專利名稱：大腸桿菌o157檢測(cè)條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于疾病檢測(cè)診斷用具技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種大腸桿菌O157檢測(cè)條。
背景技術(shù)：
大腸桿菌是人和動(dòng)物腸道常見菌群之一，也是引起食源性疾病的主要細(xì)菌，可分為致病性和非致病性兩大類。根據(jù)其血清型可將致病性大腸桿菌分為5類產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸粘附性大腸桿菌(EAEC)。大腸桿菌(E.Coli)O157是腸出血性大腸桿菌(EHEC)的主要血清型，可引起出血性腸炎，感染病人的典型癥狀為血便、腹痛、低熱或不發(fā)熱，約有10％的病人發(fā)展為溶血性尿毒綜合癥(HUS)及血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，并可對(duì)被感染病人的腸道、肝、脾、腎、淋巴、腦、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷，平均死亡率2-7％。其危及生命的并發(fā)癥以急性腎功能衰竭、溶血性貧血和血小板減少為特征，老人和兒童為高危人群，易發(fā)生溶血性尿毒癥，死亡率高達(dá)30％以上。世界衛(wèi)生組織已把大腸桿菌(E.Coli)O157出血性腸炎列為新發(fā)傳染病。
控制大腸桿菌O157感染疫情的發(fā)生及蔓延的一個(gè)關(guān)鍵因素在于快速、準(zhǔn)確地從不同標(biāo)本中檢測(cè)出病原菌，從而為綜合防治感染提供可靠的診斷依據(jù)。目前對(duì)大腸桿菌O157尚無理想的快速檢測(cè)方法，主要通過病原分離鑒定，但細(xì)菌培養(yǎng)需要較長(zhǎng)時(shí)間，一般需要24小時(shí)以上，甚至幾天，不利于及時(shí)確診并采取相應(yīng)控制措施。而其他一些輔助診斷方法如凝集實(shí)驗(yàn)、免疫熒光法等，普遍存在靈敏度低、特異性差等問題，有些還需要特殊儀器，操作復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種可快速、準(zhǔn)確地對(duì)大腸桿菌O157進(jìn)行檢測(cè)的大腸桿菌O157檢測(cè)條。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案大腸桿菌O157檢測(cè)條，包括基材，基材上面下部覆蓋有引水材料，引水材料上部與玻璃纖維膜相接，玻璃纖維膜上部與硝酸纖維膜相接，玻璃纖維膜上吸附有抗大腸桿菌O157單克隆標(biāo)記抗體，硝酸纖維膜上自上而下分布有一條包被有抗鼠IgG的質(zhì)控線、一條包被有抗大腸桿菌O157單克隆抗體的檢測(cè)線，玻璃纖維膜及引水材料上覆蓋有覆膜。
所述的抗大腸桿菌O157單克隆抗體可按下述方法制備(1)免疫，滅活大腸桿菌O157:H7稀釋成109cfu/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml，每間隔一周同樣劑量加強(qiáng)注射一次，共4-5次，融合前三天，尾靜脈注射同樣抗原加強(qiáng)免疫；(2)細(xì)胞融合，取免疫小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/O細(xì)胞融合，分種于7塊96孔培養(yǎng)板，置于體積百分比濃度5％CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；(3)篩選，將大腸桿菌O157:H7置于-20℃冰箱冷凍，然后室溫解凍，如此反復(fù)數(shù)次；將其用包被緩沖液做體積比1∶100倍稀釋，包被微孔板，每孔50ul室溫過夜，再用封閉液封閉殘余位點(diǎn)；篩選時(shí)，將50ul培養(yǎng)上清加于微孔中，37℃反應(yīng)40分鐘，洗滌三次，加辣根過氧化物酶，反應(yīng)40分鐘，顯色；(4)克隆，強(qiáng)陽性孔用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到鋪滿孔底1/5時(shí)，再用間接ELISA法檢測(cè)，強(qiáng)陽性孔再克隆，反復(fù)3-4次，至陽性率達(dá)到100％；(5)腹水制備，將雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，注射于經(jīng)過預(yù)處理的BALB/c小鼠腹腔，每只2×105個(gè)，7-10天小鼠腹部隆起，活體穿刺抽取腹水；(6)抗體純化，用辛酸-硫酸銨法將含有單克隆抗體的腹水純化。
本發(fā)明中膠體金制備過程為用體積百分比濃度1％的甲基硅油水溶液硅化所使用的玻璃器皿，將1000ml去離子水加熱煮沸5分鐘，加入重量百分比濃度1％的氯金酸水溶液10ml，加熱混合2分鐘，加入重量百分比濃度1％的檸檬酸三鈉水溶液18ml，快速混合10分鐘，呈現(xiàn)深紅色，冷卻至15-30℃，加入重量百分比濃度1％的PEG水溶液1ml混勻，即得所需膠體金顆粒。膠體金標(biāo)記物制備經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定標(biāo)記抗體的PH為7.0-8.0，最佳標(biāo)記蛋白量為25ug單抗/ml膠體金。取所需量的膠體金溶液，每ml膠體金中加入25ug單抗，室溫?cái)嚢杌旌?0分鐘，加入終止蛋白繼續(xù)攪拌混合20分鐘。將上述標(biāo)記物15000rpm離心60分鐘，棄上清，將沉淀以原體積(膠體金溶液等體積)0.01MPH8.2的PBS水溶液溶解，如上重復(fù)離心兩次。最后沉淀物用0.01MPH8.2的PBS水溶液懸浮，恢復(fù)至原體積的40％，即膠體金結(jié)合物(膠體金標(biāo)記物)。將膠體金結(jié)合物均勻分散于玻璃纖維上，干燥備用。
本發(fā)明中，檢測(cè)線、質(zhì)控線的最佳包被液濃度均為2mg/ml，包被溫度和時(shí)間為37℃、1小時(shí)。
本發(fā)明利用膠體金免疫層析雙抗體夾心法檢測(cè)標(biāo)本中大腸桿菌O157抗原。以膠體金作為標(biāo)記物，以硝酸纖維膜作為包被載體，硝酸纖維膜上包被兩種抗體，一種是抗大腸桿菌O157單克隆抗體，用于捕捉標(biāo)本中的抗原；另一種是兔抗鼠多抗，用于本檢測(cè)條的質(zhì)控。再輔以其他原材料，組裝成檢測(cè)條。檢測(cè)過程中，標(biāo)本利用微孔膜的層析作用移動(dòng)，移動(dòng)過程中發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。標(biāo)本中如含有大腸桿菌O157抗原，首先與膠體金標(biāo)記抗體(Au-Ab)結(jié)合，形成Au-Ab-Ag復(fù)合物，當(dāng)Au-Ab-Ag復(fù)合物遇到膜上包被的抗體時(shí)，即形成Au-Ab-Ag----Ab雙抗體夾心復(fù)合物，呈現(xiàn)目測(cè)可見的紅色條帶，顯色程度與抗原含量成正比。利用本發(fā)明檢測(cè)大腸桿菌O157抗原，方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性好，靈敏度和特異性均達(dá)95％以上；重復(fù)性良好，在線性實(shí)驗(yàn)中，菌量為108、107、106、105cfu/ml的標(biāo)本，經(jīng)測(cè)定顯色呈梯度遞減，顯示顯色程度與抗原含量成正比；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明在4-25℃可保持穩(wěn)定18個(gè)月。


圖1為本發(fā)明結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
大腸桿菌O157檢測(cè)條，包括基材1，基材1上面下部覆蓋有引水材料2，引水材料2上部與玻璃纖維膜3相接，玻璃纖維膜3上部與硝酸纖維膜4相接，玻璃纖維膜3上吸附有抗大腸桿菌O157單克隆標(biāo)記抗體，硝酸纖維膜4上自上而下分布有一條包被有抗鼠IgG的質(zhì)控線、一條包被有抗大腸桿菌O157單克隆抗體的檢測(cè)線，玻璃纖維膜3及引水材料2上覆蓋有覆膜5。
所述的抗大腸桿菌O157單克隆抗體可按下述方法制備(1)免疫，滅活大腸桿菌O157:H7稀釋成109cfu/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml，每間隔一周同樣劑量加強(qiáng)注射一次，共4-5次，融合前三天，尾靜脈注射同樣抗原加強(qiáng)免疫；(2)細(xì)胞融合，取免疫小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，分種于7塊96孔培養(yǎng)板，置于體積百分比濃度5％CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；(3)篩選，將大腸桿菌O157:H7置于-20℃冰箱冷凍，然后室溫解凍，如此反復(fù)數(shù)次；將其用包被緩沖液做體積比1∶100倍稀釋，包被微孔板，每孔50ul室溫過夜，再用封閉液封閉殘余位點(diǎn)；篩選時(shí)，將50ul培養(yǎng)上清加于微孔中，37℃反應(yīng)40分鐘，洗滌三次，加辣根過氧化物酶，反應(yīng)40分鐘，顯色；(4)克隆，強(qiáng)陽性孔用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到鋪滿孔底1/5時(shí)，再用間接ELISA法檢測(cè)，強(qiáng)陽性孔再克隆，反復(fù)3-4次，至陽性率達(dá)到100％；(5)腹水制備，將雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，注射于經(jīng)過預(yù)處理的BALB/c小鼠腹腔，每只2×105個(gè)，7-10天小鼠腹部隆起，活體穿刺抽取腹水；(6)抗體純化，用辛酸-硫酸銨法將含有單克隆抗體的腹水純化。
單克隆抗體采用兩兩配對(duì)法篩選，篩選出兩株單抗，一株做為包被抗體，一株做為標(biāo)記抗體。檢測(cè)線和質(zhì)控線包被用包被液濃度均可選擇2mg/ml、3mg/ml或者4mg/ml，包被溫度和時(shí)間為37℃1小時(shí)。
權(quán)利要求
1.大腸桿菌0157檢測(cè)條，包括基材，基材上面下部覆蓋有引水材料，引水材料上部與玻璃纖維膜相接，玻璃纖維膜上部與硝酸纖維膜相接，其特征在于，玻璃纖維膜上吸附有抗大腸桿菌0157單克隆標(biāo)記抗體，硝酸纖維膜上自上而下分布有一條包被有抗鼠IgG的質(zhì)控線、一條包被有抗大腸桿菌0157單克隆抗體的檢測(cè)線，玻璃纖維膜及引水材料上覆蓋有覆膜。
2.如權(quán)利要求1所述的大腸桿菌0157檢測(cè)條，其特征在于，所述的抗大腸桿菌0157單克隆抗體可按下述方法制備(1)免疫，滅活大腸桿菌0157H7稀釋成109cfu/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml，每間隔一周同樣劑量加強(qiáng)注射一次，共4-5次，融合前三天，尾靜脈注射同樣抗原加強(qiáng)免疫；(2)細(xì)胞融合，取免疫小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，分種于7塊96孔培養(yǎng)板，置于5％CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；(3)篩選，將大腸桿菌0157:H7置于-20℃冰箱冷凍，然后室溫解凍，如此反復(fù)數(shù)次；將其用包被緩沖液做1∶100倍稀釋，包被微孔板，每孔50ul室溫過夜，再用封閉液封閉殘余位點(diǎn)；篩選時(shí)，將50ul培養(yǎng)上清加于微孔中，37℃反應(yīng)40分鐘，洗滌三次，加辣根過氧化物酶，反應(yīng)40分鐘，顯色；(4)克隆，強(qiáng)陽性孔用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到鋪滿孔底1/5時(shí)，再用間接ELISA法檢測(cè)，強(qiáng)陽性孔再克隆，反復(fù)3-4次，至陽性率達(dá)到100％；(5)腹水制備，將雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，注射于經(jīng)過預(yù)處理的BALB/c小鼠腹腔，每只2×105個(gè)，7-10天小鼠腹部隆起，活體穿刺抽取腹水；(6)抗體純化，用辛酸-硫酸銨法將含有單克隆抗體的腹水純化。
全文摘要
大腸桿菌O157檢測(cè)條，包括基材，基材上面下部覆蓋有引水材料，引水材料上部與玻璃纖維膜相接，玻璃纖維膜上部與硝酸纖維膜相接，玻璃纖維膜上吸附有抗大腸桿菌O157單克隆標(biāo)記抗體，硝酸纖維膜上自上而下分布有一條包被有抗鼠IgG的質(zhì)控線、一條包被有抗大腸桿菌O157單克隆抗體的檢測(cè)線，玻璃纖維膜及引水材料上覆蓋有覆膜。利用本發(fā)明可快速、準(zhǔn)確地對(duì)大腸桿菌O157進(jìn)行檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/531GK101051050SQ20071005439
公開日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2007年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月14日
發(fā)明者王偉, 青震濤, 刁琳琪, 王蕓, 寧捷 申請(qǐng)人:鄭州萬泰生物科技有限公司