一種同時檢測病毒抗原和抗體的膠體金免疫層析試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種同時檢測病毒抗原和抗體的膠體金免疫層析試紙條。所述試紙條包括并列設(shè)置的第一膠條和第二膠條；所述第一膠條包括順次搭接的第一樣品墊、第一結(jié)合物墊、第一硝酸纖維素膜和第一吸水紙，其中所述第一結(jié)合物墊上涂覆有病毒抗體標(biāo)記的膠體金，所述第一硝酸纖維素膜上包被有病毒抗體作為第一檢測線并包被有抗膠體金上病毒抗體的抗體作為質(zhì)控線；所述第二膠條包括順次搭接的第二樣品墊、第二結(jié)合物墊、第二硝酸纖維素膜和第二吸水紙，其中所述第二結(jié)合物墊上涂覆有病毒抗原標(biāo)記的膠體金，所述第二硝酸纖維素膜上包被有抗人IgG抗體作為第二檢測線并包被有抗人IgM抗體作為第三檢測線；能同時檢測病毒抗原及其IgM和IgG抗體。
【專利說明】一種同時檢測病毒抗原和抗體的膠體金免疫層析試紙條【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫檢測分析【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種同時檢測病毒抗原及其特異性免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)的膠體金免疫層析試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]流行性感冒(簡稱流感)是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一種傳染性強(qiáng)、傳播速度快的疾病。其主要通過空氣中的飛沫、人與人之間的接觸或與被污染物品的接觸傳播。典型的臨床癥狀是:急起高熱、全身疼痛、顯著乏力和輕度呼吸道癥狀。一般，秋冬季節(jié)是其高發(fā)期，所 引起的并發(fā)癥和死亡現(xiàn)象非常嚴(yán)重。該病是由流感病毒引起流行性感冒，病毒屬正粘病毒科，直徑80~120nm，球形或絲狀。流感病毒可分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，甲型流感病毒經(jīng)常發(fā)生抗原變異，傳染性大，傳播迅速，極易發(fā)生大范圍流行。甲型HlNl也就是一種甲型流感病毒，本病具有自限性，但在嬰幼兒、老年人和存在心肺基礎(chǔ)疾病的患者容易并發(fā)肺炎等嚴(yán)重并發(fā)癥而導(dǎo)致死亡。正確診斷此病原體對迅速治愈具有十分重要的意義。
[0003]甲型流感病毒依據(jù)流感病毒血凝素蛋白(HA)的不同可分為1-16種亞型，根據(jù)病毒神經(jīng)氨酸酶蛋白(NA)的不同可分為1-9種亞型，HA不同亞型可以與NA的不同亞型相互組合形成不同的流感病毒。
[0004]免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)是人類或者動物體內(nèi)最重要的兩種抗體。如圖1所示，當(dāng)機(jī)體感染流感病毒之后，起初未來得及引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，因此，此時只能檢測到病毒抗原。之后，引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體IgM和IgG抗體。如圖2所示，當(dāng)機(jī)體感染流感病毒后，在體內(nèi)最早出現(xiàn)的是流感病毒的IgM抗體，之后再出現(xiàn)流感病毒的特異性IgG抗體。因此，通過檢測機(jī)體內(nèi)病毒抗原，及其特異性的IgM抗體和IgG抗體的存在與否，可以診斷機(jī)體對流感病毒的免疫反應(yīng)狀態(tài)。若只能檢測到病毒抗原，說明機(jī)體剛感染幾天，若血清內(nèi)檢測出病毒特異性的IgM抗體，證明該機(jī)體有近期流感的發(fā)生，但由于IgM半衰期較短，IgM的檢測陰性并不能證明機(jī)體未受到流感的感染，還需要檢測半衰期較長、含量最高的IgG抗體，以明確診斷。而病毒抗原在機(jī)體內(nèi)存在一個最高值，濃度也會隨時間的變化而變化，會存在檢測不到的情況。因此，通過同時檢測流感病毒抗原及其特異性的IgM抗體和IgG抗體，能夠準(zhǔn)確的判斷該機(jī)體的免疫學(xué)反應(yīng)狀態(tài)，從而根據(jù)檢測結(jié)果，給出準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，最終給以一定的臨床治療。遺憾的是，目前并沒有同時檢測流感病毒抗原及其特異性的IgM抗體和IgG抗體的試紙條。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于，提供一種同時檢測病毒抗原和抗體的膠體金免疫層析試紙條。所述膠體金免疫層析試紙條不僅能在一次檢測中同時檢測病毒抗原及其特異性IgM抗體和IgG抗體，而且能夠避免漏檢，可以大大縮短檢測時間和降低檢測費用，達(dá)到現(xiàn)場檢測的目的。[0006]為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0007]—種同時檢測病毒抗原和抗體的膠體金免疫層析試紙條，包括并列設(shè)置的第一膠條和第二膠條；所述第一膠條包括順次搭接的第一樣品墊、第一結(jié)合物墊、第一硝酸纖維素膜和第一吸水紙，其中所述第一結(jié)合物墊上涂覆有病毒抗體標(biāo)記的膠體金，所述第一硝酸纖維素膜上包被有病毒抗體作為第一檢測線并包被有抗膠體金上病毒抗體的抗體作為質(zhì)控線；所述第二膠條包括順次搭接的第二樣品墊、第二結(jié)合物墊、第二硝酸纖維素膜和第二吸水紙，其中所述第二結(jié)合物墊上涂覆有病毒抗原標(biāo)記的膠體金，所述第二硝酸纖維素膜上包被有抗人IgG抗體作為第二檢測線并包被有抗人IgM抗體作為第三檢測線。
[0008]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述膠體金上病毒抗體為鼠源性抗體，所述作為質(zhì)控線的抗體為羊抗鼠IgG。鼠源性抗體是目前商業(yè)化抗體中最常見的抗體形式，來源廣泛，成本較低，并且特異性和穩(wěn)定性好。所述病毒抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，制備所述多克隆抗體或單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，比如可以用相應(yīng)病毒免疫動物，如鼠，從動物血清中純化多克隆抗體，但是多克隆抗體相比單克隆抗體可能存在特異性不強(qiáng)的問題，有可能有假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。具體到本發(fā)明，所述病毒抗體雖然可以采用多克隆抗體，但是單克隆抗體具有更明顯的優(yōu)勢，因此是本發(fā)明的優(yōu)選，制備所述單克隆抗體的方法比如可以是用相應(yīng)病毒免疫動物，如鼠，取動物脾臟B細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，從中獲取特異性較強(qiáng)的單克隆抗體。
[0009]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述抗人IgG抗體為兔抗人IgG抗體或羊抗人IgG抗體，優(yōu)選為兔抗人IgG抗體。
[0010]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述抗人IgM抗體為兔抗人IgM抗體或羊抗人IgM抗體，優(yōu)選為兔抗人IgM抗體。
[0011]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述病毒為甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒或副流感病毒，優(yōu)選為甲型流感病毒、乙型流感病毒或腺病毒。
[0012]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述膠體金的粒徑為20?30nm。粒徑范圍在20?30nm的膠體金具有優(yōu)異的分散性及在流體中的流動性，不會有團(tuán)聚等現(xiàn)象的發(fā)生，有利于本發(fā)明中抗體和抗原間的免疫反應(yīng)及隨毛細(xì)作用下的移動。
[0013]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述樣品墊為玻璃纖維膜或聚酯纖維膜，優(yōu)選為玻璃纖維膜。
[0014]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述結(jié)合物墊為玻璃纖維膜。
[0015]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述膠體金免疫層析試紙條還包括底板，所述第一膠條和第二膠條均設(shè)置在所述底板上。
[0016]優(yōu)選地，所述底板為聚氯乙烯膠板。
[0017]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述膠體金免疫層析試紙條還包括卡殼，所述第一膠條和第二膠條均置于所述卡殼內(nèi)。
[0018]優(yōu)選地，所述卡殼上開有加樣區(qū)和顯色區(qū)，所述加樣區(qū)與所述第一樣品墊和第二樣品墊相對應(yīng)，所述顯色區(qū)與所述第一硝酸纖維素膜和第二硝酸纖維素膜相對應(yīng)。
[0019]優(yōu)選地，所述加樣區(qū)的數(shù)量為2個，分別與所述第一樣品墊和第二樣品墊相對應(yīng)。
[0020]優(yōu)選地，所述顯色區(qū)的數(shù)量為2個，分別與所述第一硝酸纖維素膜和第二硝酸纖維素膜相對應(yīng)。[0021]本發(fā)明所述的膠體金免疫層析試紙條依照免疫捕獲法原理和雙抗體夾心法原理同時測定病毒抗原及其特異性IgM和IgG抗體，通過一次性操作即可聯(lián)合檢測出流感等病毒抗原及其特異性IgM和IgG抗體。這種膠體金免疫層析試紙條具有特異性強(qiáng)、價格低廉及讀取結(jié)果快捷而直觀等優(yōu)點，不需要特殊儀器設(shè)備，也不需要專業(yè)人員的操作，檢測結(jié)果的總體符合率較高，適合于現(xiàn)場檢測。而且重要的是實現(xiàn)抗原和抗體的同時檢測，避免漏檢，起到雙重保險作用，從而獲取機(jī)體感染流感病毒的更多相關(guān)信息，具有重要的臨床意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為機(jī)體感染流感病毒后，體內(nèi)病毒抗原及其總抗體的濃度隨時間的變化情況；
[0023]圖2為機(jī)體感染流感病毒后，體內(nèi)抗原/抗體隨時間的變化情況；
[0024]圖3為本發(fā)明同時檢測病毒抗原和抗體的膠體金免疫層析試紙條的示意圖，其中，1:流感病毒抗原加樣區(qū)；2:血清抗體檢測加樣區(qū)；3:抗原檢測觀測窗口 ；4:抗體檢測觀測窗口 ；5:第一檢測線(Tl線)；6:質(zhì)控線(C線)；7:第二檢測線(T2線)8:第三檢測線(T3 線)；
[0025]圖4為本發(fā)明中的病毒抗原及抗體檢測原理圖；
[0026]圖5為本發(fā)明病毒抗原陽性檢測結(jié)果示意圖；
[0027]圖6為本發(fā)明病毒抗原/IgM抗體陽性檢測結(jié)果示意圖；
[0028]圖7為本發(fā)明病毒抗原/IgM/IgG抗體陽性檢測結(jié)果示意圖；
[0029]圖8為本發(fā)明病毒抗原/IgG抗體陽性檢測結(jié)果示意圖；
[0030]圖9為本發(fā)明病毒IgM抗體陽性檢測結(jié)果示意圖；
[0031]圖10為本發(fā)明病毒IgM/IgG抗體陽性檢測結(jié)果示意圖；
[0032]圖11為本發(fā)明病毒IgG抗體陽性檢測結(jié)果示意圖；
[0033]圖12為本發(fā)明病毒陰性檢測結(jié)果示意圖；
[0034]圖13為本發(fā)明病毒無效檢測結(jié)果示意圖；
[0035]圖14為本發(fā)明實施例中金納米顆粒的透射電鏡(TEM)照片。
【具體實施方式】
[0036]下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，以下實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。
[0037]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購買得到的。
[0038]本發(fā)明能夠同時檢測流感病毒抗原及其特異性IgM、IgG抗體的膠體金免疫層析試紙條可按照下述方法制備(參考圖2):
[0039]在聚氯乙烯(PVC)膠板上一端順次相互搭接地貼上樣品墊、結(jié)合物墊(兩塊)、硝酸纖維素膜、吸水紙，然后將PVC膠板及貼附的材料切成兩條試紙條(寬度如4_)，并裝入卡殼內(nèi)，卡殼上開有兩個加樣區(qū)和兩個顯色區(qū)(觀察區(qū)域)。
[0040]其中，所述樣品墊為玻璃纖維膜；所述結(jié)合物墊包括:涂覆有流感病毒抗體標(biāo)記的膠體金的第一結(jié)合物墊，涂覆有流感病毒抗原標(biāo)記的膠體金的第二結(jié)合物墊；所述硝酸纖維素膜包括:第一硝酸纖維素膜和第二硝酸纖維素膜，所述第一硝酸纖維素膜上包被有:Tl線為流感病毒的包被抗體，C線為羊抗鼠IgG抗體，所述第二硝酸纖維素膜上包被有:T2線為兔抗人的IgG抗體，Τ3線為兔抗人的IgM抗體。
[0041]如圖4所示，本發(fā)明能夠同時檢測流感病毒抗原及其特異性IgM、IgG抗體的膠體金免疫層析試紙條的檢測原理，具體如下:
[0042]在加樣區(qū)(樣品墊)加入被檢測樣品后，通過毛細(xì)作用，檢測病毒抗原的區(qū)域中:樣品中抗原-抗體-膠體金的結(jié)合物向吸水紙一端的方向移動。如果被檢測樣品中含有該流感病毒的抗原，樣品移動到Tl線即流感病毒的包被抗體的包被線時，抗原-抗體-膠體金的結(jié)合物被捕獲，在Tl線處生成抗體-抗原-抗體-膠體金的結(jié)合物，因此顯示一條紅色條帶；樣品繼續(xù)流動，流動到C線即羊抗鼠IgG抗體時,會出現(xiàn)一條紅色條帶,證明該試紙條的有效性。若檢測的實際樣品中不存在病毒抗原，則在Tl線處不會顯示紅色條帶。在檢測血清抗體的區(qū)域，加入待檢測的血清時，如果樣品中的IgG含有針對流感病毒抗原的IgG抗體，當(dāng)樣品通過T2線即抗人的IgG抗體包被線時，樣品中的IgG抗體與抗人IgG抗體結(jié)合，則IgG-抗原-膠體金的結(jié)合物被捕獲，在T2線顯示一條紅色條帶；樣品繼續(xù)移動至T3處即抗人的IgM包被線時，樣品中的IgM抗體與抗人IgM抗體結(jié)合，則IgM-抗原-膠體金的結(jié)合物被捕獲，在T3線顯示一條紅色條帶。若檢測的實際樣品中沒有針對該流感病毒的IgG和IgM抗體時，則在T2和T3線處不會顯示紅色條帶。若只有C線顯色，則都為陰性，證明該機(jī)體未感染流感。只要C線不顯色，證明該試紙條無效，需要重新檢測實際樣品。各種檢測結(jié)果示意圖如圖5-13所示，并且表I匯總了各種檢測結(jié)果的解釋。
[0043]表I檢測結(jié)果統(tǒng)計(“ + ”顯色，不顯色)
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種同時檢測病毒抗原和抗體的膠體金免疫層析試紙條，包括并列設(shè)置的第一膠條和第二膠條；所述第一膠條包括順次搭接的第一樣品墊、第一結(jié)合物墊、第一硝酸纖維素膜和第一吸水紙，其中所述第一結(jié)合物墊上涂覆有病毒抗體標(biāo)記的膠體金，所述第一硝酸纖維素膜上包被有病毒抗體作為第一檢測線并包被有抗膠體金上病毒抗體的抗體作為質(zhì)控線；所述第二膠條包括順次搭接的第二樣品墊、第二結(jié)合物墊、第二硝酸纖維素膜和第二吸水紙，其中所述第二結(jié)合物墊上涂覆有病毒抗原標(biāo)記的膠體金，所述第二硝酸纖維素膜上包被有抗人IgG抗體作為第二檢測線并包被有抗人IgM抗體作為第三檢測線。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述膠體金上病毒抗體為鼠源性抗體，所述作為質(zhì)控線的抗體為羊抗鼠IgG。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述抗人IgG抗體為兔抗人IgG抗體或羊抗人IgG抗體，優(yōu)選為兔抗人IgG抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述抗人IgM抗體為兔抗人IgM抗體或羊抗人IgM抗體，優(yōu)選為兔抗人IgM抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述病毒為甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒或副流感病毒，優(yōu)選為甲型流感病毒、乙型流感病毒或腺病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述膠體金的粒徑為20?30nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述樣品墊為玻璃纖維膜或聚酯纖維膜，優(yōu)選為玻璃纖維膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述結(jié)合物墊為玻璃纖維膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述膠體金免疫層析試紙條還包括底板，所述第一膠條和第二膠條均設(shè)置在所述底板上； 優(yōu)選地，所述底板為聚氯乙烯膠板。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述膠體金免疫層析試紙條還包括卡殼，所述第一膠條和第二膠條均置于所述卡殼內(nèi)； 優(yōu)選地，所述卡殼上開有加樣區(qū)和顯色區(qū)，所述加樣區(qū)與所述第一樣品墊和第二樣品墊相對應(yīng)，所述顯色區(qū)與所述第一硝酸纖維素膜和第二硝酸纖維素膜相對應(yīng)； 優(yōu)選地，所述加樣區(qū)的數(shù)量為2個，分別與所述第一樣品墊和第二樣品墊相對應(yīng)； 優(yōu)選地，所述顯色區(qū)的數(shù)量為2個，分別與所述第一硝酸纖維素膜和第二硝酸纖維素膜相對應(yīng)。
【文檔編號】G01N33/577GK103983776SQ201410228165
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】蔣興宇, 曹豐晶, 張偉, 陳翊平, 趙大龍 申請人:國家納米科學(xué)中心