蔽GSH后去除，因此根據(jù)本發(fā)明，為用于GSSG分析，含有NEM的反應混合物用等體積的乙醚抽提以去除殘留NEM。
GSH量采用由GSH和DTNB間反應所產(chǎn)生的由DTNB連續(xù)還原成TNB的比率來測定，而樣品中包含的或由GSH和DTNB間反應所產(chǎn)生的GSSG由谷胱甘肽還原酶和NADPH反應還原為GSH。因此總谷胱甘肽量即GSH和GSSG量的和由還原成TNB的比率總和表示。還原成TNB的比率精確地與谷胱甘肽總量成比例，并通過在405nm處測定吸光度得以確定。
從未經(jīng)NEM處理的樣品中，谷胱甘肽的總量通過在線性增加的范圍內(nèi)測定吸光度曲線的斜率而確定，這代表了如上所述的樣品中GSH和GSSG轉化為GSH的量，并且從NEM處理的樣品中，氧化型谷胱甘肽(GSSG)量通過測定吸光度而確定。
同時，氧化型和還原型谷胱甘肽標準曲線通過分別測定一定量的氧化型和還原型谷胱甘肽吸光度而建立，然后將總谷胱甘肽和GSSG的吸光度與標準曲線的吸光度比較，確定GSSG量，并在分析樣品中的蛋白含量后將GSSG量轉化成nmol谷胱甘肽/mg蛋白。
進一步，多孔板可用于對大批量樣品中氧化型和還原型谷胱甘肽的分析。即大批量樣品中氧化型和還原型谷胱甘肽的定量測定能采用下列步驟平行進行將磷酸緩沖液、蒸餾水和NADPH溶液分配在多孔板的每個孔中；往每個孔中加入等體積的NEM處理的和未處理的樣品，接著將谷胱甘肽還原酶和DTNB加入到每個孔中以啟動反應；和測定含有NEM處理樣品的反應混合物的吸光度以定量氧化型谷胱甘肽(GSSG)以及測定含有未經(jīng)NEM處理的樣品反應混合物的吸光度以定量總谷胱甘肽，然后從總谷胱甘肽中減去GSSG量以確定還原型谷胱甘肽(GSH)量此處，每一步條件都與上述的定量測定谷胱甘肽方法相同。
本發(fā)明以下列實施例進一步說明，這些實施例不應看成是限制本為準確測定GSSG，NEM在本發(fā)明中用作GSH誘捕劑。NEM溶液在室溫下很不穩(wěn)定，僅在使用前制備并置于冰浴中保存，但在低pH條件下相對穩(wěn)定，在5％(v/v)PCA中制備濃度為250mM的NEM溶液。上述制備的組織PCA勻漿分成60μl和400μl，然后將100μl的250mM NEM加入到400μl等份的PCA勻漿中使NEM終濃度為250mM，緊接著加入210μl 2M KHCO3中和反應并在室溫下溫育30分鐘。由于NEM反應完成對成功定量GSH和GSSG至關重要，因此經(jīng)NEM處理的樣品和未經(jīng)NEM處理的樣品分別通過HPLC采用NH2柱分析GSH和GSSG(參見圖1a和1b)。圖1a是來自未經(jīng)NEM處理樣品中GSSG和GSH的層析譜，而圖1b是來自經(jīng)NEM處理的樣品中GSSG和GSH的層析譜。如圖1a和圖1b所顯示，GSH在經(jīng)NEM處理的級分中根本未被檢測到，這表明反應完成。
上述制備的NEM處理的和未經(jīng)NEM處理的級分分別離心獲得上清液，然后未經(jīng)NEM處理樣品的上清液用含有1mM EDTA的100mM磷酸緩沖液(pH7.0)稀釋5-10倍以制備樣品用于定量測定總谷胱甘肽，而將NEM處理樣品上清液進行預處理以去除未反應的殘留NEM，其包括用等體積乙醚抽提10次，并隨后采用真空泵干燥去除乙醚以制備樣品用于定量測定GSSG。另外，未經(jīng)NEM處理的組織勻漿通過離心獲得蛋白沉淀，溶解于100μl 1N NaOH中，稀釋10倍，然后Bradford分析法測定蛋白。蛋白標準曲線采用牛血清白蛋白(BSA)在表1所示的濃度下用Bradford法建立(參加圖3a)。圖3a為Bradford法建立的蛋白標準曲線。
表1BSA濃度和對應的吸光度測定
實施例2應用多孔板定量測定谷胱甘肽根據(jù)本發(fā)明，組織中谷胱甘肽的量使用多孔板對大批量樣品如下測定首先，將50μl的5×磷酸緩沖液(含有5mM EDTA的500mM磷酸緩沖液，pH7.0)、125μl蒸餾水和5μl 10mM NADPH的混合物分布到每個孔中。然后，將NEM處理的和未經(jīng)NEM處理的樣品每個20μl加入到單個孔中用于制作谷胱甘肽的標準曲線，1mM GSH(還原型)和1mM GSSG(氧化型)適當稀釋并將每個稀釋液20μl加入到單個孔中。然后，加入25μl谷胱甘肽還原酶(1.2U/ml)和25μl 0.6mMDTNB的混合物啟動反應，這里谷胱甘肽還原酶溶解在磷酸緩沖液中至濃度6U/ml，并在加入到反應混合物之前用同樣磷酸緩沖液再稀釋5倍，通過將DTNB溶解在0.5％(w/v)NaHCO3溶液中至濃度3mM來制備用作GSH氧化劑的DTNB(50×)，并僅在用前用蒸餾水稀釋5倍。最后，采用多孔板讀數(shù)器運用動力學分析軟件在405nm處測定吸光度5分鐘以上，并在直線范圍內(nèi)測定吸光度斜率。然后，從吸光度曲線斜率變化中建立谷胱甘肽的標準曲線。將組織樣品所測定的吸光度曲線斜率轉化為總谷胱甘肽或GSSG量(nmol/ml樣品)，并根據(jù)實施例1中測定的蛋白濃度再次轉化為nmol谷胱甘肽/mg蛋白(參見圖3)。圖3表明用DTNB和谷胱甘肽還原酶處理一定時間的樣品中所產(chǎn)生的TNB的吸光度測定。如圖2所示，吸光度在2-3分鐘期間線性增加，這意味著反應條件最合適。實施例2-1標準曲線的建立谷胱甘肽標準曲線通過測定實施例2中制備的谷胱甘肽標準溶液的吸光度而建立(參見表2和3，圖3b和3c)。
表2總谷胱甘肽濃度和對應的標準曲線斜率
表3GSSG濃度和對應的標準曲線斜率
上述表2和3分別顯示了GSH和GSSG的濃度以及對應的標準曲線斜率。圖3a和3b分別顯示了GSH標準曲線和GSSG標準曲線。在圖3a中，在線性增加的范圍內(nèi)的吸光度曲線斜率測定為3.1871，和在圖3b中，斜率測定為5.1794。實施例3定量測定組織樣品中的谷胱甘肽從C3H小鼠中獲取的20mg肝組織用500μl 5％(v/v)PCA溶液勻漿，使勻漿液進行如實施例1和2中所述的分析反應，測定吸光度以確定在線性增加的范圍上的吸光度曲線的斜率，然后從實施例2-1建立的標準曲線上確定組織樣品中總谷胱甘肽和GSSG的量。在20倍稀釋的組織樣品中在線性增加的范圍上的總谷胱甘肽的吸光度變化確定為74.49，并用圖3b的標準曲線轉化為467.45nmol總谷胱甘肽/ml樣品。GSSG的吸光度變化確定為28.49并依據(jù)圖3c轉化為9.63nmolGSSG/ml樣品。實施例4谷胱甘肽濃度轉化為谷胱甘肽量實施例3中測定的總谷胱甘肽和GSSG濃度(nmol/ml樣品)轉化為谷胱甘肽量(nmol)/mg蛋白。采用Bradford方法和標準曲線以如在實施例2中的相似方式測定蛋白量，此處未經(jīng)NEM處理的勻漿液離心后，測定沉淀蛋白的量。蛋白濃度確定為13.88mg/ml。這樣將總谷胱甘肽濃度值(467.45nmol/ml)和GSSG濃度值(9.63nmol/ml)分別轉化為33.68nmol/mg和0.69nmol/mg。因此組織樣品中具體的GSH量結果為32.99nmol/mg。實施例5用于定量測定谷胱甘肽方法的驗證為檢驗本發(fā)明方法用于定量測定組織樣品中谷胱甘肽的可行性，總谷胱甘肽和GSSG用增量樣品定量測定。即總谷胱甘肽和GSSG的量采用如實施例2中的相似方式測定，除了加入0、10、20、30、40或50μl樣品(參見圖4a和4b)。圖4a表示吸光度曲線斜率的變化代表了隨著組織樣品增量所測定的總谷胱甘肽量。如圖4a和4b所顯示，測定的谷胱甘肽量在標準曲線的有效范圍內(nèi)隨著樣品量的增加而同步增加。同時，所測定的GSSG量隨著樣品量增加直到30-40μl而增加，然而隨著樣品增量超過40μl后，其增加程度降低。該結果推測是由于含在NEM處理樣品中殘留的NEM未被乙醚抽提完全去除，其增量抑制了谷胱甘肽還原酶而導致，因此發(fā)現(xiàn)加入到分析反應中樣品的合適體積理想的為20μl?；谏鲜龅慕Y果，20μl樣品中的總谷胱甘肽量被測定并能轉化為每單位重量蛋白的谷胱甘肽量，nmol/mg蛋白。本發(fā)明方法對谷胱甘肽定量測定的檢測底限為0-4.4nmol/樣品，這顯示本發(fā)明方法如同HPLC法一樣靈敏。
如上清楚地說明和顯示，本發(fā)明提供了一種方法，通過將GSH誘捕劑處理樣品的步驟引入到采用氧化劑和谷胱甘肽還原酶的常規(guī)酶法分析中，可同時定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽。用于快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的本發(fā)明方法包括下列步驟獲取組織樣品然后制備代謝阻斷的組織勻漿；采用和不用GSH誘捕劑制備等體積的勻漿級分，并將磷酸緩沖液、蒸餾水和NADPH溶液加入到每個級分中；將谷胱甘肽還原酶和氧化劑加入到每個級分中啟動反應；和采用和不用GSH誘捕劑測定含有級分的反應混合物吸光度以分別定量測定氧化型谷胱甘肽(GSSG)和總谷胱甘肽，然后從總谷胱甘肽中減去GSSG量從而確定還原型谷胱甘肽(GSH)的量。根據(jù)本發(fā)明，氧化型和還原型谷胱甘肽的量能同時以一種簡便和準確的方式測定，這使得本發(fā)明實際應用在由細胞氧化/還原態(tài)異常所引發(fā)的疾病的診斷和治療成為可能。
權利要求
1.一種用于快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，包括(i)獲取組織樣品，然后制備代謝被阻斷的組織勻漿；(ii)在采用和不用GSH誘捕劑的情況下制備等體積的勻漿級分，并將磷酸緩沖液、蒸餾水和NADPH溶液加入到每個級分中；(iii)將谷胱甘肽還原酶和氧化劑加入到每個級分中啟動反應；和(iv)在采用和不用GSH誘捕劑的情況下測定含有所述級分的反應混合物以分別定量測定氧化型谷胱甘肽(GSSG)和總谷胱甘肽，然后從總谷胱甘肽中減去GSSG量從而確定還原型谷胱甘肽(GSH)的量。
2.權利要求1的用于快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中組織樣品從動物或植物來源獲得。
3.權利要求1的用于快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中組織勻漿由在-70℃時冷凍干燥組織樣品并用5％PCA(高氯酸)溶液處理組織樣品阻斷其代謝而獲得。
4.權利要求1的用于快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中GSH誘捕劑為N-乙基馬來酰亞胺(NEM)。
5.權利要求1的用于快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中GSH誘捕劑加入到級分中使終濃度達到20-100mM。
6.權利要求1的用于快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中2-3倍體積的磷酸緩沖液加入到級分中使終濃度達到50-150mM。
7.權利要求1的用于快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中6-7倍體積的蒸餾水加入到級分中。
8.權利要求1的用于快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中20-30％(v/v)的NADPH溶液加入到級分中使終濃度達到0.1-0.3mM。
9.權利要求1的用于快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中10-15％(v/v)的谷胱甘肽還原酶加入到級分中使終濃度達到0.05-0.2U/ml。
10.權利要求1的用于快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中氧化劑為5，5’-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。
11.權利要求1的用于快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中10-15％(v/v)的氧化劑加入到級分中使終濃度達到0.02-0.1mM。
12.權利要求1的用于快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中在405nm處測定吸光度。
13.一種使用多孔板快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，包括(i)將磷酸緩沖液、蒸餾水和NADPH溶液分配到多孔板的每個孔中；(ii)將等體積的經(jīng)NEM處理的或未處理的樣品加入到每個孔中，接著將谷胱甘肽還原酶和DTNB加入到每個孔中啟動反應；和(iii)測定含有經(jīng)NEM處理樣品的反應混合液的吸光度以定量氧化型谷胱甘肽(GSSG)，以及測定含有未經(jīng)NEM處理樣品的反應混合液的吸光度以定量總谷胱甘肽，然后從總谷胱甘肽中減去GSSG量從而確定還原型谷胱甘肽(GSH)的量。
14.權利要求13的使用多孔板快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中2-3倍體積的磷酸緩沖液加入到樣品中使終濃度達到50-150mM。
15.權利要求13的使用多孔板快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中6-7倍體積的蒸餾水加入到樣品中。
16.權利要求13的使用多孔板快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中20-30％(v/v)的NADPH溶液加入到樣品中使終濃度達到0.1-0.3mM。
17.權利要求13的使用多孔板快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中NEM加入到樣品中使終濃度達到20-100mM。
18.權利要求13的使用多孔板快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中10-15％(v/v)的谷胱甘肽還原酶加入到樣品中使終濃度達到0.05-0.2U/ml。
19.權利要求13的使用多孔板快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中10-15％(v/v)的DTNB加入到樣品中使終濃度達到0.02-0.1mM。
20.權利要求13的使用多孔板快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法，其中在405nm處測定吸光度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種方法，通過將GSH誘捕劑處理樣品的步驟引入到采用氧化劑和谷胱甘肽還原酶的常規(guī)酶法分析中，可同時定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽(GSSG·GSH)。用于快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽的方法包括下列步驟(i)獲取組織樣品然后制備代謝阻斷的組織勻漿；(ii)采用和不用GSH誘捕劑制備等體積的勻漿級分，并將磷酸緩沖液、蒸餾水和NADPH溶液加入到每個級分中；(iii)將谷胱甘肽還原酶和氧化劑加入到每個級分中啟動反應；和(iv)采用和不用GSH誘捕劑測定含有級分的反應混合物吸光度以分別定量測定氧化型谷胱甘肽(GSSG)和總谷胱甘肽，然后從總谷胱甘肽中減去GSSG量從而確定還原型谷胱甘肽(GSH)的量。根據(jù)本發(fā)明，氧化型和還原型谷胱甘肽的量能同時以一種簡便和準確的方式測定，這使得本發(fā)明實際應用在由細胞氧化/還原態(tài)異常所引發(fā)的疾病的診斷和治療成為可能。
文檔編號C12Q1/26GK1392901SQ01802073
公開日2003年1月22日 申請日期2001年6月20日 優(yōu)先權日2001年6月20日
發(fā)明者樸英美, 崔恩美, 崔真熙, 金性勛, 白先熙, 李上燮 申請人:樸英美