專利名稱：硒診斷/測定試劑盒及硒的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種硒診斷/測定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定硒濃度的 方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
硒是生物必需的微量元素，植物硒是人類和動(dòng)物獲取硒的主要來源，人 體過多的攝入硒能引起硒中毒。硒元素可使人體內(nèi)的過氧化物分解，保護(hù)
細(xì)胞膜、心、腎、肺、眼等；可清除人體的自由基，抗衰老，增強(qiáng)人體免 疫功能，可抑制多種致癌物質(zhì)，人體缺硒會(huì)誘發(fā)心血管疾病和癌癥。
結(jié)合國內(nèi)外有關(guān)硒的各種檢測方法.其中常用的測定方法如原子吸收
光譜法(AAS)、原子熒光光譜法(AFS)和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法 (ICP-AES)等；原子吸收光譜(AAS)作為元素特效檢測器與GC聯(lián)用已成為微 量元素分析的主要方法。另外還有，應(yīng)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS-MS) 鑒定硒化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用硒依賴性的酶比色法
(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技
術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化， 得以測定硒濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的硒診斷/ 測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化 分析儀上進(jìn)行硒濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切 實(shí)的推廣應(yīng)用。本發(fā)明硒濃度測定方法原理如下
谷胱甘肽二硫+ 2水谷胱甘肽過氧化物酶/Se
2谷胱甘肽+過氧化氫 過氧化氫+ 二氧化碳+乙酰輔酶A 丙酮酸氧化酶
丙酮酸+輔酶八+氧 丙酮酸+還原型輔酶乳酸脫氫酶L-乳酸+輔酶 這種方法利用硒依賴性的谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase; EC1.11丄9)酶(偶)聯(lián)丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)、乳酸 脫氫酶(Lactate dehydrogenase; EC 1.1.1.27; EC 1.1.1.28)酶促反應(yīng)連續(xù) 監(jiān)測法/速率比色法。谷胱甘肽過氧化物酶酶解谷胱甘肽二硫反應(yīng)產(chǎn)生過氧 化氫，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸氧化酶、乳酸脫氫酶的作用，最終將還原 型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)， 從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度/速度，通過測量 340nm處吸光度下降的程度/速度，可以測算硒的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明硒診斷/測定試劑盒較 為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
谷胱甘肽過氧化物酶 10000 U/L
丙酮酸氧化酶 10000 U/L
乳酸脫氫酶 12000 U/L
谷胱甘肽二硫 10 mmol/L二氧化碳 12mmol/L 乙酰輔酶A 8 mmol/L
二氧化碳可以是任何碳酸氫鹽，如碳酸氫鈉。 本發(fā)明的硒診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙酮酸氧化 酶、乳酸脫氫酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰輔酶A。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰 輔酶A。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷胱甘肽過氧化物酶、丙酮酸氧化酶、乳酸脫氫酶。
還原型輔酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙酮酸氧化酶、乳酸脫氫酶、谷胱 甘肽二硫、二氧化碳、乙酰輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰 輔酶A。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、乳酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷胱甘肽過氧化物酶。 還原型輔酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙酮酸氧化酶、乳酸脫氫酶、谷胱
甘肽二硫、二氧化碳、乙酰輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可 以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定硒濃度的方法，其還原型輔酶 可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一
本實(shí)施例的硒診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
還原型輔酶
谷胱甘肽過氧化物酶
丙酮酸氧化酶
乳酸脫氫酶
谷胱甘肽二硫
二氧化碳
乙酰輔酶A
100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10000 U/L 10000 U/L 12000 U/L 10 mmol/L 12 mmol/L 8 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光
度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測硒樣品與試劑 的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘 左右，檢測時(shí)間3分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出硒的濃度大
實(shí)施例二
本實(shí)施例的硒診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 谷胱甘肽二硫 二氧化碳 乙酰輔酶A 試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
谷胱甘肽過氧化物酶 丙酮酸氧化酶
100 mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 10 mmol/L 12 mmol/L 8 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L 10000 U/L 12000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7,測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測硒樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測時(shí)間3分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出硒的濃度大小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的硒診斷/測定試劑為三試劑，包括試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶谷胱甘肽二硫
二氧化碳
乙酰輔酶A試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑
丙酮酸氧化酶乳酸脫氫酶試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L穩(wěn)定劑 500mmoi/L谷胱甘肽過氧化物酶 10000 U/L
100 mmol/L50 mmol/L
0.25 mmol/L10 mmol/L12 mmol/L8 mmol/L
100 mmol/L500 mmol/L10000 U/L12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。測定硒濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10
分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測硒樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測時(shí)間3分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出硒的濃度大小。
申請人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的測定方法均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0015;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線下降；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達(dá)0.5mmol/L;試劑測試的不準(zhǔn)確度，其相對偏差不超過士5 %;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《4%;試劑的靈敏度可達(dá)0.040 ±0.02 AA/mmol/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1. 一種利用硒依賴性的酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的硒濃度測定方法，其方法原理如下谷胱甘肽二硫+2水 <u>谷胱甘肽過氧化物酶/Se</u> 2谷胱甘肽+過氧化氫過氧化氫+二氧化碳+乙酰輔酶A <u>丙酮酸氧化酶</u> 丙酮酸+輔酶A+氧丙酮酸+還原型輔酶 <u>乳酸脫氫酶</u> L-乳酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測算出硒的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種硒診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20—一500 mmol/L穩(wěn)定劑1——-4000 mmol/L還原型輔酶0.1——0.35 mmol/L谷胱甘肽過氧化物酶IOOO-——80000 U/L丙酮酸氧化酶IOOO-——80000 U/L乳酸脫氫酶1000-——80000 U/L谷胱甘肽二硫1—50 mmol/L二氧化碳l一50 mmol/L乙酰輔酶A1—50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在 此范圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。二氧化碳可以是任何碳酸氫鹽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述硒診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn),劑、還原型輔酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙酮酸氧化酶、 乳酸脫氫酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰輔酶A組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述硒診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙酮酸氧化酶、 乳酸脫氫酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰輔酶A組成雙劑試劑； 試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、 乙酰輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷胱甘肽過氧化物酶、 丙酮酸氧化酶、乳酸脫氫酶組成。還原型輔酶、谷胱甘肽過氧化物酶、 丙酮酸氧化酶、乳酸脫氫酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述硒診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙酮酸氧化酶、乳酸脫氫酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰輔酶A組成多劑試劑； 試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、 乙酰輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、乳酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷胱甘肽過氧化物酶組成。還 原型輔酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙酮酸氧化酶、乳酸脫氫酶、谷胱甘 肽二硫、二氧化碳、乙酰輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可 以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述硒診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l一OOO mmol/L或0.10/。-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種,
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用硒依賴性的酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的硒診斷/測定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定硒濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰輔酶A、谷胱甘肽過氧化物酶、丙酮酸氧化酶、乳酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測算出硒的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464335SQ200710192128
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司