專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種檢測(cè)ⅱ型登革病毒ns1抗原的免疫診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種醫(yī)用配制品，具體涉及一種檢測(cè)登革病毒的試劑盒。技術(shù)背景近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，由于旅游和貿(mào)易的顯著增長(zhǎng)、生態(tài)環(huán)境的改變、全球人口增長(zhǎng)并向城市集中化以及全球氣候變暖等因素，一些蚊媒傳染病，特別是由登革病毒引起的登革熱和登革出血熱，其發(fā)病率在逐年上升，WHO統(tǒng)計(jì)每年發(fā)生登革病毒感染患者超過(guò)1億人，50萬(wàn)人發(fā)展成為登革出血熱，每年死亡人數(shù)超過(guò)25000人。目前，全球有25—30億的人口生活在登革熱疫區(qū)，將受到登革病毒感染的威脅。我國(guó)廣東、海南、廣西、云南和福建等省區(qū)隨時(shí)可能發(fā)生地方性或輸入性的爆發(fā)流行。因此，登革熱已經(jīng)成為了熱帶、亞熱帶地區(qū)的一個(gè)非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。登革病毒有4個(gè)血清型I型、II型、III型和IV型(簡(jiǎn)稱(chēng)DV1、DV2、DV3禾QDV4)，任何一種血清型的感染均可引起一系列的臨床癥狀，包括隱匿性感染、典型登革熱以及危脅生命的登革出血熱或登革休克綜合征。初次感染登革病毒對(duì)于同型病毒的再次感染可產(chǎn)生長(zhǎng)久的免疫力，但4個(gè)血清型的登革病毒之間缺乏交叉免疫保護(hù)作用，因而生活在疫區(qū)的每一個(gè)人一生中都有可能面臨4型登革病毒感染的危脅。流行病學(xué)調(diào)査結(jié)果顯示第二次感染異型登革病毒是導(dǎo)致登革熱患者發(fā)生登革出血熱的首要危險(xiǎn)因素，由于在一個(gè)地區(qū)存在不同血清型登革病毒的交替流行，人群普遍易感，這就更增加了登革出血熱發(fā)生的可能性。然而，人類(lèi)對(duì)登革熱的防治仍面臨著許多難題，沒(méi)有特異性的治療藥物，沒(méi)有安全有效的疫苗，但及時(shí)采取臨床救治措施可以大大減少登革出血熱的發(fā)病率和死亡率，因此登革熱的治療很大程度上取決于早期感染的診斷?？墒嵌鄶?shù)登革病毒感染者早期缺乏特異的臨床表現(xiàn)，僅有發(fā)熱、寒戰(zhàn)等流感樣癥狀，難以和其它發(fā)熱疾病和出血熱疾病區(qū)分，必須依賴實(shí)驗(yàn)室的診斷加以確認(rèn)。目前登革熱的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括病毒分離、抗體檢測(cè)和核酸檢測(cè)。病毒分離是登革病毒感染實(shí)驗(yàn)室診斷和血清型鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法費(fèi)時(shí)而且對(duì)于實(shí)驗(yàn)室的條件要求較高。盡管病毒核酸的檢測(cè)方法比傳統(tǒng)的病毒分離法更靈敏快速，但分子診斷操作相對(duì)繁瑣，對(duì)技術(shù)水平要求較高，易發(fā)生實(shí)驗(yàn)室污染導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，而且其敏感性取決于探針或引物與基因靶序列同源性，往往因毒株變異、潛在突變等序列改變引起的假陰性結(jié)果?？贵w檢測(cè)試劑不能用于早期診斷，而且由于登革病毒4種血清型之間以及與其它黃病毒如日本腦炎病毒、黃熱病毒、西尼羅腦炎病毒等存在血清學(xué)的交叉反應(yīng)，特別是接種乙型腦炎病毒、黃熱病毒疫苗的人群易發(fā)生抗體假陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果。登革病毒中的非結(jié)構(gòu)蛋白l(nonstructuralprotein1,NS1)是一種相對(duì)保守的糖蛋白，分子量為4550kDa，有膜型和分泌型兩種形式，在感染細(xì)胞中高度表達(dá)，在登革病毒的研究中已經(jīng)將它作為診斷登革熱的靶抗原。由于NS1抗原同時(shí)擁有屬特異性和型特異性決定簇，因此檢測(cè)急性期病人血清中的循環(huán)NSI抗原可用于早期診斷登革病毒感染或者預(yù)警DHF的發(fā)生。目前已報(bào)道的幾種檢測(cè)登革病毒NS1的抗原捕獲ELISA法，如YoungP.R.等人報(bào)道的用兔抗II型登革病毒NSl多克隆抗體作為捕獲抗體來(lái)檢測(cè)II型登革病毒(YoungP.R.,etal.J.Clin.Microbiol.2000;38:1053-1057.)以及用鼠抗I型登革病毒NS1和兔抗I型登革病毒NSI多克隆抗體分別作為捕獲抗體和檢測(cè)抗體來(lái)檢測(cè)I型登革病毒(AkonS.，etal.J.CUn.Microbiol.2002;40:376-381.),但是這種方法都是在多克隆抗體的基礎(chǔ)上建立的，在不同批次的抗血清中存在差異，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部和不同實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果往往不同，難以重復(fù)和實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化；另一種是利用NSI的單克隆抗體來(lái)檢測(cè)登革病毒，如商品化的試劑盒(Pan-EDengueEarlyELISAtestkit,Panbio，Queensland,Australia;PLATEUATMDENGUENSIAG,Bio-Rad，F(xiàn)rance),該試劑盒含有抗IIV型登革病毒NSI的單克隆抗體，通過(guò)ELISA方法來(lái)實(shí)現(xiàn)登革病毒感染的早期診斷，其敏感度、特異性和穩(wěn)定性都有較大的提高。但本發(fā)明人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該試劑盒對(duì)IIV型的登革病毒的敏感度不同，分別為26.4PFU/(UmL、46.8PFU/0.1mL、367.2PFU/0.1mL、5000PFU/0.1mL，而早期感染登革病毒的患者的血液樣本中的病毒含量較低，用該試劑盒檢測(cè)II型、III型和IV型的感染有可能會(huì)出現(xiàn)漏檢。再者，—該試劑盒不能區(qū)分四種血清型的登革病毒，由于不同的血清型的登革病毒感染所引起的臨床癥狀是不同的，臨床醫(yī)師必須盡早確定哪種血清型的登革病毒感染，以便于快速采取有效治療措施，因此，就需要及時(shí)確定感染的登革病毒的類(lèi)型，該試劑盒無(wú)法實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是進(jìn)一步提高檢測(cè)II型登革病毒的敏感度。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是一種檢測(cè)II型登革病毒NS1抗原的免疫診斷試劑盒，該試劑盒包括包被捕獲抗體的微孔反應(yīng)板、樣品處理液、標(biāo)記有標(biāo)記物的檢測(cè)抗體、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、濃縮洗液、顯色液和終止液，其特征在于捕獲抗體是單克隆抗體DV2-M6，檢測(cè)抗體是單克隆抗體DV2-M14。本發(fā)明試劑盒中，所述的單抗DV2-M6和單抗DV2-M14均是免疫球蛋白，能特異性結(jié)合II型登革病毒的分子量為45千道爾頓的非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructuralprotein1,NS1)，其中單抗DV2-M6屬I(mǎi)gGl，由雜交瘤細(xì)胞株DV2-M6分泌；單抗DV2-M14屬I(mǎi)gG2b,由雜交瘤細(xì)胞株DV2-M14分泌。所述的雜交瘤細(xì)胞株DV2-M6和DV2-M14是用重組的NS1蛋白和天然的NS1蛋白交叉免疫小鼠，然后用免疫后的小鼠脾細(xì)胞和商品化的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，最后用HAT篩選得到。所述的雜交瘤細(xì)胞株DV2-M6和DV2-M14己于2007年U月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏號(hào)分別為C200736和C加0737。-本發(fā)明試劑盒中，所述的標(biāo)記物可以是生物素、辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、膠體金、熒光素等，優(yōu)選生物素。當(dāng)本發(fā)明所述的檢測(cè)抗體上結(jié)合的標(biāo)記物為生物素時(shí)，本發(fā)明試劑盒還含有標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶的親和素。所述的親和素能與生物素以1:4的比例結(jié)合，起到放大檢測(cè)信號(hào)的作用，進(jìn)一步提高敏高度。本發(fā)明試劑盒是一種基于雙抗體夾心ELISA方法的檢測(cè)試劑盒，其中所用的捕獲抗體DV2-M6和檢測(cè)抗體DV2-M14是從一組抗II型登革病毒的NS1蛋白的單克隆抗體中篩選出來(lái)的，能特異性結(jié)合n型登革病毒的NSl蛋白，分別結(jié)合不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)出n型登革病毒，而與其它i型、in型和iv型登革病毒以及乙型腦炎病毒、黃熱病毒無(wú)交叉反應(yīng)，且對(duì)ii型登革病毒具有很高的敏感度，檢測(cè)n型登革病毒的Nsi蛋白的靈敏度可高達(dá)3ng/ml，檢測(cè)II型登革病毒的敏感度是Pan-EDengueEarlyELISAtestkit的8倍，大大降低了漏檢的幾率，有利于早期診斷早期治療；此外，本發(fā)明試劑盒能特異地檢測(cè)II型登革病毒，有利及時(shí)判斷登革病毒感染的血清型和登革病毒的流行情況。圖1是單抗DV2-M6和DV2-M14的免疫印跡圖，其中A顯示的是重組DV2NS1蛋白與雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的反應(yīng)，B顯示的是天然DV2病毒中的NS1蛋白與雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的反應(yīng)，條帶1為雜交瘤細(xì)胞株DV2-M6培養(yǎng)上清，條帶2為雜交瘤細(xì)胞株DV2-M14培養(yǎng)上清，條帶3為無(wú)關(guān)單抗雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清。圖2是實(shí)施例1所述的試劑盒檢測(cè)II型登革病毒的NS1蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其中+為檢測(cè)II型登革病毒的NS1蛋白的曲線，+為83八對(duì)照。圖3是實(shí)施例1所述的試劑盒檢測(cè)DV2感染病人血清中的DV2NS1抗原和其他的病毒感染病人血清及正常人血清的結(jié)果，其中A為30例DV2感染病人急性期血清，B為301例DV1感染病人急性期血清和1例DV3感染病人急性期血清，C為50例出血熱病人急性期血清，D為13例乙型腦炎病人急性期血清，E為18例20份鉤端螺旋體感染病人急性期血清，F(xiàn)為49例麻疹病人急性期血清，G為504例正常人血清。具體實(shí)施方式例l1、本發(fā)明試劑盒由以下試劑組成(1)包被單抗DV2-M6的微孔反應(yīng)板；(2)樣品處理液由樣品處理液A和樣品處理液B組成，其中A為1.5M甘氨酸溶液(PH2.8)，B為1.5MTris-Hcl溶液(PH9.7);(3)生物素標(biāo)記的單抗DV2-M14;(4)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素，購(gòu)自Zymed公司；(5)濃縮洗液含有2。/。Tween-20的20xPBS，即1L溶液中含有4.56gNaH2PO4,58.02gNa2HP04.12H20，175.3gNaCl，15磅20min高壓滅菌后，加入20mlTween-20攪勻，使用時(shí)20倍稀釋?zhuān)?6)陽(yáng)性對(duì)照:DV2NS1抗原1:1000稀釋液；(7)陰性對(duì)照含0.1%Tween-20的10mMPH7.4PBS，即1L溶液中含有4.56gNaH2PO4，58.02gNa2HP04.12H20，175.3gNaCl,15磅20min高壓滅菌，20倍稀釋后加入0.1%Tween-20;(8)顯色液由顯色液A和B組成，使用時(shí)取二者等量混勻使用。其中顯色液A、B的組成成分如下:顯色液A:將0.89g擰檬酸和0.16gEDTA二鈉溶于1000ml水中，115。C高壓30min，降至卯。C后加TMB0.25g，搖勻于4"C閉光保存；顯色液B:將9.33g檸檬酸和14.6gEDTA二鈉溶于1000ml水中，115。C高壓30min后，降至90°C后加0.75%過(guò)氧化氫尿素12.8ml，搖勻于4"閉光保存；(9)終止液1MH2S04。上述試劑中，A、所述的單抗DV2-M6和CCTCC-C200737的制備方法和鑒定結(jié)果a.免疫抗原的制備本發(fā)明用于制備單克隆抗體的免疫原為基因重組DV2NS1蛋白和已滅活天然的病毒抗原?；蛑亟MDV2NS1蛋白是用攜帶DV2NS1蛋白基因的工程菌株為一種大腸桿菌菌株進(jìn)行制備的，其制備按常規(guī)方法進(jìn)行，經(jīng)用鎳一次氮基三醋酸金屬親和層析的方法進(jìn)行純化獲得NS1抗原，詳細(xì)的制備方法可參照使用手冊(cè)。將NS1蛋白純化后，以考馬斯亮藍(lán)(Coomassie)蛋白分析試劑(P正RCE，Cat,No.ED62976)定量。Westernblot對(duì)純化的重組蛋白鑒定結(jié)果顯示，DV2免疫兔血清和小鼠抗hisMAb均在分子量約45KDa處出現(xiàn)特異性的反應(yīng)條帶，與預(yù)測(cè)的DV2NS1分子量大小一致。已滅活天然的病毒抗原，是從DV2感染的病毒宿主細(xì)胞(C6/36,—種白蚊伊蚊細(xì)胞)獲得。b.免疫小鼠取4-6周齡雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐劑與等體積DV2NS1抗原混勻乳化，每只小鼠皮下多點(diǎn)注射30pg，以后每10天以弗氏不完全佐劑與天然的DV2抗原或重組的DV2NS1抗原交替免疫共4次后，于融合前3天每只小鼠腹腔注射DV2NSl抗原100ng進(jìn)行加強(qiáng)免疫。c.免疫血清抗體效價(jià)測(cè)定建立間接ELISA法測(cè)定免疫血清抗體效價(jià)。配制lpg/ml重組NS1蛋白的50mMpH9.6碳酸鹽緩沖液，包被聚苯乙烯微％孔板，10(V1/孔,4。C過(guò)夜。次日，用含0.25%酪蛋白(Sigma)的封閉液4'C過(guò)夜，棄液并拍千后真空干燥212小時(shí)，用鋁膜袋真空包裝4'C保存，用于鼠免疫血清抗體效價(jià)測(cè)定。于第四次免疫后IO天眼眶采血，鼠免疫血清用含0.1%BSA10mMPBS以103106倍稀釋?zhuān)尤?6孔板，100pl/孔37°C30分鐘，10mMPBS含0.1%Tween-20洗滌液洗板五次后，加入1:1000倍稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG(Sigma，INC.)，l(%d/孔37°C30分鈄'，同上洗板后，加入TMB顯色液，100^1/孔，室溫避光顯色10分鐘，力口100^1/孔1MH2S02終止反應(yīng)，測(cè)450nm吸光值，以免疫前小鼠血清作為陰性對(duì)照，以測(cè)定值與對(duì)照值之比^.1為陽(yáng)性來(lái)判斷免疫血清的抗體效價(jià)。d.雜交瘤制備和篩選選擇血清抗體效價(jià)達(dá)lxl(^的小鼠，于融合前3天腹腔注射DV2NS1抗原IOOpg。無(wú)菌取小鼠脾臟，制成脾細(xì)胞懸液與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株NS-1按10:1的比例混合，45%聚乙二醇(PEG,MW4000,Sigma)作用下進(jìn)行融合。按下述步驟將聚乙二醇溶液加入細(xì)胞。在37。C水浴中，在lmin內(nèi)緩慢加入l.OmlPEG，邊加邊輕輕搖勻，分別于lmin、2min、3min、4min、5min內(nèi)加lml、2ml、3ml、4ml、5ml無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合，最后加入10ml含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，室溫800rpm離心5min，棄上清，用60ml含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基輕輕懸起細(xì)胞。將此細(xì)胞懸液加入6塊96孔培養(yǎng)板上，在二氧化碳培養(yǎng)箱中溫度為37'C、5WC02的培養(yǎng)箱中。次日于每孔加入100W含次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脫氧核苷(HAT，Sigma)篩選培養(yǎng)基。以后每3天用此篩選培養(yǎng)基給培養(yǎng)物換液一次，直到細(xì)胞克隆形成。'為檢測(cè)產(chǎn)生抗體克隆的存在，用上述間接ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清。選擇強(qiáng)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行了克隆化，用有限稀釋法連續(xù)克隆化23次，共獲得一組穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其中包含本發(fā)明所述的DV2-M6和DV2-Ml4。將克隆化后陽(yáng)性率達(dá)100%的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)后液氮凍存。e.抗DV2NSl蛋白單克隆抗體亞類(lèi)檢測(cè)用上述的間接ELISA法檢測(cè)在本實(shí)施例中獲得的陽(yáng)性克隆以確定其產(chǎn)生的抗體亞類(lèi)。即DV2NS1抗原包被微孔板，封閉后與雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育，再分別與為l:1000倍稀釋HRP標(biāo)記的兔抗小鼠不同亞類(lèi)特異性免疫球蛋白，這些抗體包括兔抗小鼠IgGl(美國(guó)ZYMEDLABORATOR正S，INC，目錄號(hào)61-0120),兔抗小鼠IgG2a(同上，目錄號(hào)61-0220),兔抗小鼠lgG2b(同上，目錄號(hào)61-0320)，兔抗小鼠IgG3(同上，目錄號(hào)61-0420),兔抗小鼠IgM(同上，目錄號(hào)61-6820)。檢測(cè)結(jié)果顯示，雜交瘤細(xì)胞株DV2-M6為IgGI陽(yáng)性，雜交瘤細(xì)胞株DV2-M14為IgG2b陽(yáng)性。f.抗DV2NS1蛋白單克隆抗體腹水的制備和抗體純化采用體內(nèi)誘生法制備本發(fā)明中單克隆抗體，即在小鼠體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞制備腹水。簡(jiǎn)述如下每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml弗氏不完全佐劑(Sigma公司)，使瘤細(xì)胞能以腹水瘤形式在腹腔內(nèi)生長(zhǎng)。大約12周后，將2"06個(gè)雜交瘤細(xì)胞懸浮于無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基中，注入小鼠腹腔。注射雜交瘤細(xì)胞大約！2周后，用9號(hào)針頭放腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水經(jīng)離心澄清后4'C存放備用。腹水抗體的純化采用辛酸一硫酸銨沉淀法，腹水用60tnM、pH5.0醋酸緩沖液稀釋2倍，用0.1N鹽酸調(diào)pH值至4.8，液體由清亮變混濁，室溫下于30分鐘內(nèi)邊攪拌邊逐滴緩慢加入辛酸，為每毫升稀釋前腹水加33^1辛酸，出現(xiàn)大量沉淀，4'C靜置2小時(shí)，10000g，4'C離心30分鐘，取上清，加入1/10體積的pH7.4100mM磷酸鹽緩沖液，并用0.1N氫氧化鈉調(diào)pH值至7.4,冰浴攪拌下緩慢加入硫酸銨，為每毫升液體加入0.277硫酸銨即為45%飽和度，4'C靜置過(guò)夜，10000g，4'C離心30分鐘，棄上清，沉淀溶于適量lOmM磷酸鹽緩沖液，用同樣的液體，4'C透析過(guò)夜，換液三次。以考馬斯亮藍(lán)(Coomassie)蛋白分析試劑(P正RCE,Cat,No.ED62976)定量。測(cè)定濃度后的抗體加入終濃度50。/。的甘油于-8(TC保存。g.鑒定DV2NSl蛋白單克隆抗體的特異性(l)間接ELISA法進(jìn)行單克隆抗體特異性分析分別用四個(gè)血清型重組DVNS1抗原和天然的DV抗原包被微孔板，按照常規(guī)的間接ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。即在包被的微孔板中加入本專(zhuān)利發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，37'C孵育lh，加入l:lOOO稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG(Sigma，Inc),10(Hil/孔37t孵育30min，加TMB顯色液室溫避光顯色10min，加1M仏802終止反應(yīng)，測(cè)450nm吸光值"450)。表1結(jié)果顯示本專(zhuān)利發(fā)明的單克隆抗體與重組的DV2NS1抗原和天然的DV2抗原均產(chǎn)生很強(qiáng)的特異性的免疫反應(yīng)，與另外三個(gè)血清型的重組DVNS1抗原和天然的DV抗原無(wú)交叉反應(yīng)。表1DV2NS1單克隆抗體與重組的DV2NS1抗原和夭然的DV2抗原反應(yīng)間接EUSA結(jié)果DV2NS1單克隆抗體無(wú)關(guān)抗體DV2掘DV2-M14重組的DV1NS1抗原檢測(cè)A4500.0620.0880.074重組的DV2NS1抗原檢測(cè)A4502.2852.1910.087重組的DV3NS1抗原檢測(cè)A4500.0690.1120扁重組的DV4NS1抗原檢測(cè)A4500.0610.0670.065天然的DV1抗原檢測(cè)A4500.0610.0790.072天然的DV2抗原檢測(cè)A4501.0090.9140細(xì)天然的DV3抗原檢測(cè)A45o0.0650.0950.059天然的DV4抗原檢測(cè)A45()0.060.1150.073,(2)間接免疫熒光法進(jìn)行單克隆抗體特異性分析分別用DV1、DV2、DV3和DV4感染C6/36細(xì)胞，當(dāng)有2/3細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的lxPBS洗細(xì)胞二遍，然后將細(xì)胞滴于無(wú)菌干燥的玻片上，干燥后，制備成涂片，充分干燥，用冷丙酮固定10分鐘后吹干，將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清按不同的稀釋度分別用lOfil滴在不同的孔中，同時(shí)設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照，置37"C水浴箱中，孵育45分鐘后，取出將抗原片放于染色缸中用10mMpH7.2PBS洗3次，吹干，加入熒光標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體，置37t水浴箱中，孵育45分鐘后，取出將抗原片洗滌4次，吹干，熒光顯微鏡下觀察熒光圖像，以熒光的強(qiáng)度和染色形態(tài)進(jìn)行結(jié)果判定，檢測(cè)抗體強(qiáng)度以(+++++)計(jì)為陽(yáng)性，抗體強(qiáng)度(±)和(一)計(jì)為陰性。如表2結(jié)果顯色DV2NS1單克隆抗體與固定在玻片上DV2抗原特異性結(jié)合，與另外三個(gè)血清型DV無(wú)交叉反應(yīng)。表2DV2NS1單克隆抗體的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果DV感染C6/36細(xì)胞涂片正常C6/36細(xì)胞涂片DV1DV2DV3DV4CCTCC-C200736-++++---CCTCC-C200737-+++---—(3)免疫印跡分析法進(jìn)行單克隆抗體特異性分析將滅活DV2培養(yǎng)液或重組的DV2NS1蛋白，用2xSDS加樣緩沖液稀釋一倍，將樣品加到10。/。SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，電泳分離蛋白質(zhì)，通過(guò)電洗脫使在凝膠上分離出來(lái)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，轉(zhuǎn)印膜用含7%脫脂奶和3%BSA的10mMPBS于4'C封閉6小時(shí)，將轉(zhuǎn)印膜裝在專(zhuān)門(mén)的反應(yīng)板中，分別加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中，4"反應(yīng)過(guò)夜，用含有0.5%Tween20的10mMPBS洗滌膜后，加入1:500倍稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，室溫反應(yīng)1小時(shí)，用同樣的洗滌液洗滌膜后，DAB顯色后，用去離子水終止顯色。免疫印跡結(jié)果如圖1所示，本發(fā)明的2株單克隆抗體與重組DV2NS1蛋白特異性結(jié)合，結(jié)合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為45千道爾頓。滅活DV2培養(yǎng)液在分子量為45千道爾頓同樣可見(jiàn)一條很強(qiáng)的蛋白質(zhì)免疫結(jié)合帶，特異性蛋白質(zhì)結(jié)合帶與預(yù)測(cè)分子量為45千道爾頓相一致。說(shuō)明獲得的單克隆抗體能夠特異性識(shí)別重組的和天然的DV2NS1抗原。h.單克隆抗體識(shí)別位點(diǎn)分析重組DV2NS1蛋白以5pg/ml加入50mMpH9.6碳酸鹽緩沖液，(Um〗/孔包被聚苯乙烯微96孔板，4'C過(guò)夜。次日，加入含0.25%酪蛋白(Sigma)的封閉液0.3ml/孔4'C過(guò)夜后，先加0.15mg/ml單抗50nl/孔，再加1:500稀釋的生物素標(biāo)記單抗室溫孵育1小時(shí)，0.5%'Tween20的PBS洗滌五次后加入1:1000稀釋的HRP標(biāo)記親和素100^1/孔，室溫孵育30分鐘，洗滌后加入TMB顯色液室溫顯色10分鐘，測(cè)450吸光值。以單抗對(duì)同一生物素標(biāo)記的單抗抑制為100%，以已知無(wú)關(guān)單抗對(duì)標(biāo)記單抗的抑制為陰性對(duì)照，計(jì)算各單抗間的抑制率。即抑制率為(l-測(cè)定值/陰性對(duì)照值)x100。抑制率>75%為相關(guān)，>50%為不完全相關(guān)，<50%為不相關(guān)，<25%為完全不相關(guān)。表3結(jié)果顯示2株單抗識(shí)別2個(gè)不完全相同的抗原位點(diǎn)。表3抗DV2NS1單克隆抗體識(shí)別抗原位點(diǎn)測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>B、所述包被單抗DV2-M6的微孔反應(yīng)板的制備方法將本發(fā)明單抗DV2-M6用10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.6)稀釋至10pg/ml，用150^d/孔包被聚苯乙烯96孔微孔板，于4。C過(guò)夜。拍干后，每孔加入30^1/孔的0.25%酪蛋白(Sigma)的封閉液，于4'C過(guò)夜以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。甩干板條，真空干燥1224h，用鋁膜袋真空包裝4。C保存?zhèn)溆谩、所述生物素標(biāo)記的單抗DV2-M14的制備方法將2.2mg生物素溶解于0.5ml蒸餾水中，取其加入到lml單抗DV2-M14(濃度為2mg/ml)中，4。C靜置2h后裝入透析袋中，于PBS中4。C透析過(guò)夜，換液三次。收集結(jié)合物加入終濃度50%甘油保護(hù)劑，最后用磷酸鹽緩沖液稀釋500倍，即為工作液。2、使用方法'取待測(cè)的樣品33^il,加入樣品處理液A33pl，混勻后置37tMh，再加樣品處理液B33^混勻，加入CCTCC-C200736包被的聚苯乙烯96孔微量測(cè)試板中，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，37。C溫育lh，濃縮洗滌液20倍稀釋后洗滌板條，洗板五次后，加入1:500稀釋的生物素標(biāo)記的單抗DV2-M14，10(Hd/孔，室溫30min，同上洗板五次后，加入1:1000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素，100jal/孔，室溫30min,同上洗板八次后加顯色液(顯色液A和B等量混合，現(xiàn)用現(xiàn)配)，100^孔，室溫避光10min后，加入終止液，100til/孔，終止反應(yīng)。3、結(jié)果判定以空白孔調(diào)零，于450nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度"值)。陽(yáng)性對(duì)照平均值^).50，陰性對(duì)照平均值50.10，實(shí)驗(yàn)成立。樣品4值2陰性對(duì)照X值平均值x2.1，則判為陽(yáng)性，反之為陰性。4、本發(fā)明試劑盒檢測(cè)DV2NS1的最高靈敏度的確定將重組DV2-NS1從100ng/mL開(kāi)始倍比稀釋若干梯度，用上述建立的方法檢測(cè)DV2NS1，同時(shí)稀釋相同濃度的BSA作為陰性對(duì)照。以BSA的檢測(cè)值作為標(biāo)準(zhǔn)，以檢測(cè)值大于或等于相同BSA濃度檢測(cè)值的2.1倍的DV2NS1的最低濃度作為本方法檢測(cè)該抗原的靈敏度。結(jié)果如圖2和表4所示，當(dāng)重組DV2-NS1稀釋至3.12ng/ml時(shí)，j45t)=0.175，是相應(yīng)濃度的BSA對(duì)照U45Q=0.05)的3.5倍，當(dāng)重組DV2-NS1稀釋至1.56ng/ml時(shí)，4450=0.116，是相應(yīng)濃度的BSA對(duì)照(Atso-0.05)的2.3倍，因此根據(jù)上述判斷標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明試劑盒檢測(cè)DV2-NS1的最低濃度為L(zhǎng)56ng/ml，保守地說(shuō)，靈敏度也可高達(dá)3ng/ml。表4本發(fā)明試劑盒檢測(cè)不同濃度重組DV2-NS1的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>5、本發(fā)明試劑盒檢測(cè)相關(guān)病毒的特異性和靈敏度分析通過(guò)對(duì)DV1、DV2、DV3、DV4進(jìn)行空斑實(shí)驗(yàn)確定病毒滴度分別為2.7xl05PFU/mL、2.4xl05PFU/mL、4.7x105PFU/mL、1.6><106PFU/mL。采用上述建立的方法檢測(cè)滅活的DV、DV2、DV3、DV4，從1:2開(kāi)始倍比稀釋多個(gè)梯度進(jìn)行檢測(cè)，即四種病毒檢測(cè)的起始滴度分別為DV1為1.35xl04PFU/0.1ml，DV2為1.2x104PFU/0.1ml，DV3為2.35"04PFU/0.1ml，DV4為8xl05PFU/0.1ml。同時(shí)以檢測(cè)四個(gè)血清型DVNS1抗原的商品化試劑盒"pan-EDENGUEEARLYELISA"(Panbio,Australia)進(jìn)行同步檢測(cè)比較，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)DV2培養(yǎng)上清的檢測(cè)靈敏度高達(dá)5.8PFU/0.1ml(即稀釋4096倍時(shí)的病毒滴度)，而對(duì)其他病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，如表5所示。商品化的pan-EDENGUEEARLYELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)四個(gè)血清型的DV培養(yǎng)上清的檢測(cè)敏感性不同，詳見(jiàn)表6結(jié)果。商品化試劑盒對(duì)DV2培養(yǎng)上清的檢測(cè)靈敏度為46.8PFU/0.1ml(1:512稀釋時(shí)的病毒滴度)，明顯低于本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)DV2培養(yǎng)上清的靈敏度。表5本發(fā)明試劑盒檢測(cè)四個(gè)血清型DV培養(yǎng)上清結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表注a:此試劑盒的結(jié)果判定如下樣品檢測(cè)值》陰性對(duì)照平均值的2.1倍(計(jì)算為0.072X2.1=0.151)為陽(yáng)性，反之為陰性。表6進(jìn)口試劑盒pan-EDENGUEEARLYELISA檢測(cè)四個(gè)血清型DV培養(yǎng)上清結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表注此試劑盒的結(jié)果判定如下顯示值<9.0為陰性，顯示值9.0-11.0為可疑陽(yáng)性，顯示值>11.0為沐|性。6、本發(fā)明試劑盒的可重復(fù)性分析通過(guò)將DV2培養(yǎng)上清按1:100，1:200，1:400和1:800四個(gè)稀釋度加至正常人血清中對(duì)本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，對(duì)以上四份樣品同時(shí)檢測(cè)10次的批內(nèi)測(cè)定變異系數(shù)分別為3%，2.8%，2.7%禾1]2.9%，對(duì)四份樣品進(jìn)行10次檢測(cè)的批間測(cè)定變異系數(shù)分別為4.9%，5.6%,5.1%禾口4.3%。7、臨床試驗(yàn)首先將臨床血清標(biāo)本用1.5M甘氨酸(PH2.8)進(jìn)行預(yù)處理使NS1與血清中的抗體形成的復(fù)合物解離，從而釋放游離的NS1抗原，再用1.5MTris-Hcl(PH9.7)中和后用上述建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。(1)本發(fā)明試劑盒檢測(cè)正常人血清本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)了504例正常人血清，用此檢測(cè)結(jié)果確定本方法的臨界值。對(duì)檢測(cè)值進(jìn)行分析，計(jì)算得平均值為0.087，標(biāo)準(zhǔn)差為0.02，以平均值加上5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差作為本方法的檢測(cè)臨界值即0.087+0.02x5=0.187，以大于或等于臨界值作為判斷檢測(cè)值陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，504例正常人血清均為陰性，可確定本方法的特異度為100%。(2)本發(fā)明試劑盒檢測(cè)DV2感染病人急性期血清'本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)了30例的DV2感染患者急性期血清，這些血清均經(jīng)病毒分離或RT-PCR確定為DV2陽(yáng)性，同時(shí)與"pan-EDENGUEEARLYELISA"進(jìn)行比較。本發(fā)明建立的雙抗夾心ELISA檢測(cè)這30例血清，陽(yáng)性的有25例，其中^45()值〉1.0的有19例，陽(yáng)性率達(dá)83.3%(25/30)，見(jiàn)圖3所示。商品化試劑盒"pan-EDENGUEEARLYELISA"檢測(cè)結(jié)果與我們的方法檢測(cè)結(jié)果完全一致。(3)本發(fā)明試劑盒檢測(cè)相關(guān)病毒感染病人急性期血清本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)了301例DV1感染患者急性期血清，這些血清同樣經(jīng)病毒分離或RT-PCR確定為DV1陽(yáng)性，而且用我們前期工作中建立的檢測(cè)DV1NS1抗原的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性；還檢測(cè)了1例DV3感染患者急性期血清；檢測(cè)了50例出血熱、13例乙型腦炎、49例麻疹和18例20份鉤端螺旋體感染患者急性期血清，這些血清樣品均經(jīng)血清凝集試驗(yàn)確診。本發(fā)明試劑盒對(duì)以上血清的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，如圖3所示，說(shuō)明本發(fā)明的試劑盒特異性強(qiáng)。例21、本發(fā)明試劑盒由以下試劑組成(1)包被單抗DV2-M6的微孔反應(yīng)板；(2)由樣品處理液A和樣品處理液B組成，其中A為1.5M甘氨酸溶液(PH2.8)，B為1.5MTris-Hcl溶液(PH9.7);(3)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單抗DV2-M14;(4)濃縮洗液含有2Q/。Tween-20的20xPBS，即1L溶液中含有4.56gNaH2P04，58.02gNa2HP04.12H20，175.3gNaCl，15磅20min高壓滅菌后,加入20mlTween-20攪勻，使用時(shí)20倍稀釋?zhuān)?5)陽(yáng)性對(duì)照DV2NS1抗原1:1000稀釋液；(6)陰性對(duì)照含0.1%Tween-20的10mMPH7.4PBS，即1L溶液中含有4.56gNaH2P04，58.02gNa2HPO4.12H2O，175.3gNaCl，15磅20min高壓滅菌，20倍稀釋后加入0.1%Tween-20;(7)顯色液由顯色液A和B組成，使用時(shí)取二者等量混勻使用。其中顯色液A、B的組成成分如下顯色液A:將0.89g檸檬酸和0.16gEDTA二鈉溶于1000ml水中，115°C30min后，降至90。C后加TMB0.25g，搖勻于4'C閉光保存；顯色液B:將9.33g檸檬酸和14.6gEDTA二鈉溶于1000ml水中，115°C30min后，降至90。C后加0.75%過(guò)氧化氫尿素12.8ml，搖勻于4。C閉光保存；(8)終止液1MH2S04。上述試劑中，單抗DV2-M6和CCTCC-C200737的制備方法、包被單抗DV2-M6的微孔反應(yīng)板的制備方法同例l;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單抗DV2-M14的制備方法為采用改良過(guò)碘酸鈉法，將5mg辣根過(guò)氧化物酶攪拌溶解于lml蒸餾水中，加入0.2ml新配0.1M過(guò)碘酸鈉避光攪拌30min，置lmMpH4.4醋酸鈉緩沖液中，4。C透析過(guò)夜，次日加入20pl0.2MpH9.5碳酸鹽緩沖液后加預(yù)先在0.01M碳酸鹽緩沖液中pH9.5透析平衡的10mg抗體，在室溫避光輕輕攪拌23h，加入0.1ml新配4mg4nl硼氫化鈉，4'C避光過(guò)夜，冰浴上避光攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨(硫酸銨用前先用氨水調(diào)pH至7.0-7.2)，置4。C6h。10000g，4"C離心30min，棄上清，沉淀溶于適量10mM磷酸鹽緩沖液，用同樣的液體，4"C透析過(guò)夜，換液三次。收集結(jié)合物加入2n/。BSAPBS50M甘油保護(hù)劑，最后用磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍使用。2、使用方法樣品處理液處理各種待測(cè)的樣品后，力卩15(^1于單抗CCTCC-C200736包被的聚苯乙烯96孔微量測(cè)試板中，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，37"C溫育lh，濃縮洗滌液20倍稀釋后洗滌板條，洗板四次后，加入酶結(jié)合物(HRP標(biāo)記的單抗CCTCC-C200737),150nl/孔，37°C30min，同上洗板八次后，加顯色液(顯色液A和B等量混合，現(xiàn)用現(xiàn)配)，15(^1/孔，室溫避光10min后，加入終止液，100ixl/孔，終止反應(yīng)。3、結(jié)果判定以空白孔調(diào)零，于450nm波長(zhǎng)測(cè)定Z值。陽(yáng)性對(duì)照平均值20.50，陰性對(duì)照平均值50.10，實(shí)驗(yàn)成立。樣品^值^陰性對(duì)照^值平均值x2.1，則判為陽(yáng)性。反之為陰性。例31、本發(fā)明試劑盒由以下試劑組成(1)包被單抗DV2-M6的微孔反應(yīng)板；(2)樣品處理液由樣品處理液A和樣品處理液B組成，其中A為1.5M甘氨酸溶液(PH2.8)，B為1.5MTris-Hcl溶液(PH9.7);(3)堿性磷酸酶標(biāo)記的單抗DV2-M14;(4)濃縮洗液含有2n/。Tween-20的20xPBS，即1L溶液中含有4.56gNaH2P04，58.02gNa2HP04.12H20，175.3gNaCl，15磅20min高壓滅菌后，加入20mlTween-20攪勻，使用時(shí)20倍稀釋?zhuān)?5)陽(yáng)性對(duì)照DV2NS1抗原1:1000稀釋液；(6)陰性對(duì)照含0.1%Tween-20的1OmMPH7.4PBS，艮卩1L溶液中含有4.56gNaH2P04，58.02gNa2HPO4.12H2O，175.3gNaCl，15磅20min高壓滅菌，20倍稀釋后加入0.1%Tween-20;(7)顯色液為PNPP(購(gòu)于PIERCE公司)，以10mgPNPP溶于10mM二乙醇胺溶液中；(8)終止液2MNaOH溶液。上述試劑中，單抗DV2-M6和CCTCC-C200737的制備方法、包被單抗DV2-M6的微孔反應(yīng)板的制備方法同例l;堿性磷酸酶標(biāo)記的單抗DV2-M14的制備方法為采用戊二醛法，即取堿性磷酸酶5mg溶于lml抗體(2mg/ml)溶液中，在lOmMPBS(PH7.2)透析24h，期間更換透析液3次，加入2.5。/。的戊二醛20pl，室溫靜置2h，在10mMPBS(PH7.2)透析12h，期間更換透析液3次，在50mMTris-HCl溶液(PH8.0)中透析12h，期間更換透析液3次，用含1%BSA的Tris-HCl溶液(PH8.0,含0.02%NaN3)稀釋至4ml，加入等量60°/。中性甘油溶液，混勻后分裝，-80"凍存?zhèn)溆谩?、使用方法樣品處理液處理各種待測(cè)的樣品后，力tl15(Hd于CCTCC-C200736包被的聚苯乙烯96孔微量測(cè)試板中，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，37'C溫育lh，濃縮洗滌液20倍稀釋后洗滌板條，洗板四次后，加入酶結(jié)合物，'15(HU/孔，37'C30min，同上洗板八次后，加顯色液PNPP，150^1/孔，室溫避光30min后，加入終止液，10(^U/孔，終止反應(yīng)。3、結(jié)果判定以空白孔調(diào)零，于405nm波長(zhǎng)測(cè)定^值。陽(yáng)性對(duì)照平均值^).50，陰性對(duì)照平均值SO.IO,實(shí)驗(yàn)成立。樣品^值^月性對(duì)照J(rèn)值平均值x2丄則判為陽(yáng)性。反之為陰性。權(quán)利要求1、一種檢測(cè)II型登革病毒NS1抗原的免疫診斷試劑盒，該試劑盒包括包被捕獲抗體的微孔反應(yīng)板、樣品處理液、標(biāo)記有標(biāo)記物的檢測(cè)抗體、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、濃縮洗液、顯色液和終止液，其特征在于所述的捕獲抗體是單克隆抗體DV2-M6，所述的檢測(cè)抗體是單克隆抗體DV2-M14；其中的單克隆抗體DV2-M6由保藏號(hào)為CCTCC-C200736的雜交瘤細(xì)胞株分泌得到，單克隆抗體DV2-M14由保藏號(hào)為CCTCC-C200737的雜交瘤細(xì)胞株分泌得到。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的標(biāo)記物是生物素、辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于當(dāng)本發(fā)明所述的檢測(cè)抗體上結(jié)合的標(biāo)記物為生物素時(shí)，該試劑盒還含有標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶的親和素。全文摘要本發(fā)明提供了一種檢測(cè)II型登革病毒抗原的免疫診斷試劑盒，該試劑盒包括包被單抗DV2-M6的微孔反應(yīng)板、樣品處理液、標(biāo)記有標(biāo)記物的單抗DV2-M14、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、濃縮洗液、顯色液和終止液。該試劑盒中所用的單抗DV2-M6和單抗DV2-M14都能特異性結(jié)合II型登革病毒的NS1蛋白，與其他3種血清型登革病毒NS1無(wú)交叉反應(yīng)，并且分別結(jié)合NS1不同抗原位點(diǎn)，檢測(cè)II型登革病毒的NS1蛋白的靈敏度可高達(dá)3ng/ml，檢測(cè)II型登革病毒感染細(xì)胞的培養(yǎng)上清的敏感度是試劑盒Pan-EDengueEarlyELISAtestkit的8倍，大大提高了臨床血清樣本檢測(cè)的靈敏度。文檔編號(hào)G01N33/577GK101226196SQ200810026250公開(kāi)日2008年7月23日申請(qǐng)日期2008年2月2日優(yōu)先權(quán)日2008年2月2日發(fā)明者丘立文,車(chē)小燕申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)