氨(離子)診斷/測定試劑盒及氨(離子)的濃度測定方法

文檔序號：5920208閱讀：213來源：國知局

專利名稱：氨(離子)診斷/測定試劑盒及氨(離子)的濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種氨(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定氨(離子)濃度的方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。
背景技術：
氨測定的方法有微量擴散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應用最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測定儀分析法。
擴散法是標本堿化后，釋放出NH3，用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler 反應形成棕黃色碘化雙汞胺進行比色。這些方法需要堿化，內(nèi)源性的氨形成造成影響，使其準確性和精密度受到影響，目前已很少應用；離子交換法比擴散法更準確，CV為8X 13X;離子選擇電極法是利用NH3擴散到電極表面，引起電極的PH發(fā)生變化進行測定，該方法的CV為3.5X 4.8X，回收率高。結合具體實際，應以酶法測定為實用。
檢索中國專利，僅查出87105593.7專利申請公開了一種血氨測定速凍杯，卻未發(fā)現(xiàn)比較理想的血氨測定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定氨(離子) 濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的氨(離子)診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行氨(離子)濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。本發(fā)明氨(離子)濃度測定方法原理如下
氨離子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+
腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶二氧化碳+
磷酸烯醇式丙酮酸+水二氧化碳+還原型輔酶甲酸脫氫酶甲酸+輔酶
這種方法應用谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3丄2)酶(偶)聯(lián) 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase; EC 4.1.1.31)、甲酸脫氫酶(Formate dehydrogenase; EC 1.2.1.2; EC 1.2.1.43)酶促反應終點比色法。谷氨酰胺合成酶酶解氨(離子)反應產(chǎn)生磷酸根，再通過(偶)聯(lián)合磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度，通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算氨(離子)的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明氨(離子)診斷/測定試劑盒較為理想
緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
谷氨酰胺合成酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
甲酸脫氫酶
100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L 10000U/L 10 mmol/L腺苷三磷酸 3 mmol/L
草酰乙酸 5mmol/L 本發(fā)明的氨(離子)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。、
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸
脫氫酶。
還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶。試劑3
.緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶。還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定氨(離子)濃度的方法，其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。實施例一
本實施例的氨(離子)診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25mmol/L
谷氨酰胺合成酶 6000 U/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 8000 U/L
甲酸脫氫酶 10000 U/L
谷氨酸 10 mmol/L
腺苷三磷酸 3 mmol/L
草酰乙酸 5mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間IO分鐘，起始吸光度1.8 ±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨(離子)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間O分鐘，檢測時間 5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，
檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小。實施例二
本實施例的氨(離子)診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
10 mmol/L
腺苷三磷酸 3 mmol/L
草酰乙酸 5mmol/L 試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑
谷氨酰胺合成酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶甲酸脫氫酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37。C,反應時間10分鐘，起始吸光度1.8
±0.7，測試主波長340nm,測試副波長405nm，被測氨(離子)樣品與試劑l、
試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間0分鐘，
檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，
檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小。
100 mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L 畫OO U/L實施例三
本實施例的氨(離子)診斷/測定試劑為三試劑，包括試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶谷氨酸腺苷三磷酸草酰乙酸試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶甲酸脫氫酶試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑
谷氨酰胺合成酶試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體」測定氨(離子)濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時
間10分鐘，起始吸光度1.8士0.7,測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨(離子)樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間O分鐘，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，
10Ommol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 3 mmol/L 5 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L 8000 U/L 10000 U/L
100mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L
:試劑，可以直接使用。檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0012;吸光度時間反應曲線應呈下降曲線直至終點；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達2 mmol/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過土 6%;試劑測試的精密度 (重復性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達0.65 ± 0.2AA/mmol /L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣應用。
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權利要求
1. 一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的氨(離子)濃度測定方法，其方法原理如下氨離子+谷氨酸+腺苷三磷酸 谷氨酰胺合成酶 谷氨酰胺+ 腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+草酰乙酸 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 二氧化碳+ 磷酸烯醇式丙酮酸+水二氧化碳+還原型輔酶 甲酸脫氫酶 甲酸+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出氨(離子)的濃度大小測定結果。
2. —種氨(離子)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20——500 mmol/L穩(wěn)定劑1——4000 mmol/L還原型輔酶0.1—0.35 mmol/L谷氨酰胺合成酶1000———80000 U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶1000-——80000 U/L甲酸脫氫酶1000-——80000 U/L谷氨酸1—50 mmol/L腺苷三磷酸1—50 mmol/L草酰乙酸1_50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶組成。還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶組成。還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol) 及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的氨(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定氨(離子)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464352SQ20071019214
公開日2009年6月24日申請日期2007年12月19日優(yōu)先權日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司

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