專利名稱：輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物物質的測試和分析所用物質，尤其涉及生物物質的免疫檢測所用檢測盒。
背景技術：
輪狀病毒是引起急性腸胃炎的主要原因，特別作用于2歲以下的兒童，大約40%患腸胃 炎的兒童糞便中可檢測到輪狀病毒。腸道病毒引起的腸胃炎在危險人群中，比如兒童、中 年以上的或抑制免疫的人，是可致命的。在氣候暖和的地方，輪狀病毒感染通常在冬季發(fā)生。 他們的傳播是口-糞途徑，潛伏期l-3天，典型的癥狀包括嘔吐、3-8天水樣腹瀉、高燒和胃 痛，第一次感染后，免疫性是不完全的，但之后的感染與首次相比往往不是很嚴重。輪狀病 毒也是引起急性腹瀉最普遍的原因，據(jù)統(tǒng)計，在發(fā)展中國家，每年由于輪狀病毒感染引起的 死亡有1，000，000人，其中有20-25 %是由腹瀉引起，引起兒童的死亡中6%都在5歲以下。
腺病毒是引起兒童病毒胃腸炎的第二原因，大約10-15%患腸胃炎的兒童糞便中可檢測 到腺病毒。目前被識別的腺病毒血清型已超過47種，所有種類的腺病毒都有一個共同的hexon 抗原，腺病毒也能引起呼吸疾病，而有些血清型腺病毒還可引起結膜炎、膀胱炎等。血清型 40和41腺病毒與胃腸炎最具關聯(lián)性，腺病毒引起的胃腸炎臨床的主要癥狀是腹瀉，可持續(xù) 9-12天，也有發(fā)燒和嘔吐，但通常是良性的。
一方面，由于培養(yǎng)輪狀病毒和腺病毒比較復雜，所以培養(yǎng)通常不用作診斷的方法。另一 方面，診斷技術的發(fā)展現(xiàn)已能夠快速直接地檢查糞便中的病毒微粒，比如免疫層析技術的應 用，單一地檢測糞便中是否存在輪狀病毒或腺病毒的檢測用物質和檢測方法已得到廣泛的應 用，如中國專利CN1814790所公開的一種輪狀病毒的RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法， 試劑盒包括MLV反轉錄酶、Rnasin、 DNA聚合酶、引物、dNTP、 MgC12、 10x緩沖液，其中上 游引物P1為5' -GTA TGG TAT TGA ATA TAC CAC-3',下游引物P2為5' -GAT CCT GTT GGC CAT CC-3， RT-PCR檢測方法包括提取待測樣品模板；在PCR薄壁管中加入MLV反轉錄酶、 Rnasin、 DNA聚合酶、引物、dNTP、 MgC12、 10x緩沖液、待測樣品模板和DEPC水，混勾后 置PCR儀上擴增；在電泳設備中電泳擴增產(chǎn)物，記錄結果；分析并進行結果判斷；又如中 國專利CN1406285所公開的一種腺病毒的檢測與定量方法，使用同義或反義變性的引物對通 過實時PCR擴增腺病毒的核苷酸序列，引物由具有至少80%同源的寡核苷酸混合物組成，它 具有一個包括在5型腺病毒序列的21000-22000個核苷酸之間的序列，在足以能夠得到可測 量量的擴增產(chǎn)物的若干循環(huán)期間，使用非變性探針檢測擴增反應的產(chǎn)物，該探針由至少一種
具有至少80%同源的寡核苦酸組成，它具有一個包括在5型腺病毒序列的21000-22000個核 苷酸之間的序列。
可見，現(xiàn)有技術在對兒童腹瀉現(xiàn)象的病因進行分析的時候，通常需要進行兩道檢測一 次是針對輪狀病毒， 一次是針對腺病毒，費時、費力并費料。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服上述的對兒童腹瀉現(xiàn)象的病因進行分析的時候須對輪狀病毒和腺
病毒分別單獨檢測缺陷，而構建一種新的檢測盒，可以一次性地、快速高效地檢測出糞便樣
品中的輪狀病毒和腺病毒。
本發(fā)明實現(xiàn)上述目的所采用的具體技術方案是，生產(chǎn)制造一種輪狀病毒及腺病毒二合一
檢測盒，包括測試物和糞便稀釋液，該測試物由層析膜和吸水材料組成，該測試物包括 第一區(qū)域，包括吸水材料制成的吸收墊，用以初試接觸樣品； 第二區(qū)域，包括輪狀病毒單克隆抗體和腺病毒單克隆抗體包被的膠乳微粒； 第三區(qū)域，包括肉眼不可見的三條橫向平行線層析膜，第一條有特異的抗-腺病毒抗體，
第二條有特異的抗-輪裝病毒抗體，第三條是質控線；和，
第四區(qū)域，包括吸水材料制成的吸收墊。
該第三區(qū)域的三條線，第一條為第一種顏色的聚苯乙烯微粒與抗-腺病毒單克隆抗體包 被，第二條為第二種顏色的聚苯乙烯微粒與抗-輪狀病毒單克隆抗體包被，第三條為第三種顏 色的聚苯乙烯微粒。
該第一種顏色為藍色，該第二種顏色為紅色，該第三種顏色為綠色。
同現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒，使用方便，可省時、省力 并省料地用于檢測成人及嬰幼兒病毒性胃腸炎引起的急性腹瀉、嘔吐、高燒和胃痛。
具體實施例方式
以下對本發(fā)明予以詳盡說明。
本發(fā)明的輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒，主要是應用彩色高分子乳膠標記免疫層析法 同時檢測人糞便中的輪狀病毒和腺病毒，屬臨床體外診斷試劑。
非膠體金的高分子微球，以單分散相存在，制備出的標記液分散均勾，易于噴涂、易于 流動及顯色均勾易于觀察，且靈敏度高；并且，亦具有不同分子量、不同結構形態(tài)與表面特 征及在表面上引入不同功能基團的聚合物微球；具有比表面大，吸附性強及較高的力學性能 和優(yōu)良的耐溶劑性，方便回收重復利用等優(yōu)點，易于與抗體(抗原)聯(lián)接；該種彩色微球反
應活性大，與細胞結合迅速且無非特異性吸附，與抗體結合后的微球被用來標記細胞表面抗
原，其性能優(yōu)于其它類型的微球；其中，以聚苯乙烯微球最為廣泛。
通常采用乳液聚合法，以苯乙烯、丙烯酰胺、丙烯酸及有機染料為原料，經(jīng)過共聚、酰 肼化和疊氮化合成彩色高分子微球，根據(jù)所加入油溶性染料的不同而顯不同的顏色。其合成
受pH值、有機溶劑、電解質濃度等因素的影響。將彩色單體與苯乙烯共聚，經(jīng)透析提純即可
制得彩色膠乳，現(xiàn)可制備出紅、蘭、綠、黃等彩色品種。
本發(fā)明的檢測原理是基于單克隆抗體和病毒抗原的相互作用輪狀病毒單克隆抗體 (MAb)和A組輪狀病毒共有的VP6抗原；腺病毒單克隆抗體(MAb )和所有已知的人類亞 型中出現(xiàn)的抗原h(huán)exon;紅色聚苯乙烯微粒與抗輪狀病毒單克隆抗體包被，藍色聚苯乙烯微 粒與抗腺病毒單克隆抗體包被；綠色聚苯乙烯微粒用作檢測質控。
本發(fā)明的輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒，包括測試卡或測試條、糞便稀釋液和使用說 明書。依照巿場需要設計，它可能還包括釆集標本的測試管或標本提取設備。
測試卡或測試條與干燥物質包裝，操作方便。
稀釋緩沖液用TRIS鹽溶液，含有清潔劑和抗菌劑。
輪狀病毒/腺病毒測試條為一種半剛性的塑膠條，作為測試系統(tǒng)的媒介物使用，由層析膜 和吸水材料組成，在輪狀病毒/腺病毒檢測卡中，檢測條包被在塑膠盒子內，包括依次排列的 四個區(qū)域
第一區(qū)域低端，或"樣品端"，由浸入標本(檢測條)或吸收標本(檢測卡)的吸收墊 組成；
第二區(qū)域包含輪狀病毒和腺病毒單克隆抗體包被的膠乳微粒，覆膜保護(檢測條)或 裝在卡里(檢測卡)；
第三區(qū)域測試窗，由肉眼不可見的三條橫向平行線層析膜組成，第一條線有特異的抗-腺病毒抗體，第二條有特異的抗-輪裝病毒抗體，第三條是質控線，該區(qū)域包含的線條用透明 的膠粘材料保護；
第四區(qū)域頂端，由標記有測試名稱的保護膜和吸收墊組成，該區(qū)為手持區(qū)，當檢測時 為手持區(qū)域(檢測條)。
糞便標本應在癥狀開始后盡快收集采取，第一次癥狀出現(xiàn)后一周，病毒開始減少，會使 診斷更加困難；標本應盡可能有代表性，采取標本后，于4'C環(huán)境保存，如果當天不能進行 測試，可于-2(TC環(huán)境冷凍保存。
本發(fā)明的輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒的使用方法是
在不使用萃取瓶的情況，每個標本取一個測試管，加約l-1.5ml緩沖液，接下來，取少 量糞便(30-50mg固體糞便或100ijl液體糞便)，于緩沖液中懸浮。如果使用棉簽，把它沉浸
在緩沖液中，在試管壁上旋轉擠壓；震蕩幾秒鐘之后，插入測試條，檢測時保證液面不超過 設定的標度，等待5分鐘以上，但不超過10分鐘，觀察結果；或者，
在使用萃取瓶的情況，如果試劑盒里沒有緩沖液，旋開萃取瓶的頂端，注入l-1.5ml緩 沖液，用采集器頂端采取足量糞便(30-50mg固體糞便或100|jl液體糞便)，把它放入瓶中， 旋緊瓶蓋，并充分搖動。然后折斷瓶頸，向第一區(qū)域中滴加4滴標本，加液體時不能加入固 體微粒，等待5分鐘以上，但不超過10分鐘，觀察結果。
結果判斷如下
如果僅有一條綠色線出現(xiàn)在測試窗，結果為陰性的； 如果出現(xiàn)綠色線，同時在測試窗處有一紅色線，結果為輪狀病毒陽性； 如果出現(xiàn)綠色線，同時在測試窗處有一藍色線，結果為腺病毒陽性； 如果所有三條線均出現(xiàn) 一條綠色線、 一條紅色線、 一條藍色線，結果為混合感染； 如果沒有線條出現(xiàn)，測試無效；
測試超過10分鐘以上的，不能用于解釋結果，偶爾， 一些樣品會有不明顏色的淡色的線 條出現(xiàn)，在大多數(shù)情況下，這一顯示結果判為陰性。
本發(fā)明的輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒的工作原理是
測試條， 一旦于第一區(qū)域加入標本，層析過程就開始，使得第二區(qū)域中的有色微粒移動 到第三區(qū)域，如果標本中含有腺病毒，它的抗原在第二區(qū)域會與藍色微粒包被的抗體反應， 如果標本中含有輪狀病毒，它的抗原在第二區(qū)域會與加入紅色微粒的抗體反應，形成的紅色 微粒-抗體-病毒復合物延伸到第三區(qū)域的第一條線，與包被在那的抗-腺病毒抗體或下一條 線的抗-輪狀病毒抗體反應， 一條線出現(xiàn)，無論藍色或紅色，其強度隨層析測試的進行而增加， 線的強度也依賴于病毒的濃度；如果標本是陰性的，它不含有與第二區(qū)域中藍色和紅色膠乳 微粒包被的抗體反應的病毒。微粒-抗體-病毒復合物不能形成，也就不會與第三區(qū)域的第一 條和第二條線的a-病毒抗體相互反應，這些線條在層析測試進行中保持不顯色。
敏感性測試輪狀病毒準備實際標本中的純化病毒蛋白數(shù)量；腺病毒準備重組hexon 抗原?；诙鄠€測試人員在不同條件下對不同批號產(chǎn)品的大量測試，得出了典型的敏感性結 果輪狀病毒31ng/ml和腺病毒31ng/ml。同時，檢測到測試10分鐘后更小的數(shù)量輪狀病 毒8ng/ml，腺病毒4ng/ml。這些測試可確證兩種目標物的敏感性在31ng/ml以上。
穩(wěn)定性測試
有效期和批號在每個試劑盒上注明。測試卡(或條)和緩沖液可在室溫或冰箱中保存。 如果貯存于冰箱，在使用前必須達到室溫；
經(jīng)過不同時間段用檢測條所獲得的結果，產(chǎn)品生產(chǎn)后正常條件下(室溫并包裝良好)保 存，顯示數(shù)據(jù)和其他類似產(chǎn)品的有效期在生產(chǎn)后均可達24個月；
不同批生產(chǎn)的檢測條貯存于含有無水硅膠試管中，室溫(18-28°C )保存，并在不同時間 間隔進行分析。陽性糞便提取用內控輪狀病毒-腺病毒連續(xù)的1:2的糞便緩沖液稀釋。10分 鐘判讀結果；
本發(fā)明的輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒，輪狀病毒/腺病毒檢測卡(條)對濕度是非常 敏感的，可導致檢測卡(條)無效。 一次必須防潮，包裝時需放干燥劑。如果在管里，取出 測試條后，蓋始終要蓋好。如果管是冷藏于冰箱中，為了避免檢測條收縮，等達到室溫后再 打開。
標本和原料相容性用于測試的標本(人糞便)與反應裝置和其他不同組分是完全相容 的。接合層、膜、標本吸收墊、端吸收墊、上接合層、塑膠設備；
標本與檢測盒中其它物質也是相容的加樣器移液管和(或)滴管；干燥物無水硅 膠；產(chǎn)品容器鋁箔袋。
本發(fā)明的輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒，操作非常簡單，不需要任何實驗設備。
檢測快捷，萃取后，可在5-10分鐘判讀結果。
結果易觀察，肉眼觀察可見紅色或藍色線。
靈敏度高大多數(shù)為31ng/ml。
當然，本發(fā)明的輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒也還是存在局限性大量的糞便標本測 試結果顯示，在所用樣品中，具有良好的測試性能和可靠性。然而，不排除一些標本有干涉 或不相容物質的可能性；過量的標本會導致不明確的沒有診斷價值的褐色線出現(xiàn)。在這種情 況下，可用更多的緩沖液稀釋標本并重做測試；陰性結果不能完全排除腸道腺病毒和輪狀病 毒感染的可能。診斷的意義必須結合病人的臨床癥狀來評價；某些標本的測試會導致不明顏 色的或較微弱的線條出現(xiàn)，大多數(shù)情況下判為陰性。因此，當測試到不明顯顏色或較淡的線 條時，報告結果時應特別注意。
以上所述之最佳實施例意在具體說明本發(fā)明的思路在一測試條/卡上同時檢測輪狀病毒 及腺病毒，以不同的顏色作為檢測信號。本發(fā)明之實施，并不限于以上最佳實施例所公開的 方式，凡基于本發(fā)明之設計思路，進行簡單推演與替換，得到的具體的輪狀病毒及腺病毒二 合一檢測盒，都屬于本發(fā)明的實施。
權利要求
1、一種輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒，包括測試物和樣品稀釋液，該測試物由層析膜和吸水材料組成，其特征在于，該測試物包括第一區(qū)域，包括吸水材料制成的吸收墊，用以初試接觸樣品；第二區(qū)域，包括輪狀病毒單克隆抗體和腺病毒單克隆抗體包被的膠乳微粒；第三區(qū)域，包括肉眼不可見的三條橫向平行線層析膜，第一條有特異的抗-腺病毒抗體，第二條有特異的抗-輪裝病毒抗體，第三條是質控線；第四區(qū)域，包括吸水材料制成的吸收墊。
2、 如權利要求l所述的輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒，其特征在于該樣品稀釋液為 含清潔劑和抗菌劑的TRIS鹽溶液。
3、 如權利要求l所述的輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒，其特征在于，還包括采集樣 品的測試管或樣品提取設備。
4、 如權利要求l所述的輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒，其特征在于該第三區(qū)域的三 條線均用透明的膠粘材料保護。
5、 如權利要求l所述的輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒，其特征在于，該第四區(qū)域還包 括標記有測試名稱的保護膜。
6、 如權利要求1所述的輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒，其特征在于該測試物為條式， 該第一區(qū)域的吸收墊以浸入的方式初試接觸樣品；該第二區(qū)域的膠乳用微粒覆膜保護；該第 四區(qū)域為手持區(qū)。
7、 如權利要求1所述的輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒，其特征在于該測試物為卡式， 該第一區(qū)域的吸收墊以吸收的方式初試接觸樣品；該第二區(qū)域的膠乳微粒裝在塑膠卡內。
8、 如權利要求l所述的輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒，其特征在于該測試物包被在 塑膠盒子內。
9、 如權利要求1至8任一所述的輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒，其特征在于該第三 區(qū)域的三條線，第一條為包被抗-腺病毒單克隆抗體的第一種顏色的聚苯乙烯微粒，第二條為 包被抗-輪狀病毒單克隆抗體的第二種顏色的聚苯乙烯微粒，第三條為第三種顏色的聚苯乙烯 微粒。
10、 如權利要求9所述的輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒，其特征在于該第三區(qū)域的 三條線，該第一種顏色為藍色，該第二種顏色為紅色，該第三種顏色為綠色。
全文摘要
一種輪狀病毒及腺病毒二合一檢測盒，包括測試物和糞便稀釋液，該測試物由層析膜和吸水材料組成，該測試物包括第一區(qū)域，包括吸水材料制成的吸收墊，用以初試接觸樣品；第二區(qū)域，包括輪狀病毒單克隆抗體和腺病毒單克隆抗體包被的膠乳微粒；第三區(qū)域，包括肉眼不可見的三條橫向平行線層析膜，第一條有特異的抗-腺病毒抗體，第二條有特異的抗-輪裝病毒抗體，第三條是質控線；第四區(qū)域，包括吸水材料制成的吸收墊。使用方便，可省時、省力并省料地用于檢測成人及嬰幼兒病毒性胃腸炎引起的急性腹瀉、嘔吐、高燒和胃痛。
文檔編號G01N33/558GK101339194SQ200710076288
公開日2009年1月7日 申請日期2007年7月2日 優(yōu)先權日2007年7月2日
發(fā)明者翔 高 申請人:深圳市惠安生物科技有限公司