專利名稱：一種檢測大腸桿菌的新型熒光生物傳感器的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及 一 種共軛聚電解質(zhì)誘導熒光放大的超靈敏、高選擇性大腸桿菌0157 :H7新 型熒光生物傳感器的制備方法。
背景技術：
隨著納米科學技術在生物傳感器領域的滲透，生物傳感器領域進展最快、研究最多的兩 大類型是電化學生物傳感器與光學生物傳感器。由于電化學生物傳感器具有靈敏度高、易微 型化、能在渾濁的溶液中操作等優(yōu)點，且所需的儀器簡單、便宜。因而被廣泛地應用于生物 傳感器制備;相比而言，光學生物傳感器的優(yōu)點在于無需參比電極，不受電磁場的干擾，可 以在非平衡條件下測量某些物質(zhì)(如氧)，穩(wěn)定性好，尤其是在雙波長的情下，可采用不同的
波長監(jiān)測同一物質(zhì)的不同狀態(tài)，但缺點是易受背景光的干擾，動力學范圍較窄，不易于小型 化，試布)的穩(wěn)定性也存在一定的問題等。針對以上問題通常從兩個方面著手通過模板擴增 在識別體系中引入各種生化反應(如酶切、延伸、聯(lián)接和擴增等反應，如Taqman探針與分 子信標〉來提高對生物分子識別能力，提高靈敏度和特異性?；蛘呃眯盘柗糯蠹床捎酶鞣N 化學標記和物理檢測方法來放大生物識別過程的微小差異，從而提高檢測的靈敏度和特異性。 這些方法包括各種納米標記、熒光標記、銀染技術、分支DNA標記、酶放大標記等生物和化 學放大技術等。從而使生物傳感器的接受器、換能器或者檢測器各部分的過程、反應或信號 能直接或間接的放大。
腸出血性大腸桿菌0157:H7感染性腹瀉是近年來新發(fā)現(xiàn)的危害嚴重的腸道傳染病，它除 引起腹瀉、出血性腸炎外，還可發(fā)生溶血性尿毒綜合癥(HUS)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP) 等嚴重的并發(fā)征，后者病情兇險，病死率高。研究發(fā)現(xiàn)只要有10個大腸桿菌0157:H7就足 以致病。目前，常用的大腸桿菌0157:H7檢測方法主要有三類細菌學分離、免疫學檢測以 及分子生物學檢測。細菌學分離耗時長，操作煩瑣，不利于及早診斷。臨床上主要采用免疫 磁珠法和血清特異性抗體檢測。免疫法雖然特異性高，但檢測限低，往往僅達到103 108CFU/ml，而且需要兩次增菌，耗時長，也不利于疾病的早期診斷。分子生物學檢測技術雖 然靈敏度高，尤其是采用最新的DNA探針技術或者基因芯片技術可以達到102 103CFU/ml 甚至幾十CFU/ml的最低檢測限，但是往往會出現(xiàn)一定的假陽性，而且需要大型設備、專業(yè) 及人員，不利于在基層醫(yī)療機構和環(huán)境監(jiān)測中的推廣。表格1是關于常用的大腸桿菌0157:H7 檢測方法的對比。
3常見檢測方法及其靈敏度檢測方法時間靈敏度
DNA探針技術lh103 CFU/mL
基因芯片技術—6X103CFU/mL
酶免疫分析技術2h10 108CFU/mL
熒光免疫測定技術6h10 105 CFU/mL
化學發(fā)光免疫分析技術—103 104CFU/mL
壓電晶體免疫傳感器30 —50 min103 108CFU/mL
表面聲波免疫傳感器3h106 CFU/mL
表面等離子體共振免疫傳感器35 min107 CFU/mL
自動化儀器30 min100~600 CFU/mL
近年來，利用高度熒光、水溶性的共軛聚電解質(zhì)分子結構發(fā)展的一大類可對生物分子進行 實時檢測的高靈敏度檢測體系，受到人們的廣泛關注，并且相關研究進展很快[1]。共軛聚電解 質(zhì)包括聚吡咯、聚噻吩、聚苯乙烯等，它們由較大的有效共軛單元構成，彼此間存在著有效的 電子耦合和具有快速的分子鏈內(nèi)和鏈間的能量或電子轉移能力，因此基于此類型的生物傳感器 能夠對一些微小的擾動給予積極的響應。與其它小分子體系的生物傳感器相比，其靈敏度能得
到很大的提高。由于這類集體性的響應可影響到化合物一系列的光電子性能，諸如F6rster的 熒光共振能量轉移(FRET)，電導能力，熒光發(fā)光效率等，因此將之用作為熒光生物傳感器非 常合適。與傳統(tǒng)的生物傳感器相比，共軛聚電解質(zhì)生物傳感器由于共軛聚合物光電特性的"放 大作用"而具有極高的靈敏度，同時聚合物的光電特性的變化是在極快的過程中完成，保證了 檢測的快速性。因此，共軛聚電解質(zhì)熒光生物傳感器很快成為了國際上的一個新的研究熱點。 發(fā)明目的
本發(fā)明的目的是為了提供一種檢測大腸桿菌的新型熒光生物傳感器的制備方法，通過利 用磁粒捕獲富集待分析樣本的特定的生物分子(大腸桿菌0157:H7抗原)，產(chǎn)生帶熒光標記的 生物分子識別體系(抗原抗體結合體)。隨后加入水溶性共軛聚電解質(zhì)，通過共軛聚電解質(zhì)誘 導與靜電作甩等，共軛聚電解質(zhì)之間的超分子識別可形成超分子熒光復合物體系。該熒光復 合物經(jīng)共軛聚電解質(zhì)的光或電激發(fā)，導致原熒光標記信號產(chǎn)生數(shù)千甚至百萬倍數(shù)量級的超級 熒光放大，從而形成超靈敏、高選擇性生物傳感器。
發(fā)明內(nèi)容
研究制備出一種共軛聚電解質(zhì)誘導熒光放大的超靈敏、高選擇性大腸桿菌0157:H7生物
4傳感器原型，應用于大腸桿菌0157:H7超靈敏檢測。 本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)
磁粒識別捕獲大腸桿菌0157:H7抗原、剪切分離后與陽離子共軛聚電解質(zhì)(CCP)形成超 分子熒光復合物，包括下列步驟-
1) 利用制備好的磁性顆粒經(jīng)表面生物功能化修飾上二抗，用熒光素標記一抗，帶有標記 的一抗與二抗結合形成抗體復合物，用抗體復合物處理大腸桿菌0157:H7抗原樣品，形成抗 原-帶標記的一抗-二抗復合體。
2) 經(jīng)磁分離與洗滌后，利用甘氨酸-鹽酸緩沖液在一抗和二抗之間水解，形成帶負電的 熒光標記的抗原抗體結合物。
3) 分離后帶負電的抗原抗體結合物與陽離子共軛聚電解質(zhì)(CCP)特異性結合后，形成 超分子識別體系，經(jīng)CCP光激發(fā)導致共振能量轉移(FRET)，原熒光標記信號出現(xiàn)超級放大， 實現(xiàn)熒光生物傳感器功能。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術具有如下優(yōu)點
1) 通過水溶性共軛聚電解質(zhì)的制備與誘導的熒光放大效應，實現(xiàn)新型熒光生物傳感器的 制備與生物分子的超靈敏識別，方法簡單，實用性強；原創(chuàng)思想新穎獨特。
2) 較之原來使用熒光探針標記檢測生物分子的方法，經(jīng)共軛聚電解質(zhì)的超級放大后，靈 敏度更高，極大地拓展了生物分子超靈敏檢測的范圍，可望突破現(xiàn)在大腸桿菌0157:H7抗原檢 測限。
3) 通過微陣列化，可將本類新型熒光生物傳感器應用于現(xiàn)有實際生物醫(yī)學傳感與檢測領 域的現(xiàn)場診斷與疾病篩選、分析領域，突破并實現(xiàn)比現(xiàn)行生物芯片或者PCR相關技術更靈敏的 熒光生物傳感檢測新技術。
4) 提出磁粒原位法熒光生物傳感器與剪切點樣法熒光生物傳感器兩種新方案來實現(xiàn)大腸 桿菌超靈敏檢測，具有顯著的技術創(chuàng)新意義與商業(yè)價值。
圖1為實施方案I的流程圖2為實施方案n的流程圖。
具體實施方式
實施方案I:
圖1表示固相微陣列的制備過程之一磁粒原位法熒光生物傳感器微陣列的制備法。各 步驟及原理簡要說明如下l)將固相微陣列化的磁性顆粒表面修飾上二抗，利甩熒光探針(如熒光素)標記一抗，再將帶有熒光標記的一抗與二抗結合形成抗體復合物；2)利用制備好的 用抗體復合物處理大腸桿菌0157:H7抗原樣品，得到帶有負電荷的大腸桿菌0157:H7抗原抗 體結合物；3)磁性顆粒上的負電荷抗原抗體結合物與陽離子共軛聚電解質(zhì)(CCP)特異的結 合后，形成超分子識別體系，經(jīng)CCP光激發(fā)導致共振能量轉移(FRET)，磁粒上抗原抗體結 合物原熒光標記信號出現(xiàn)超級熒光放大。從而實現(xiàn)磁粒原位法熒光生物傳感器微陣列的功能。
實施方案n:
圖2表示固相微陣列的制備過程之二剪切點樣法熒光生物傳感器微陣列的制備法。各 步驟及原理簡要說明如下1)磁性顆粒經(jīng)表面生物功能化修飾上二抗，用熒光探針(如熒光 素)標記一抗，帶有標記的一抗與二抗結合形成抗體復合物；2)利用抗體復合物處理大腸桿
菌0157:H7抗原樣品，再經(jīng)過剪切、磁分離過程得到帶負電荷的大腸桿菌0157:H7抗原抗體 結合物;3)帶負電荷大腸桿菌0157:H7抗原抗體結合物經(jīng)過點樣與陽離子共軛聚電解質(zhì)(CCP) 特異的結合后，形成超分子識別體系微陣列，經(jīng)CCP光激發(fā)導致共振能量轉移(FRET)，原 熒光標記信號出現(xiàn)超級熒光放大。從而成功實現(xiàn)剪切點樣法熒光生物傳感器功能。
權利要求
1、一種檢測大腸桿菌新型的熒光生物傳感器的制備方法，包括下述步驟(a)利用制備好的磁性顆粒經(jīng)表面生物功能化修飾上二抗，用熒光素標記一抗，帶有標記的一抗與二抗結合形成抗體復合物，用抗體復合物處理大腸桿菌0157H7抗原樣品，形成抗原-帶標記的一抗-二抗復合體。(b)經(jīng)過磁分離與洗滌過程后，利用甘氨酸-鹽酸緩沖液在一抗和二抗之間水解，形成帶負電的熒光標記的抗原抗體結合物。(c)分離后帶負電的抗原抗體結合物與陽離子共軛聚電解質(zhì)(CCP)特異性結合后，形成超分子識別體系，經(jīng)CCP光激發(fā)導致共振能量轉移(FRET)，原熒光標記信號出現(xiàn)超級放大，實現(xiàn)熒光生物傳感器功能。
2、 根據(jù)權利要求1所述的生物傳感器制備的方法，其特征在于運用熒光素 標記的一抗與二抗以及大腸桿菌0157:H7抗原形成復合體。
3、 根據(jù)權利要求1所述的生物傳感器制備的方法，其特征在于所述步驟(c) 中的熒光信號放大是通過帶負電的抗原抗體結合體與陽離子共軛聚電解質(zhì)的特 異性結合后經(jīng)CCP光激發(fā)導致共振能量轉移來實現(xiàn)的。
4、 根據(jù)權利要求1、 3所述的一種檢測大腸桿菌熒光的新型生物傳感器的制備方 法，其特征在于所述步驟(c)中特異性的結合可以調(diào)整點樣密度從而實現(xiàn)微陣 列化，以提高檢測能力。
5、 根據(jù)權利要求1、 3或4所述的生物傳感器的制備方法，其特征在于運 用磁粒原位法和剪切點樣法兩種制備方法來實現(xiàn)熒光生物傳感器的功能。
全文摘要
本方法利用磁性粒子負載抗體，捕獲抗原，通過水溶性共軛聚電解質(zhì)誘導產(chǎn)生熒光放大來開發(fā)檢測大腸桿菌O157:H7的超靈敏熒光生物傳感器。首先利用磁粒捕獲大腸桿菌O157:H7抗原，產(chǎn)生帶熒光標記的抗原抗體結合體。隨后加入水溶性共軛聚電解質(zhì)，利用共軛聚電解質(zhì)誘導與靜電作用，使抗原抗體結合體與共軛聚電解質(zhì)之間的超分子識別形成超分子熒光復合物體系。該熒光復合物經(jīng)共軛聚電解質(zhì)的光或電激發(fā)，導致原熒光標記信號產(chǎn)生數(shù)千甚至百萬倍數(shù)量級的超級熒光放大，從而形成超靈敏熒光生物傳感器。本生物傳感器體系基于水溶性共軛聚電解質(zhì)的熒光增敏增效，可用于大腸桿菌O157:H7等一些急性傳染病菌的快速超靈敏檢測。
文檔編號G01N33/536GK101470113SQ20081003103
公開日2009年7月1日 申請日期2008年4月9日 優(yōu)先權日2008年4月9日
發(fā)明者曾曉希, 賀全國, 黃景科 申請人:湖南工業(yè)大學;賀全國;黃景科;曾曉希