專(zhuān)利名稱(chēng)：硒診斷/測(cè)定試劑盒及硒的濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種硒診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定硒濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
硒是生物必需的微量元素，植物硒是人類(lèi)和動(dòng)物獲取硒的主要來(lái)源,人體過(guò)多的攝入硒能引起硒中毒。硒元素可使人體內(nèi)的過(guò)氧化物分解，保護(hù)
細(xì)胞膜、心、腎、肺、眼等；可清除人體的自由基，抗衰老，增強(qiáng)人體免疫功能，可抑制多種致癌物質(zhì)，人體缺硒會(huì)誘發(fā)心血管疾病和癌癥。
結(jié)合國(guó)內(nèi)外有關(guān)硒的各種檢測(cè)方法.其中常用的測(cè)定方法如原子吸收光譜法(AAS)、原子熒光光譜法(AFS)和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)等；原子吸收光譜(AAS)作為元素特效檢測(cè)器與GC聯(lián)用已成為微量元素分析的主要方法。另外還有，應(yīng)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS-MS)鑒定硒化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用硒依賴(lài)性的酶比色法
(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技
術(shù)，計(jì)量/連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定硒濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的硒診斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行硒濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而 可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明硒濃度測(cè)定方法原理如下
谷胱甘肽二硫+ 2水谷胱甘肽過(guò)氧化物酶/Se
2谷胱甘肽+過(guò)氧化氫
過(guò)氧化氫+乙醇 過(guò)氧化氫酶 乙醛+水
乙醛+輔酶+水醛脫氫酶 乙酸+還原型輔酶
這種方法利用硒依賴(lài)性的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase; EC UU,9)酶(偶)聯(lián)過(guò)氧化氫酶(catalase; EC Lll丄6)、醛脫氫酶 (Aldehyde dehydrogenase; EC 1.2.1.3; EC 1.2.1.4; EC 1.2.1.5)酶促反應(yīng) 速率比色法/終點(diǎn)法。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶酶解谷胱甘肽二硫反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)氧 化氫，再通過(guò)(偶)聯(lián)合過(guò)氧化氫酶、酵脫氫酶的作用，最終將輔酶(在 340nm處沒(méi)有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從 而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過(guò)測(cè)量 340nm處吸光度上升的程度/速度，可以測(cè)算硒的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明硒診斷/測(cè)定試劑盒較 為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 10000 U/L過(guò)氧化氫酶 12000 U/L
醛脫氫酶 12000 U/L
谷胱甘肽二硫 10mmol/L 乙醇 8mmol/L
本發(fā)明的硒診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、醛脫
氫酶、谷胱甘肽二硫、乙醇。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體
試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷胱甘肽二硫、乙醇。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、醛脫氫酶。 輔酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、醛脫氫酶、谷胱甘肽二硫、 乙醇在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷胱甘肽二硫、乙醇。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、過(guò)氧化氫酶、醛脫氫酶。試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶。
輔酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、醛脫氫酶、谷胱甘肽二硫、 乙醇在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀 態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定硒濃度的方法，其輔酶可以是 NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的硒診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括-
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50Ommol/L
輔酶 3 mmol/L
谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 10000 U/L
過(guò)氧化氫酶 12000 U/L
醛脫氫酶 12000 U/L
谷胱甘肽二硫 1Ommol/L
乙醇 8 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)硒樣品與試劑的 體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左 右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出硒的濃度大
實(shí)施例二
本實(shí)施例的硒診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括:
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 輔酶
谷胱甘肽二硫 乙醇
50 mmol/L 3 mmol/L
10 mmol/L 8 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 過(guò)氧化氫酶
500 mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37X:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)硒樣品與試劑1、 試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大 約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出硒的濃度大
小,
實(shí)施例三
本實(shí)施例的硒診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括: 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
輔酶
谷胱甘肽二硫 乙醇
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
過(guò)氧化氫酶
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 10 mmol/L 8 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 12000U/L 12000U/L
100 mmol/L 500 mmol/L谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定硒濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10 分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè) 硒樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎?應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出硒的濃度大 小。
申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的測(cè)定方法均能達(dá)到 本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類(lèi)同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析 儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0010; 吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線上升；試劑可測(cè)有效(R》0.99)線形范圍可 達(dá)0.5mmol/L;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過(guò)±6%;試劑測(cè)試 的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《3%;試劑的靈敏度可達(dá)0.060 ± 0.030 AA/mmol/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便 于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1. 一種利用硒依賴(lài)性的酶比色法及酶聯(lián)法的硒的濃度測(cè)定方法，其方法原理如下谷胱甘肽二硫+2水 <u>谷胱甘肽過(guò)氧化物酶/Se</u> 2谷胱甘肽+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+乙醇 <u>過(guò)氧化氫酶</u> 乙醛+水乙醛+輔酶+水 <u>醛脫氫酶</u> 乙酸+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，測(cè)算出硒的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種硒診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液20—一500 mmol/L穩(wěn)定劑1———4000 mmol/L輔酶1—6 mmol/L谷胱甘肽過(guò)氧化物酶IOOO-~~"80000 U/L過(guò)氧化氫酶1000———80000 U/L醛脫氫酶1000———謹(jǐn)OO U/L谷胱甘肽二硫1—50 mmol/L乙醇l一50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在 此范圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述硒診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、醛脫氫 酶、谷胱甘肽二硫、乙醇組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述硒診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、醛脫氫 酶、谷胱甘肽二硫、乙醇組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 輔酶、谷胱甘肽二硫、乙醇組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷胱甘 肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、醛脫氫酶組成。輔酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物 酶、過(guò)氧化氫酶、醛脫氫酶、谷胱甘肽二硫、乙醇在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述硒診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、醛脫氫 酶、谷胱甘肽二硫、乙醇組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 輔酶、谷胱甘肽二硫、乙醇組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、過(guò)氧化 氫酶、醛脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷胱甘肽過(guò)氧化物 酶組成。輔酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、醛脫氫酶、谷胱甘 肽二硫、乙醇在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述硒診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用硒依賴(lài)性的酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的硒診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定硒濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、谷胱甘肽二硫、乙醇、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、醛脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出硒的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101464334SQ20071019212
公開(kāi)日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司