專利名稱：用于保護人受試者的重組亞單位西尼羅病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體上涉及疫苗領(lǐng)域。本發(fā)明涉及被設(shè)計用于保護人免患由西尼羅病毒引起的疾病的疫苗。具體地，所述疫苗包含在昆蟲細胞生產(chǎn)系統(tǒng)中生產(chǎn)的西尼羅病毒的重組囊膜(envelope，Ε)糖蛋白的截短形式(version)和基于鋁的佐劑。
背景技術(shù)：
黃病毒科包括原型黃熱病病毒(YFV)，登革熱病毒的4種血清型(DENV-1， DENV-2, DENV-3和DENV-4)，日本腦炎病毒(JEV)，蜱傳腦炎病毒(TBEV)，西尼羅病毒 (WNV)，圣路易斯腦炎病毒(SLEV)和約70種其他引起疾病的病毒。黃病毒是包含單條正鏈 RNA基因組的小的、有囊膜的病毒。10種基因產(chǎn)物由單個開放閱讀框編碼并翻譯為以如下順序組織的多聚蛋白衣殼(C)，“膜前體”(preMembrane，prM，其在病毒粒子從細胞釋放前才被加工成“膜”(M))，“囊膜” (E)，接著是非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白NSU NS2a、NS2b、NS3、NS4a、 NS4b 和 NS5 (在 Chambers, Τ. J. ^A , Annual Rev Microbiol (1990) 44:649-688; Henchal, Ε. Α.禾口 Putnak, J. R. , Clin Microbiol Rev. (1990) 3:376-396 中綜述)。 然后通過由宿主以及病毒編碼的蛋白酶介導的精確的加工事件產(chǎn)生各個黃病毒蛋白。黃病毒的囊膜來源于宿主細胞膜并包含病毒編碼的膜錨定的膜(M)和囊膜 (E)糖蛋白。E糖蛋白是最大的病毒結(jié)構(gòu)蛋白并包含負責細胞表面附著和內(nèi)體內(nèi)融合 (intra-endosomal fusion)活性的功能結(jié)構(gòu)域。其也是宿主免疫系統(tǒng)的主要靶，誘發(fā)病毒中和抗體的產(chǎn)生，這與保護性免疫相關(guān)。西尼羅病毒已成為在美國新出現(xiàn)的傳染病。此病毒感染鳥，鳥充當病毒的天然儲存庫，此外還感染人和馬，人和馬是偶見宿主(incidental host)。其是蟲媒傳播病毒，由包括庫蚊屬(XMex)的多種屬的超過42種蚊子傳播。首個文件記錄的WNV病例在1937年烏干達的西尼羅河區(qū)域發(fā)現(xiàn)(Smithburn 等人，Am J Trop Med Hyg (1940) 20:471-492)。 從那以后其傳播至中東、大洋洲、歐洲和亞洲的部分，并且最近在美洲出現(xiàn)。自1999年在紐約市記錄到首個在美國的人感染的病例之后，病毒迅速傳播，遍及美國東海岸并已穿過大陸向西傳播?，F(xiàn)在已經(jīng)在所有48個大陸州的鳥群體中發(fā)現(xiàn)此病毒。WN疾病的人病例已在50個州的47個中有文件記錄，僅在阿拉斯加、夏威夷和緬因州未報導有人病例2008，57(26) :720-23) 大部分感染W(wǎng)NV的個體經(jīng)歷類似流感的癥狀。然而，大量感染個體會出現(xiàn)嚴重的疾病，其具有3-15%的病死率并在老年人中病死率最高。另外，其在高百分比的非致死病例中導致永久性的神經(jīng)障礙。在2003年，在9，862位有癥狀的感染個體中，2，866位( %)具有神經(jīng)侵入性疾病(被定義為西尼羅腦膜炎、腦炎和脊髓炎)且264位死于此疾病。在2004 年，神經(jīng)侵入性并發(fā)癥升高至36%_漢，vol. 53 Nov. 19，2004)。最近的研究顯示，從病毒感染中恢復需要比原先想象的顯著更多的時間。一項研究已推斷出中值恢復時間為60 天(Comment, J/w Tflier. Med. (2004), 141 153)，而另一項研究記錄了僅 37% 的患者在 1 年后完全恢復(Klee等人，Emerg. Inf. Dis. (2004) 10:1405-1411)。病毒導致的神經(jīng)損傷治愈較慢，且有時損傷是永久的。近年來，一些個體已遭受類似脊髓灰質(zhì)炎的急性弛緩性麻痹癥狀。在老年患者中臨床表現(xiàn)顯著更差。在最近以色列爆發(fā)的WNV感染的研究中，在 233位住院患者的研究組中，總體的病死率為14%。然而，在70歲或更老的患者中，病死率 *^%(Chowers 等人，Emerg. Inf. Dis. (2001) 7:675-78)。在最近羅馬尼亞(Tsai 等人，Lancet (1998) ；352:767-771)和俄羅斯(Platonov 等人，Emerg. Inf. Dis. (2001) 7:128-32)的流行中也報導了類似的發(fā)現(xiàn)。因此，特別在老年/免疫衰老、免疫受損和免疫抑制的群體中，具有顯著的與WN疾病相關(guān)的發(fā)病率和死亡率。WNV囊膜蛋白與其他黃病毒特別是日本腦炎(JE)血清復合型(serocomplex) JEV、圣路易斯腦炎(SLEV)和墨萊溪谷腦炎(MVEV)病毒的囊膜蛋白共有顯著的同源性。針對包含在囊膜蛋白中的特定表位的抗體能夠中和病毒，即抑制病毒在體外感染易感細胞。 已將中和抗體表位定位至黃病毒(包括WNV)的E糖蛋白的所有3個結(jié)構(gòu)域(Diamond等人， Immunol. Rev. (2008) 225:212-25)。通常公認高滴度的病毒中和抗體是體內(nèi)保護免于黃病毒感染和其導致的疾病的最佳體外相關(guān)指標(correlate) (Markoff Vaccine (2000) 18:26-32; Ben-Nathan 等人，J. Inf. Diseases ( 2003) 188:5-12; Kreil 等人，J. Virol. (1998) 72:3076-3081; Beasley 等人，Vaccine (2004) 22:3722-26)。因此，誘發(fā)高滴度WNV中和抗體應答的疫苗將類似地保護疫苗接種者免于由WNV引起的疾病。迄今為止，黃病毒疫苗的開發(fā)已取得了多個成功(mixed success)。為了產(chǎn)生保護免于由黃病毒引起的疾病的候選疫苗，已實施了 4種基本方法。這4種方法是活減毒病毒、 失活的全病毒、重組亞單位蛋白質(zhì)和DNA。為YFV開發(fā)的活減毒病毒疫苗已存在了數(shù)十年， 并證明了此方法的有效性。失活的全病毒疫苗的應用已被證明用于TBEV和JEV，具有基于此方法的用于這2種疾病靶標的注冊產(chǎn)品。如上所述，開發(fā)用于YFV、JEV和TBEV的疫苗已經(jīng)取得成功。然而，使用活減毒病毒和失活病毒法開發(fā)其他黃病毒的疫苗遇到了很大的挑戰(zhàn)。例如，已在開發(fā)候選的活減毒登革熱疫苗株中花費了大量精力；然而，許多檢測的疫苗株已證實不令人滿意的(見，例如，Eckels, K. H. ^A , Am. J. Trop. Med. Hyg. (1984) 33:684—689; Bancroft, W. H. ^A, Vaccine (1984) 149:1005-1010; McKee, K. Τ. , ^A, Am. J. Trop. Med. Hyg. (1987) 36:435-442)。盡管這些最初不令人滿意的結(jié)果，仍在繼續(xù)努力開發(fā)和檢測登革熱活減毒候選疫苗株(在J . J. Trop. Med. Hyg. (2003) 69:1-60中綜述)。在使用傳統(tǒng)活減毒法開發(fā)WNV疫苗中沒有投入太多精力。為了開發(fā)黃病毒疫苗，作為傳統(tǒng)活減毒法的可選方案，已經(jīng)使用了重組嵌合法。此方法使用已知的活減毒黃病毒株作為基礎(chǔ)并用來自相關(guān)目的病毒的合適基因(對于黃病毒為prM和E)取代基礎(chǔ)病毒的等同基因。已用于WNV和DENV疫苗開發(fā)的一種方法是使用基于減毒的DENV-4株的intertypic嵌合體(Bray, Μ.等人’ J. Virol. (1996) 70:4162-4166; Chen, W. , ^A, J. Virol. (1995) 69:5186-5190; Bray, M.和 Lai, C. -J. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:10342-10346; Lai, C. J. ^A, Clin. Diagn. Virol. (1998) 10:173-179)。另一種方法是使用YFV 17D減毒株作為基礎(chǔ)來開發(fā) JEV、DENV 和 WNV 的重組嵌合疫苗(Lai, C.J.和 Monath Τ. P. Adv Virus Res (2003) 61:469-509; Monath 等人.Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103:6694)。盡管使用活減毒嵌合法相比傳統(tǒng)活減毒法有優(yōu)勢，但是嵌合法仍受到開發(fā)合適的減毒株所面臨的困難的困擾，以及在DENV疫苗的情況下，獲得針對4種登革熱病毒的平衡的四價應答所面臨的困難的困擾。此外，活減毒法可能不適用于靶向腦炎疾病的疫苗(由于提高的風險因素) 或具有受損的免疫系統(tǒng)的目的群體。這兩種因素都適用于WNV疫苗開發(fā)。目前存在使用全失活病毒法生產(chǎn)的用于JE和TBE的可商業(yè)獲得的疫苗。如同活減毒病毒法，失活病毒法在某些黃病毒中的應用不能保證在其他黃病毒中成功。例如，開發(fā)失活的DENV或WNV疫苗的努力遇到了一定困難(limited success).此方法受限于從細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中得到足夠的病毒產(chǎn)量的能力。從昆蟲細胞例如C6/36細胞中得到的病毒產(chǎn)量一般在IO4至IO5 pfu/ml的范圍，遠低于產(chǎn)生低成本的失活病毒疫苗所需的水平。從哺乳動物細胞(包括LLC-MK2和Vero細胞)中得到的產(chǎn)量較高，但從單一的Vero細胞系得到的約 IO6 pfu/ml的最高產(chǎn)量仍低于獲得低成本疫苗產(chǎn)品所需的水平。為了開發(fā)用于DENV、JEV、TBEV和WNV的非復制型黃病毒疫苗，還已評估了裸DNA 法的應用(在 Putnak, R.等人 000；3) Α/κ Virus Res. 61 445-68 中綜述)。DNA 法提供易于生產(chǎn)、使用確定的序列、由于體內(nèi)病毒抗原的表達引發(fā)體液和細胞免疫二者的潛力的優(yōu)點。盡管具有這些優(yōu)點，在人中誘發(fā)持續(xù)和強烈的免疫應答，特別是抗體應答的能力始終是此方法的主要障礙。另外，DNA疫苗面臨額外的法規(guī)審查，因為擔憂質(zhì)粒序列整合進宿主基因組和產(chǎn)生針對雙鏈DNA的自身抗體的潛能。迄今為止沒有批準任何人用DNA疫苗， 且不清楚此方法何時可被認為適用于預防性的人疫苗。用于黃病毒疫苗開發(fā)的重組亞單位蛋白質(zhì)的使用是非復制型病毒方法的另一個實例。此方法提供產(chǎn)生非常確定的產(chǎn)品和引發(fā)特異性免疫應答的潛能的優(yōu)點。盡管存在產(chǎn)生有關(guān)的和強烈的免疫應答的潛能，也存在與使用重組亞單位蛋白質(zhì)疫苗相關(guān)的挑戰(zhàn)。這是因為在引發(fā)期望的免疫應答中蛋白質(zhì)的質(zhì)量(類似天然的結(jié)構(gòu))和對佐劑的需要二者。重組亞單位蛋白質(zhì)疫苗具有歷史悠久的安全性和保護效力，最有效的證據(jù)是重組亞單位乙肝疫苗(例如Engerix B 和Recombivax HB )，和最近的人乳頭瘤病毒疫苗(例如Gardasif和 Cervarixe)0在生產(chǎn)中的任意時間不存在復制性病毒的事實有助于保證在預防背景下對健康或免疫受損個體施用亞單位疫苗相關(guān)的極其有限的風險。此外，已顯示乙肝和人乳頭瘤病毒疫苗是高度免疫原性和有效的。重組黃病毒蛋白質(zhì)的表達已集中在結(jié)構(gòu)蛋白C、prM和E以及非結(jié)構(gòu)蛋白NSl上。 E蛋白是大多數(shù)研究的對象，因為此蛋白質(zhì)暴露在病毒的表面，涉及病毒生命周期的重要生物學方面(例如結(jié)合受體和介導融合)，并且在受感染的宿主中是中和抗體的靶(Chambers， 如上;Mason, P. W., J. Gen Virol (1989) 70:2037-2048)。此外，針對純化的黃病毒
5E蛋白的單克隆抗體在體外是中和性的并且已顯示有些在體內(nèi)賦予被動保護(Henchal， Ε. A. ^A , Am. J. Trop. Med. Hyg. (1985) 34:162-169; Heinz, F. X. ^A , Virology (1983) 130:485-501; Kimura-Kiroda, J.和Yasui, K. , J. Immunol. (1988) 141:3606-3610; Trirawatanapong, T. ^A, Gene (1992) 116:139—150; Morrey, J. D. 等人，J. Inf. Dis (2006) 194:1300-8)。已利用了多種表達系統(tǒng)例如大腸桿菌cWi)、酵母和桿狀病毒產(chǎn)生重組黃病毒蛋白質(zhì)用于疫苗使用。這些嘗試受到低產(chǎn)量、黃病毒蛋白質(zhì)的不正確加工和中等至較差的免疫原性的困擾(Eckels, KHiPPutnak, R, Adv. Virus Res. (2003) 61:395-418)。 在Hawaii Biotech，Inc. (HBI)進行的表達重組E亞單位蛋白的工作已確定需要維持E 蛋白的類似天然結(jié)構(gòu)以使重組蛋白作為有效的免疫原。產(chǎn)生具有天然類似結(jié)構(gòu)的重組E蛋白的能力高度依賴于使用的表達系統(tǒng)。美國專利6，165，477公開了在酵母細胞中表達DENV E蛋白質(zhì)亞單位的方法。在酵母細胞中表達的E亞單位證明了相比細菌系統(tǒng)的改進的結(jié)構(gòu)， 但仍然面臨有關(guān)過度糖基化、產(chǎn)量和產(chǎn)物一致性的問題。在最近的研究中，已經(jīng)確定使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲細胞表達E蛋白的截短形式得到維持類似天然結(jié)構(gòu)的一致產(chǎn)物，如通過X光結(jié)晶學所測定的(Modis，Y.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2003) 100:6986-91; Modis, Y.等人，Nature (2004) 427 :313-19;禾口 Zhang, Y.等人，Structure (2004) 12 1607-18)。使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲細胞系統(tǒng)已得到來自DENV-I、-2、-3、-4、JEV、TBEV和WNV的截短的重組E亞單位蛋白的成功表達。美國專利6，136, 561公開了在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲細胞中表達DENV、JEV、TBEV和YFV 的重組E亞單位蛋白的方法。美國專利6，432，411公開了當與包含皂素的類似ISCOM結(jié)構(gòu)組合時，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲細胞中表達的黃病毒E重組亞單位蛋白作為候選疫苗的效用。 最近報導了由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲細胞系產(chǎn)生的截短的重組WNV囊膜亞單位蛋白(WN-80E)和非結(jié)構(gòu)蛋白 1 (WN-NSl)的臨床前評估(Lieberman 等人，Vaccine (2008) 25:414-423; Watts 等人，Vaccine (2007) 25:2913-2918; Siirin 等人，Am. J. Trop. Med. Hyg. (2008) 79:955-962)。在這些報導中，在小鼠和倉鼠模型中評估了用包含皂素的佐劑配制的E和NSl組合，以評估保護效力。這些專利和出版物證明，當與包含皂素的佐劑組合時，由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲細胞表達的黃病毒重組亞單位蛋白在動物模型中產(chǎn)生適當?shù)目贵w應答的效用。美國專利6，432，411以及Lieberman等人2007 (見上)和Watts等人2007 (見上)也證明了在疫苗制劑中包含重組NSl在動物模型中的益處。然而，這些專利和出版物沒有提出或預測僅基于E的已證明適于人用的疫苗制劑。大體上，使用非復制型病毒疫苗法例如失活病毒、重組亞單位蛋白和DNA相比活減毒病毒疫苗法具有若干優(yōu)點。這些優(yōu)點基本上涉及安全性，因為沒有對受試者遞送活病毒，并且優(yōu)點涉及通過調(diào)整劑量調(diào)節(jié)和平衡免疫應答的能力。在開發(fā)用于人的黃病毒疫苗中，基于在動物模型中的臨床前數(shù)據(jù)難以預測候選疫苗在人受試者中的安全性和免疫原性。已證明許多已進入人臨床試驗的活減毒病毒候選疫苗面臨挑戰(zhàn)。最令人矚目的完全失敗的實例是克隆的登革熱病毒3型分離株展示的安全特性，其在非人靈長類中展示了非常吸引人的安全特性，但其在香港的疫苗接受者中引發(fā)登革熱(Sanchez 等人，F(xiàn)EMS Immunol. Med. Microbiol. (2006) 24:4914-26)。通過使用非復制型病毒疫苗可減少此挑戰(zhàn)，其不需要與復制型病毒疫苗相同水平的病毒/宿主相互作用以獲得疫苗效力。然而，存在大量在臨床前模型中顯示了良好的安全性和保護效力，而在人中不能作為安全和有效的疫苗起作用的非復制型病毒候選疫苗的實例(例如，滅活的 RSV 疫苗；Murphy 等人，乂 Clin. Microbiol. (1986) 24: 197-202)。因此，可能存在與開發(fā)用于黃病毒的安全和有效的疫苗相關(guān)的多重挑戰(zhàn)且開發(fā)經(jīng)常需要數(shù)年的試驗和錯誤。此夕卜，基于動物模型的臨床前研究可能不能預測疫苗在人受試者中的表現(xiàn)；和因此，人數(shù)據(jù)對證明候選疫苗的效用是關(guān)鍵的。盡管在臨床前研究和開發(fā)中的多個階段中有若干研究中的WNV疫苗，但據(jù)以前的報導僅有3種候選疫苗進入人臨床試驗。已在臨床研究中檢測的3種疫苗是(1)活的、 減毒的登革熱血清型4-西尼羅嵌合體(Pletnev等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 99:3036-41) ； (2)活的、減毒的黃熱-西尼羅嵌合體(Chimerivax； Monath等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103:6694)；和(3)編碼 prM 和 E 基因的“裸”DNA 疫苗(Martin 等人，J. Infect. Dis. (2007) 196:1732-40)。3 種候選疫苗中的每一種都具有相關(guān)的內(nèi)在困難和潛在的缺點。臨床檢測的前兩種疫苗都是活減毒疫苗。對所有提供給健康受試者的活病毒疫苗來說最重要的就是安全性方面的擔憂。病毒減毒不足可導致病毒相關(guān)的副作用，而減毒過度可削弱疫苗的效力。此外，可能發(fā)生回復為野生型或突變?yōu)樘岣叩亩拘?或降低的效力)。此外，即使適當?shù)販p毒，活病毒疫苗對特定患者群體，例如免疫缺陷或免疫抑制患者， 以及正常群體的特定部分，例如懷孕婦女或老年個體是禁忌的。Chimerivax技術(shù)特別令人擔憂的是YF 17D疫苗(其充當嵌合體的骨架)在老年和免疫受損個體中的安全特征。自20 世紀90年代末以來，已記錄了大量致命的、傳播的、親內(nèi)臟的和親神經(jīng)的疫苗病毒感染的病例，特別是在老年和免疫受損個體中。這已導致反對在這些群體中使用YF 17D疫苗的建議，除非YF病毒感染風險非常高之外(Barrett, ADT和iTeuwen, DE (2009) Curr. Opin. Immunol. 21:308-1 。根據(jù)WNV感染在老年受試者中的發(fā)病率和死亡率之間的重要聯(lián)系，從安全性觀點來看對此目的疾病應用活減毒疫苗法是非常有問題的，因此前兩種候選疫苗沒有為西尼羅疫苗的需求提供安全的解決方案。在臨床試驗中已檢測的第三種西尼羅疫苗是DNA疫苗。目前裸DNA疫苗未證實用于任何感染性疾病，且由于誘發(fā)針對DNA的自身免疫應答而引起的潛在免疫病理學問題長期未得到解決。最近報導了 WNV DNA疫苗臨床試驗的結(jié)果(Martin等人，J Infect Dis (2007) 196:1732)。引發(fā)了低水平的中和抗體；然而，顯然已放棄了此DNA疫苗的臨床開發(fā)，可能與安全性挑戰(zhàn)有聯(lián)系。因此，DNA疫苗沒有為開發(fā)人用的WNV疫苗提供安全和有效的解決方案。如上所述，已進行了努力以產(chǎn)生既安全又具有充分免疫原性的保護人免患由WNV 感染引起的疾病的疫苗。盡管進行了這些努力，仍未研制出完全滿足這些條件的人用WNV 疫苗。因此，本發(fā)明待解決的技術(shù)問題是發(fā)現(xiàn)滿足2種主要條件的WNV疫苗；(1)在接種的個體(人受試者)中誘發(fā)相關(guān)保護性免疫應答，和(2)根據(jù)包括老年和免疫受損個體的主要高危群體，在人受試者中維持優(yōu)越的安全特性的能力。這代表了在WNV疫苗開發(fā)中的重大挑戰(zhàn)，且迄今為止沒有一種疫苗方法已顯示了充分解決此技術(shù)問題的所有方面。隨著西尼羅病毒感染傳播的流行，對解決方案存在尚未滿足且日益增長的需求。發(fā)明_既述本發(fā)明提供了唯一的人疫苗用于保護免患與WNV感染有關(guān)的疾病。所述疫苗通過組合 WNV囊膜蛋白衍生的重組亞單位蛋白和氫氧化鋁佐劑形成。所述疫苗能夠誘發(fā)相關(guān)保護性免疫應答，并在接種的人志愿者中已證明可接受的安全特性。這種唯一的疫苗制劑依賴于新的、適當折疊的重組囊膜亞單位蛋白(“西尼羅80E”或“WN-80E”)和基于鋁的佐劑的組合，以產(chǎn)生疫苗制劑HBV-002。這種疫苗(1)在健康的人志愿者中誘發(fā)了相關(guān)的保護性免疫應答，例如病毒中和抗體，和(2)維持對健康和免疫受損個體施用的可接受的安全特性。本發(fā)明的其他方面包括在可接受的載體中使用治療有效量的疫苗用作針對由WNV 感染引起的疾病的免疫預防藥，和在可接受的載體中使用治療有效量的疫苗作為藥物組合物。


圖1. WN-80E重組亞單位蛋白的氨基酸序列。氨基酸編號從蛋白質(zhì)的氨基端開始指示。圖2.純化的西尼羅80E的考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠(A)和蛋白質(zhì)印跡(B)。 所有樣品在10%的凝膠上在非還原條件下電泳。使用針對西尼羅病毒產(chǎn)生的兔多克隆抗血清顯色蛋白質(zhì)印跡。在凝膠和印跡的左側(cè)指示分子量標記的大小(以kD為單位)。在每個泳道頂端指示樣品上樣量(以yg為單位)。圖3.在用西尼羅HBV-002疫苗制劑接種的人志愿者中誘發(fā)的病毒中和抗體應答。發(fā)明詳述
本文描述的發(fā)明提供了用于人的保護免于由西尼羅病毒感染導致的疾病的疫苗。所述疫苗包含WNV重組亞單位囊膜糖蛋白(WN-80E)和鋁佐劑。將所述人用疫苗制劑稱為 HBV-002。HBV-002在人志愿者中有效誘發(fā)強烈的病毒中和抗體應答。此外，HBV-002具有對于健康和高危(at-risk)人受試者的可接受的安全特性。西尼羅病毒囊膜蛋白亞單位(WN-80E)
本發(fā)明的WNV疫苗使用WN-80E重組亞單位蛋白，所述蛋白通過基于果蠅khneider 2 (S2)細胞的細胞培養(yǎng)表達系統(tǒng)產(chǎn)生。使用此系統(tǒng)得到維持類似天然結(jié)構(gòu)的重組囊膜亞單位蛋白。WNV重組囊膜蛋白在C末端截短，剩下80%的天然囊膜蛋白(“80E”)。因此WN-80E 被定義為從首個N-端氨基酸開始E的約前80%的連續(xù)氨基酸。C-端截短被設(shè)計為缺失WN E蛋白的膜錨定部分(約50個氨基酸或10%的全長E蛋白的羧基端末端)，換句話說，從其 N-端的第一位氨基酸開始的WN E蛋白的最多前90%的連續(xù)氨基酸，因此允許其被分泌至細胞外培養(yǎng)基且便于回收?？煽寺『头置诔^90%，但少于100%的E蛋白，即蛋白質(zhì)可為90%+ 的長度，羧基端截短的，并可包括部分跨膜結(jié)構(gòu)域，只要截短的E蛋白可分泌?！翱煞置凇敝改軌虮环置?，和通常從表達系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化細胞中被分泌。80E截短蛋白進一步缺失了連接E的胞外結(jié)構(gòu)域和膜錨定部分的WN E蛋白的“莖”部分。莖部分不包含重要的抗原表位和因此未被包含。包含在WNV疫苗中的優(yōu)選抗原是WN-80E。在果蠅S2表達系統(tǒng)中表達的WN-80E重組亞單位蛋白被分泌至培養(yǎng)基中，被適當?shù)靥腔?，并維持類似天然的構(gòu)象(通過與構(gòu)象敏感的單克隆抗體4G2的反應性測定)。如在本發(fā)明中證明的，人用重組WN-80E亞單位蛋白的合適制劑導致在人受試者中誘發(fā)有效的病毒中和抗體的能力。因此，本發(fā)明的WNV疫苗制劑為關(guān)鍵的技術(shù)問題——產(chǎn)生證明在人受試者中具有高水平的安全性和免疫原性的西尼羅疫苗——提供了新的解決方案。本發(fā)明的優(yōu)選疫苗制劑包含適于人用的佐劑。優(yōu)選的佐劑是基于鋁的佐劑(例如， Alhydrogel )。具有鋁的制劑包含摻合劑，由此允許WN-80E抗原結(jié)合Alhydrogel，從而使 ^ 75%的抗原結(jié)合氫氧化鋁。在優(yōu)選的實施方案中，WN-80E包含WNV，NY99株的第1_401位氨基酸。圖1提供了 WN-80E的氨基酸序列。從包含編碼WNV prM蛋白和80E蛋白的合適的DNA片段的載體中優(yōu)選地產(chǎn)生WN-80E蛋白。編碼的prM段在宿主細胞中被細胞酶加工從而以類似在天然 WNV成熟過程中發(fā)生的方式釋放成熟的WN-80E蛋白(圖1)。圖2中顯示了由S2細胞表達的純化的WN-80E產(chǎn)物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，WN-80E被更廣泛地定義為在Cysl-Cys2、 Cys3_Cys8、Cys4_Cys6、Cys5_Cys7、Cys9_CyslO 和 Cysll_Cysl2 處包含 6 個二硫鍵的西尼羅病毒囊膜蛋白亞單位；其中所述多肽作為重組蛋白從果蠅細胞中分泌；且其中所述多肽當施用于人受試者時引起針對西尼羅病毒的中和抗體應答。在更優(yōu)選的實施方案中，重組WNV囊膜蛋白亞單位還包含所述二硫鍵模式和親水性特征，其特征在于從天然WNV囊膜蛋白的N端的首個氨基酸開始與囊膜蛋白的80%同源的部分(80E)。換句話說，在包含WN-80E的序列中的氨基酸可被取代，只要維持二硫鍵和親水性特征以確保重組亞單位蛋白保留類似天然的結(jié)構(gòu)和合適的免疫原性(引發(fā)病毒中和抗體的能力)。優(yōu)選地，使用主細胞庫(Master Cell Bank)在無血清培養(yǎng)基中表達WN-80E重組亞單位蛋白并使用以前描述的單克隆抗體(例如，4G2) (Ivy #U ,美國專利號6，432，411)， 通過免疫親和層析(IAC)純化。這樣得到可在適于人用的疫苗制劑中使用的WN-80E產(chǎn)物。令人驚訝地，且與在其他黃病毒制劑中包含非結(jié)構(gòu)蛋白例如非結(jié)構(gòu)蛋白1 (NSl) 的描述的額外益處形成對比(McDonell等人，US 6，416，763)，本發(fā)明的僅包含WN-80E 蛋白的疫苗制劑在非人靈長類(Lieberman等人，Clin. Vaccine Immunol. (2009) 16:1332-37)和人受試者中可作為有效的免疫原性疫苗，甚至在不包含NSl的情況下。圖3 中顯示了在用包含WN-80E蛋白和基于鋁的佐劑的HBV-002疫苗制劑接種的人志愿者中誘發(fā)的病毒中和抗體應答。鉭
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的WNV疫苗包含與基于鋁的佐劑(統(tǒng)稱“鋁”或“基于鋁的佐劑”)例如氫氧化鋁、磷酸鋁或其混合物一起配制的WN-80E重組亞單位蛋白。氫氧化鋁 (可以“Alhydrogel ”商業(yè)地獲得)用于制備臨床材料并因此是優(yōu)選的鋁形式?；阡X的佐劑是在美國和全世界首個注冊的人用佐劑，且其有效性是被廣泛公認的。認為基于鋁的佐劑至少部分通過儲存機制起作用，且具有類似天然結(jié)構(gòu)的重組WN-80E抗原和鋁的佐劑作用的組合足以在接種的個體(包括免疫缺陷群體成員)中誘發(fā)有效的免疫應答。具有鋁的制劑包含摻合劑，由此允許WN 80E抗原結(jié)合Alhydrogel 從而使> 75%的抗原結(jié)合氫氧化
ο優(yōu)選地，在動態(tài)藥品生產(chǎn)管理規(guī)范(cGMP)下實施WN_80E+Alhydrogel的WNV疫苗
9制劑和用優(yōu)選的疫苗制劑(HBV-002)填充小瓶的生產(chǎn)。這樣得到適于人用的包含WN-80E和鋁的WNV疫苗制劑。施用和用涂
本發(fā)明提供了預防或減弱由WNV感染引起的疾病的手段。如本文中使用的，如果對個體施用疫苗導致個體對疾病的完全或部分免疫性，或與疾病相關(guān)的癥狀或病癥的完全或部分減弱(即，抑制)，則稱疫苗預防或減弱疾病。如果接受的患者可耐受組合物的施用，則稱組合物為“藥理學可接受的”。如果施用的量是生理學顯著的，則稱以“治療有效量”施用這樣的藥劑。如果藥劑的存在導致接受的患者的生理學中可檢測的變化，則其是生理學顯著的。在本發(fā)明中在接受的患者中可檢測的變化是誘發(fā)針對WNV的中和抗體。本發(fā)明的活性疫苗可單獨使用，或與其他活性疫苗(例如包含使其有效量的其他活性亞單位的疫苗)組合使用。在特定制劑中可包含一種或幾種病毒或血清型的對應的或不同的亞單位。本發(fā)明的活性疫苗可還包含藥學上可接受的賦形劑。所述發(fā)明的治療組合物可通過皮下、肌肉內(nèi)或皮內(nèi)注射非腸道地施用；然而，也可應用其他全身性施用模式。用于本發(fā)明的優(yōu)選施用方法是肌肉內(nèi)途徑。當使用多次施用方案時，存在許多不同的技術(shù)用于免疫的時間選擇。優(yōu)選地使用本發(fā)明的組合物多于1次以提高被免疫的受試者表達的免疫球蛋白庫的表達水平和多樣性。通常，如果給予多次免疫，將間隔1至2個月給予免疫。本發(fā)明的優(yōu)選免疫時間表是在 0、1和2個月時免疫受試者。也可使用其他免疫時間表。例如，可使用例如0、1和3個月， 或0、1和6個月，或0、1、12個月的可選的免疫時間表。可在規(guī)定的時間間隔例如每5至10 年施用額外的加強免疫。為了免疫受試者以抵抗例如WNV引起的疾病，使用通常包括多次施用疫苗的常規(guī)的免疫方案對受試者施用包含重組亞單位蛋白和佐劑的疫苗制劑。施用通常通過注射，通常為肌肉內(nèi)或皮下注射進行；然而，也可應用其他全身性施用模式。根據(jù)所述發(fā)明，治療組合物的“有效量”是足以獲得預期的生物學效果的量。大體上，提供組合物有效量所需的劑量將取決于下述因素而變化，例如受試者的年齡、病癥、性別和疾病程度(如果有的話)，以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可調(diào)整的其他變量。本發(fā)明的抗原性制備物可以有效量的單個或多個劑量施用。本發(fā)明的組合物的有效量可在0. Ol-IOOyg/ 劑量，更優(yōu)選從5-50 μ g/劑量，和最優(yōu)選15-50 μ g/劑量中變化。本發(fā)明的組合物可還包含藥學上可接受的賦形劑。
實施例以下給出的實施例提供了本發(fā)明的基礎(chǔ)。實施例證明了能夠大規(guī)模地且在cGMP 下制備重組WN-80E蛋白和HBV-002疫苗制劑，以支持對人受試者施用(實施例1_3)。實施例還證明了疫苗在健康的成年志愿者中的安全性和免疫原性(效力)(實施例4)。HBI WNV 疫苗的安全性和效力取決于2個不同方面的新型組合。一方面，重組亞單位蛋白與基于鋁的佐劑的組合的內(nèi)在安全性為最嚴重的疾病提供了預防靶向老年和免疫受損個體——特別虛弱的高危群體的疾病的最佳方法。第二方面，在cGMP下，以足夠?qū)嶋H應用的量生產(chǎn)構(gòu)象相關(guān)(類似天然結(jié)構(gòu))的重組WN-80E抗原得到在人受試者中誘發(fā)病毒中和抗體的疫苗，提供了保護免于疾病的機制。這兩方面的獨特組合導致在人受試者中安全和有效的WNV疫苗的新發(fā)明。這些疫苗制劑的進一步特征在于以下意料之外的發(fā)現(xiàn)，即對于有效的免疫原性和保護不需要包含非結(jié)構(gòu)蛋白NS1。此外，公開的西尼羅疫苗獨特地處于這樣的位置，即解決了在接種的個體中誘發(fā)相關(guān)保護性免疫應答同時維持可接受的安全特性的技術(shù)問題，特別是針對那些處于患嚴重疾病的極高風險下的受試者，老年和免疫受損個體。以下實施例旨在說明而非限制本發(fā)明。實施例1
^MM S2系統(tǒng)中表汰和鈍化西原羅80E蛋白
表達質(zhì)粒pMttbns (來源于pMttPA)包含以下元件黑腹果mXDrosophila 識ster)金屬硫蛋白啟動子，人組織纖溶酶原激活物分泌前導序列(tPAL)和SV40早期多聚腺苷酸化信號。在Hawaii Biotech，從pMttbns載體上切除14個堿基對的片段以得到包含唯一的損ol位點以及現(xiàn)有的唯一的/^_/11位點的pMttA)(h0。此表達載體促進表達的蛋白質(zhì)分泌至培養(yǎng)基。使用這些唯一的^^711和損ol位點將西尼羅序列引入PMttAB10載體。為表達羧基端截短的西尼羅囊膜蛋白，合成了編碼西尼羅病毒的整個PrM蛋白和E蛋白的第1-401位氨基酸的合成基因(Midland Certified Reagent Co.， Midland, TX)。合成基因的核苷酸序列符合1999年在紐約市分離的西尼羅病毒的已公布的序列。在E蛋白第401位氨基酸的E蛋白C-端截短去除了跨膜結(jié)構(gòu)域，并因此可分泌至培養(yǎng)基。將最終的prM80E質(zhì)粒構(gòu)建體稱為pMttWNprM80E。在S2細胞中表達后，prM序列由宿主細胞蛋白酶從80E序列上切除。401個氨基酸的WN-80E重組亞單位蛋白被分泌至培養(yǎng)基。圖1中提供了 WN-80E蛋白的氨基酸序列。使用(i)磷酸鈣共沉淀法或(ii)Cellfectin (Invitrogen Kits, Carlsbad, CA)，根據(jù)制造商的建議，用pMttWNprM80E表達質(zhì)粒和編碼潮霉素抗性的pCoHygro選擇質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化S2細胞。用20 1的表達質(zhì)粒與選擇質(zhì)粒的比例，用20 μ g總DNA共轉(zhuǎn)化細胞。 用 300 μ g/ml 的潮霉素 B(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)選擇轉(zhuǎn)化體。在選擇后，使細胞適應在無血清培養(yǎng)基Excel 420 (JRH, Lenexa, KS)中生長。為了研究表達，在Excel 420,300 μ g/ml潮霉素中培養(yǎng)細胞，并用200 PMCuSO4誘導。以2 X IO6個細胞/ml的密度接種細胞并允許生長6-7天。在最佳條件下，在6-7天的生長后得到大于2 X IO7個細胞/ml的細胞密度。通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡檢查培養(yǎng)物上清中的表達蛋白。為了在蛋白質(zhì)印跡上檢測WN-80E，使用兔多克隆抗西尼羅病毒抗體(BioReliance Corp. , Rockville, MD)或與西尼羅病毒E蛋白交叉反應的兔多克隆抗-DEN純化失活病毒，接著使用抗-兔IgG-堿性磷酸酶綴合的第二抗體。使用NBT/BCIP (Sigma Chem. Co.) 固相堿性磷酸酶底物顯色印跡。使用單克隆抗體(MAb)4G2，通過免疫親和層析(IAC)實現(xiàn)WN-80E蛋白的純化。簡單地說，程序涉及表達后的培養(yǎng)基的澄清。然后將原材料上樣至IAC柱，其包含通過N-羥基琥珀酰亞胺化學法共價連接的固定化的MAb。在樣品上樣后，用包含0.05% (ν/ν)吐溫-20的10 mM磷酸緩沖液(PBS)，pH7. 2 (PBST, 140 mM NaCl)清洗基質(zhì)。用20 mM甘氨酸緩沖液，PH 2. 5從IAC柱上洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。中和洗脫液然后將緩沖液替換為PBS。 通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)使用考馬斯或銀染、蛋白質(zhì)印跡、紫外光吸收和夾心ELISA常規(guī)地分析純化產(chǎn)物，以分別測定純度、身份(identity)、量和生物活性。另外，通過N-端氨基酸測序和氨基酸分析來分析樣品。這些分析提供了純化產(chǎn)物的身份和量的驗證。圖2中顯示了純化的WN-80E蛋白的代表性SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡譜。為了分析，在非還原條件下電泳樣品。WN-80E分子以單個條帶遷移并具有與從氨基酸組成測定的一致的相對分子量(即43kD)。實施例2
在cGMP下牛產(chǎn)WN-80E以支持臨床測試
在cGMP條件下從用pMttprMWN80E質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的S2細胞中制備主細胞庫(MCB)。cGMP制造方法包括將S2 MCB細胞系擴增至攪拌槽生物反應器和然后收獲包含分泌的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基。使用深層濾器通過過濾將細胞從培養(yǎng)基中分離。然后通過使用4G2單克隆抗體的免疫親和層析從得到的澄清上清中純化WN 80Eo免疫親和純化產(chǎn)物然后經(jīng)歷低pH病毒失活步驟和病毒過濾步驟，使用具有能夠去除20nm顆粒的孔徑的PVDF膜來進行。WN-80E蛋白的最終處理包括緩沖液替換和通過超濾濃縮，然后是最終的通過0.2 Mm濾器的過濾。如下所述實現(xiàn)在cGMP下制備WN-80E的代表性批次。解凍MCB小瓶并在10 mL體積的EX-CELL培養(yǎng)基中于^TC下培養(yǎng)5天。將每份培養(yǎng)物擴增至一次性搖瓶。使培養(yǎng)物培養(yǎng)至得到1.5 X 107/mL的細胞密度。合并培養(yǎng)瓶并用于在一次性搖瓶中接種更多的培養(yǎng)物，然后將其培養(yǎng)至得到2 X IO7個細胞/mL的密度。然后在一次性搖瓶中將培養(yǎng)物擴增為多份培養(yǎng)物。將這些培養(yǎng)物培養(yǎng)至得到1. 6 X IO7個細胞/mL的平均細胞密度。合并培養(yǎng)瓶中的細胞并用于接種20L的不銹鋼生物反應器。將培養(yǎng)物培養(yǎng)至得到1.2 X IO7個細胞/mL的細胞密度。將合適量的細胞從20L生物反應器轉(zhuǎn)移至100L不銹鋼生物反應器以得到2 X IO6個細胞/mL的初始細胞密度。將培養(yǎng)物培養(yǎng)至得到>4. 0 X IO6個細胞/mL 的細胞密度。然后通過加入硫酸銅至培養(yǎng)物以得到0.2 mM的終濃度，誘導培養(yǎng)物。然后將培養(yǎng)物培養(yǎng)5天。使用0.45 μ m濾芯(filter cartridge)，接著使用0. 2 μ m濾芯，通過深層過濾收獲100L的培養(yǎng)物。在單個使用袋中以10 L體積收集濾過液并貯存于-20°C。解凍WN-80E整批收獲物(bulk harvest)并通過使材料通過5 μ m孔徑的濾器去除顆粒。將濾過的整批收獲物直接上樣至4G2-瓊脂糖凝膠柱。上樣后，用包含0.05%吐溫-20的11 mM PBS, pH 7. 1 (PBST)洗滌柱，然后通過用甘氨酸緩沖液降低pH洗脫保留的 WN-SOE0合并亞批次，然后通過降低pH至3. 8的終pH并在室溫(15_25°C )孵育材料16-24 小時進行病毒失活，然后將PH調(diào)節(jié)至7.0 士 0.5。使材料通過0.2 μ m的預濾器以去除小顆粒，然后使用20 nm孔徑的膜過濾。然后通過超濾濃縮材料和替換緩沖液，并通過0.2 μ m濾器直接濾入無菌袋完成最終的無菌過濾。在釋放用于配置成HBV-002疫苗前，對純化的WN-80E生物物質(zhì)進行大量的安全性、身份、強度和純度的評估。實施例3
配制HBV-002疫苗用于臨床研究
解凍在實施例2中描述的純化的WN-80E生物物質(zhì)并轉(zhuǎn)移至Class 100層流流動區(qū)。 將WN-80E加入無菌容器并加入無菌Dulbecco，s磷酸緩沖液(DPBS)以得到0. 20 mg/mL的最終蛋白質(zhì)目的濃度。無菌過濾稀釋的WN-80E。加入一定體積的Alhydrogel ‘85至含有 DPBS的無菌容器至14. 0 mg/mL的最終Alhydrogel濃度。然后將WN-80E蛋白溶液定量轉(zhuǎn)移至Alhydrogel懸浮液并在2_8°C下過夜溫和混合。在過夜吸收以后，測定未被吸收的WN-80E蛋白的量。最低75%的吸收是前進至 HBV-002疫苗的填充所必需的。在準備好的無菌小瓶中分裝HBV-002疫苗。用塞子塞住填充的小瓶，封口并壓褶。將填充的HBV-002疫苗小瓶貯存于2-8°C。在臨床研究中使用 HBV-002疫苗之前，進行了大量的安全性、強度、身份、效力和純度的檢測。實施例4
HBV-002 mfp^nm^mir^mm^^m
在臨床試驗中檢測了如實施例3中所述的在cGMP下制造的HBV-002疫苗。在健康成年志愿者中的HBV-002生物產(chǎn)品的1期、標簽開放式、臨床研究評估了具有相同量Alhydrogel ‘85’佐劑的疫苗活性成分(WN-80E)的3種不同劑量水平或不含Alhydrogel ‘85’的WN-80E 的最高劑量水平。受試者在第0、4和8周接受研究疫苗的單次IM注射。在下表1中總結(jié)了研究設(shè)計。表1.臨床研究HBV-002-C-101的設(shè)計
權(quán)利要求
1.一種疫苗，其包含有效量的純化的重組西尼羅病毒囊膜(“E”)蛋白，其中所述E蛋白構(gòu)成野生型E的從其N-端第一位氨基酸殘基開始約80%的長度(WN-80E)，使得當在宿主細胞中重組表達時， 所述E蛋白可被分泌至生長培養(yǎng)基；和有效量的基于鋁的佐劑，其中所述疫苗在人受試者中誘發(fā)中和抗體的產(chǎn)生。
2.權(quán)利要求1的疫苗，其中所述E蛋白在昆蟲宿主細胞中重組產(chǎn)生和表達。
3.權(quán)利要求1的疫苗，其中所述E蛋白在黑腹果蠅(Mrosophilamelanogaster ) Schneider 2 (S2)宿主細胞中重組產(chǎn)生和表達。
4.權(quán)利要求1、2或3的疫苗，其還包含藥學上可接受的賦形劑。
5.權(quán)利要求1、2或3的疫苗，其用于免疫缺陷群體。
6.一種在人中引起保護性免疫應答的方法，其包括以治療可接受的方式施用治療有效量的權(quán)利要求1、2或3的疫苗。
7.—種在人中提供針對西尼羅病毒誘發(fā)的疾病的免疫保護的方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求1、2或3的疫苗，由此提供免患西尼羅疾病的保護。
8.權(quán)利要求4的疫苗，其用于免疫缺陷群體。
9.一種在人中引起保護性免疫應答的方法，其包括以治療可接受的方式施用治療有效量的權(quán)利要求4的疫苗。
10.一種在人中提供針對西尼羅病毒引起的疾病的免疫保護的方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求4的疫苗，由此提供免患西尼羅疾病的保護。
全文摘要
描述了用于人用的西尼羅病毒疫苗，其優(yōu)選地包含截短的西尼羅病毒囊膜糖蛋白的重組產(chǎn)生形式和鋁佐劑。所述疫苗可用于一般群體，包括免疫抑制、免疫受損和免疫衰老個體。所述疫苗可安全和有效地用于所有健康和高危群體。在所述疫苗中也可包含藥學上可接受的載體。
文檔編號A61K39/12GK102481355SQ201080023950
公開日2012年5月30日 申請日期2010年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月31日
發(fā)明者科勒 B., L. 維克斯-萊維 C., A. 奧加塔 S., 佩 V. 申請人:默沙東公司