專利名稱：：一種克倫特羅的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法和試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種動(dòng)物源性食品中克倫特羅殘留的雙功能基因工程抗體免疫檢測(cè)方法及實(shí)現(xiàn)所述檢測(cè)方法的試劑盒和試劑盒的制備方法。
背景技術(shù)：
：克倫特羅(Clenbuterol,CBL)，屬于P2-腎上腺素能激動(dòng)劑(BAA)的一種，屬兒茶酚胺類(腎上腺素和去甲腎上腺素)物質(zhì)。早在70年代初期，兒茶酚胺類物質(zhì)及其類似物改善機(jī)體營(yíng)養(yǎng)調(diào)配和胴體組成的能力，就由美國(guó)氰胺公司研究部所認(rèn)識(shí)。隨后便大規(guī)模用于畜禽生產(chǎn)以提高痩肉率，減少脂肪沉積，及增加產(chǎn)奶量等。其中，克倫特羅、萊克多巴胺等因其口服效率高在生產(chǎn)中使用最為廣泛。近年來(lái)，克倫特羅被大量添加到飼料中以提高脂肪型動(dòng)物的瘦肉率和加速動(dòng)物生長(zhǎng)，但因其添加劑量較大，在動(dòng)物體內(nèi)高殘留而給消費(fèi)者帶來(lái)危害。例如1989年，西班牙中部發(fā)生135人因食用含132-腎上腺素能激動(dòng)劑殘留的牛肝而集體中毒的事件；1990—1991年，法國(guó)里昂地區(qū)有8個(gè)家庭因食用殘留p2-腎上腺素能激動(dòng)劑的牛肝而集體中毒；1996年，僅意大利就發(fā)生62起因食用殘留有p2-腎上腺素能激動(dòng)劑的牛肉和牛肝而集體中毒的事件；中毒癥狀有肌肉震顫、心悸、神經(jīng)過(guò)敏、頭痛、肌肉痛、目眩、惡心、嘔吐、發(fā)燒、戰(zhàn)栗等，且有心臟病史的人對(duì)食物殘留P2-腎上腺素能激動(dòng)劑更為敏感(尹靖東等，1998)。因此，歐盟采取了嚴(yán)密的措施，通過(guò)一系列法規(guī)條例嚴(yán)格控制克倫特羅的非法使用。目前，許多國(guó)家已經(jīng)對(duì)克倫特羅提出了最高殘留限量，如英國(guó)在動(dòng)物可食性組織的最大殘留為0.5ng/g，荷蘭規(guī)定肝組織最大殘留量為lng/g(GA.Mitchell，eta1，1998)。我國(guó)農(nóng)業(yè)部1997年3月[農(nóng)牧發(fā)(1997)]3號(hào)文嚴(yán)令禁止p2-腎上腺素能激動(dòng)劑在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用，最高殘留限量規(guī)定為lng/g(肝組織)或lng/mL(尿液)。雖然，國(guó)家將p2-腎上腺素能激動(dòng)劑列為嚴(yán)重危害人民身體健康的違禁藥品，禁止生產(chǎn)和使用，但是非法使用現(xiàn)象仍較嚴(yán)重，因食用含有P2-腎上腺素能激動(dòng)劑的肉類、動(dòng)物內(nèi)臟而引發(fā)中毒的事件時(shí)有發(fā)生，例如2001年，連續(xù)發(fā)生了廣東河源、廣東信宜、浙江、上海等地十幾起上百人集體中毒的事件。因此，建立準(zhǔn)確、靈敏、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法對(duì)及時(shí)、有效的監(jiān)測(cè)克倫特羅的非法使用具有巨大的通常，檢測(cè)克倫特羅的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)，氣相色譜一質(zhì)譜法(GC-MS)，毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CE)和免疫分析技術(shù)aA)等等。HPLC法與GC-MS法是克倫特羅殘留檢測(cè)的確證方法，其優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)精確度高，但因其儀器化程度高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、過(guò)程繁瑣、檢測(cè)費(fèi)用昂貴等而阻礙其推廣應(yīng)用，而酶聯(lián)免疫分析(ELISA)快速檢測(cè)技術(shù)因成本低、操作簡(jiǎn)單、速度快、一次檢測(cè)樣本量大、儀器化程度低，現(xiàn)已成為常用的篩選方法。酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的基本原理就是利用酶標(biāo)記的抗原或抗體之間的反應(yīng)，通過(guò)酶作用底物的顯色以對(duì)抗體或抗原進(jìn)行分析。顯然，在對(duì)抗原分子檢測(cè)時(shí)，抗體本身以及酶標(biāo)抗體的質(zhì)量是保證該檢測(cè)手段實(shí)施的關(guān)鍵。在以往對(duì)CBL的免疫法檢測(cè)中，采用的是多克隆抗體或單克隆抗體。多抗較易獲得但特異性不高，有研究者已報(bào)道抗CBL多克隆抗體中因存在不同IgG亞型，從而對(duì)CBL及載體蛋白BSA表現(xiàn)出不同的綁定能力。而單克隆抗體則不存在該問(wèn)題，但值得注意的是，采用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行單克隆抗體(McAb)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低(產(chǎn)量平均只有10100mg/L)。另外，無(wú)論是多克隆抗體還是單克隆抗體，在采用酶聯(lián)免疫分析時(shí)都要對(duì)其進(jìn)行酶的體外標(biāo)記過(guò)程，將不可避免地存在以下缺點(diǎn)1)化學(xué)共價(jià)交聯(lián)過(guò)程對(duì)酶和抗體造成一定的變性，從而影響活性；2)酶標(biāo)抗體批次產(chǎn)物的不均一性導(dǎo)致在使用前需對(duì)其進(jìn)行校正；3)酶與抗體偶聯(lián)前后產(chǎn)物都需要進(jìn)行純化，步驟繁瑣。近年來(lái)，我國(guó)加大了對(duì)克倫特羅非法使用的打擊力度，把其作為動(dòng)物屠宰前后的必檢項(xiàng)目，但我國(guó)自行生產(chǎn)的ELISA試劑盒在靈敏度及數(shù)量上都無(wú)法滿足實(shí)際需要，僅深圳市每年進(jìn)口克倫特羅ELISA試劑盒一項(xiàng)費(fèi)用達(dá)幾百萬(wàn)元。由于試劑盒價(jià)格高，每個(gè)樣品檢測(cè)成本在幾十元以上。因此，建立有效、實(shí)際的抗體及酶標(biāo)抗體獲得方法是進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)CBL快速檢測(cè)需要解決的核心問(wèn)題。重組抗體技術(shù)引發(fā)了免疫檢測(cè)技術(shù)的革命，尤其是噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)的出現(xiàn)，使獲得具有理想抗原親和性及特異性的基因工程抗體成為可能。其優(yōu)點(diǎn)在于能夠?qū)⑷卓贵w可變區(qū)基因組裝到表達(dá)載體內(nèi)形成噬菌體抗體庫(kù)，通過(guò)"吸附-洗脫-擴(kuò)增"的富集過(guò)程，極為有效地從噬菌體抗體庫(kù)中篩選出特異性抗體的可變區(qū)基因，便于進(jìn)一步的基因操作?；诖说碾p功能基因工程抗體，就是指在DNA水平上把一種抗體片段的基因與其他功能分子如酶等的基因片段通過(guò)重組進(jìn)行融合表達(dá)的抗體分子復(fù)合蛋白。該抗體不僅具有基因工程抗體分子量小，特異性高的特點(diǎn)，而且保持了酶特異性結(jié)合底物的活性；更值得注意的是，雙功能基因工程抗體能夠在各種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，并且可通過(guò)基因工程技術(shù)進(jìn)行大量生產(chǎn)，對(duì)培養(yǎng)基無(wú)特殊要求，發(fā)酵密度高、發(fā)酵周期短、操作簡(jiǎn)便，整體費(fèi)用較低，這就為雙功能基因工程抗體在各相關(guān)領(lǐng)域中的實(shí)際應(yīng)用從根本上提供了保障。本申請(qǐng)人在申請(qǐng)?zhí)枮?00610036447.X的專利申請(qǐng)中公開(kāi)了一種檢測(cè)克倫特羅酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法與檢測(cè)前動(dòng)物組織的制樣方法，但并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)利用其雙功能基因工程抗體免疫進(jìn)行殘留檢測(cè)，現(xiàn)有技術(shù)中也沒(méi)有見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。本申請(qǐng)人期望利用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)獲得抗克倫特羅抗體基因，通過(guò)重組構(gòu)建抗克倫特羅雙功能基因工程抗體表達(dá)載體，采用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)與生物分離相結(jié)合的方法，實(shí)現(xiàn)抗克倫特羅雙功能基因工程抗體在大腸桿菌中的高效表達(dá)及分離純化，并將其替代體外酶標(biāo)多克隆/單克隆抗體用于酶免疫法分析克倫特羅。這是將酶免疫檢測(cè)技術(shù)進(jìn)一步應(yīng)用于小分子農(nóng)、獸藥殘留的快速檢測(cè)的一種新途徑，對(duì)我國(guó)建立有效、實(shí)際的克倫特羅快速檢測(cè)、加大對(duì)克倫特羅非法使用的打擊力度有著重要的意義
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有克倫特羅檢測(cè)技術(shù)的不足，提供一種高特異性、高靈敏度、價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單，能大批量快速檢測(cè)克倫特羅的雙功能基因工程抗體免疫檢測(cè)方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供實(shí)現(xiàn)所述檢測(cè)方法的試劑盒以及所述試劑盒的制備方法。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)予以實(shí)現(xiàn)提供一種克倫特羅的雙功能基因工程抗體免疫檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)將克倫特羅抗原包被于固相載體上;(2)加入標(biāo)樣或待測(cè)樣品，再加入克倫特羅雙功能基因工程抗體，反應(yīng)后加入底物液進(jìn)行顯色，測(cè)定百分吸光度；(3)根據(jù)百分吸光度值與克倫特羅濃度之間的半對(duì)數(shù)關(guān)系作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)克倫特羅的標(biāo)準(zhǔn)曲線和待檢樣品的百分吸光度值，推算出待測(cè)樣品中克倫特羅的濃度。本發(fā)明測(cè)定原理如下首先將克倫特羅抗原包被于固相載體(例如酶標(biāo)板)上，然后加入標(biāo)樣或待測(cè)樣品，再加入克倫特羅雙功能基因工程抗體，采用辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶基因工程抗體，包被抗原與待測(cè)樣品中的克倫特羅競(jìng)爭(zhēng)雙功能基因工程抗體，待測(cè)樣品克倫特羅含量高時(shí)，則與固相抗原結(jié)合的雙功能基因工程抗體就少，反之結(jié)合在固相抗原上的雙功能基因工程抗體就多，反應(yīng)后加入底物進(jìn)行顯色加以測(cè)定，當(dāng)雙功能基因工程抗體量一定時(shí)，加入的待測(cè)樣品含克倫特羅越多，與固相抗原結(jié)合的雙功能基因工程抗體就越少，發(fā)色反應(yīng)減弱，百分吸光度值低，反之，則發(fā)色反應(yīng)增強(qiáng)，百分吸光度增高，因而根據(jù)百分吸光度值與克倫特羅濃度之間的半對(duì)數(shù)關(guān)系作圖即得標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)克倫特羅的標(biāo)準(zhǔn)曲線和待檢樣品的百分吸光度值，即可推算出待測(cè)樣品中克倫特羅的濃度?？梢宰鳛椴襟E(1)所述固相載體的物質(zhì)較多，例如聚苯乙烯、硝酸纖維素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交聯(lián)葡萄糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等，該載體的形式可以為凹孔、紙片、小珠等。本發(fā)明優(yōu)選的固相載體為96孔或40孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，酶標(biāo)板包被有能與克倫特羅雙功能基因工程抗體特異結(jié)合的克倫特羅抗原，并封閉微孔表面未吸附位點(diǎn)；所用的包被液為pH9.6、O.05mol/L的碳酸鹽緩沖溶液，碳酸鹽緩沖溶液含l2g碳酸鈉和24g碳酸氫鈉，雙蒸水1L，封閉液為15%脫脂奶粉溶液。所述克倫特羅雙功能基因工程抗體是利用基因工程方法制備辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶克倫特羅基因工程抗體，抗體可為Fab(由完整的輕鏈和Fd構(gòu)成)、Fv(由VH和VL構(gòu)成)，ScFv(單鏈抗體，VH和VL之間由一條連接肽連接而成)、單域抗體(僅由VH組成)，大量表達(dá)，收集發(fā)酵液，用親和層析方法進(jìn)行純化。本發(fā)明同時(shí)提供一種實(shí)現(xiàn)所述克倫特羅的雙功能基因工程抗體免疫檢測(cè)方法的試劑盒，包含下列成分(1)試劑盒盒體；(2)包被克倫特羅抗原的酶標(biāo)板，1塊；(3)克倫特羅雙功能基因工程抗體工作液，l瓶；(4)克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品溶液，共6瓶；(5)底物液，l瓶；(6)底物緩沖液，1瓶；(7)終止液，l瓶；(8)濃縮洗滌液，1瓶；(9)使用說(shuō)明書(shū)，l份；(10)蓋板膜，2張；(11)含干燥劑的自封袋，l個(gè)。當(dāng)酶為辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，所述底物液為含有3，3，5，5—四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液、所述底物緩沖液為含有過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液、所述終止液為12mol/L硫酸溶液；當(dāng)酶為堿性磷酸酯酶時(shí)，底物液為pH9.8的4-硝基酚磷酸鈉鹽(PNPP)二乙醇胺溶液，終止液為2mol/L的氫氧化鈉溶液。所述6瓶克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為0ug/L、0.1Pg/L、0.3ug/L、0.9ug/L、2.7pg/L禾tl8.1ug/L;所述濃縮洗滌液為含0.51.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液pH值為7.4，濃度為0.1mol/L，為現(xiàn)有常規(guī)方法使用濃度的1525倍；所述克倫特羅雙功能基因工程抗體工作液體積為7mL;克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品溶液lmL/瓶;底物液體積為7mL;底物緩沖液體積為7mL;終止液體積為7mL;濃縮洗滌液體積為50mL。所述盒體為硬紙盒；酶標(biāo)板是96孔的聚苯乙烯酶標(biāo)板，放于鋁鉑袋內(nèi)；蓋板膜是不透明塑料貼紙；標(biāo)準(zhǔn)溶液、克倫特羅雙功能基因工程抗體、底物液、底物緩沖液、終止液和濃縮洗滌液采用不同顏色蓋的透明塑料瓶分裝，例如標(biāo)準(zhǔn)溶液均用紅色蓋的透明塑料瓶，克倫特羅雙功能基因工程抗體用綠色蓋的透明塑料瓶，底物液用黑色蓋透明塑料瓶，底物緩沖液用白色蓋透明塑料瓶，終止液用黃色蓋透明塑料瓶，濃縮洗滌液用白色透明蓋透明塑料瓶；盒內(nèi)設(shè)有內(nèi)墊，內(nèi)墊為塑料泡沫材料制成，設(shè)有下凹瓶位。本發(fā)明所述試劑盒的制備方法包括以下步驟-.(1)制備克倫特羅基因工程抗體；(2)制備酶標(biāo)板；(3)按照要求配制所需溶液并分裝；(4)組裝試劑盒。步驟(1)所述制備克倫特羅基因工程抗體包括以下步驟(a)提取克倫特羅單克隆細(xì)胞或經(jīng)克倫特羅免疫原免疫后的小鼠脾細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)抗體輕重鏈與連接肽的擴(kuò)增引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出抗體的輕重鏈基因并將其連接起來(lái)，將其插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中表達(dá)，利用免疫親和方法進(jìn)行純化，純度由SDS-PAGE電泳鑒定；(b)以重組噬菌體陽(yáng)性克隆質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增抗克倫特羅基因工程抗體片段；經(jīng)酶切，純化，亞克隆到攜帶辣根過(guò)氧化物酶HRP或堿性磷酸酶AP基因的載體pPhoA(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗性篩選，獲得重組大腸桿菌陽(yáng)性克??；誘導(dǎo)雙功能基因抗體的表達(dá)；優(yōu)化表達(dá)條件、高效表達(dá)沙丁胺醇雙功能基因工程抗體。得到克倫特羅雙功能基因工程抗體。所述擴(kuò)增引物為VH(Back):5，-TTACTCGCGGCCCAGCCGCCATGGCCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3，；VH(For):5，-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTGCC-3，；VL(Back):5，-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGGGATCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3，，VL(For):5，-GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGmTATTTCCAGCTTGGTCCC-3，；5，-CCATGATTACGCCAAGCTTTGGAGCC-3，；R2:5，-CGATCTAAAGTTTTGTCGTCTTTCC-3，；其中引物VH(Back)含SfiI酶切位點(diǎn)，VH(For)含(Gly4Ser)3連接肽部分序列；VL(For)含NotI酶切位點(diǎn)，VL(Back)含(Gly4Ser)3連接肽部分序列，其中21個(gè)堿基與VH(For)部分序列相重疊；&為載體特異性引物，用于插入片段的PCR鑒定。步驟(2)所述制備酶標(biāo)板的方法是用包被緩沖液將克倫特羅抗原按需要稀釋，向酶標(biāo)板微孔中加入抗原稀釋液，放入37'C環(huán)境進(jìn)行孵育，再放入4。C環(huán)境中過(guò)夜孵育；傾去包被液，用洗滌液洗滌，在每孔中加入封閉液，37'C孵育；傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。本發(fā)明試劑盒最低檢測(cè)限為0.1ng/mL，回收率為95±15%，批內(nèi)變異系數(shù)小于10%,同萊克多巴胺、沙丁胺醇、馬布特羅、特普他林、腎上腺素、去甲腎上腺素等結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)均小于0.01%,試劑盒可以在28。C保存12個(gè)月。本發(fā)明的有益效果是(1)本發(fā)明提供了將酶免疫檢測(cè)技術(shù)進(jìn)一步應(yīng)用于克倫特羅殘留的快速檢測(cè)的新方法，避免傳統(tǒng)化學(xué)共價(jià)交聯(lián)過(guò)程對(duì)酶和抗體造成的變性，可以很好保持兩者的活性；避免了酶標(biāo)抗體批次產(chǎn)物的不均一性導(dǎo)致的批間差異；減少了酶與抗體偶聯(lián)前后產(chǎn)物純化的歩驟從而減少了檢測(cè)成本；(2)雙功能基因工程抗體能夠在各種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，并且可通過(guò)基因工程技術(shù)進(jìn)行大量生產(chǎn)，對(duì)培養(yǎng)基無(wú)特殊要求，發(fā)酵密度高、發(fā)酵周期短，可降低制造成本；(3)本發(fā)明提供的試劑盒采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)模式，減少了操作步驟，提高了檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度；采用包被抗原進(jìn)行酶標(biāo)板的包被，相對(duì)于抗體包被，更有利于達(dá)到較好的包被效果與較長(zhǎng)的保存時(shí)間，從而提高了試劑盒檢測(cè)的精密度、準(zhǔn)確度與穩(wěn)定性?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)本試劑盒非常適用于克倫特羅殘留的痕量分析與批量檢測(cè)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。圖1為標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2為試劑盒的直觀示意3為酶標(biāo)板外觀示意圖圖4為酶標(biāo)板圖5為試劑瓶示意圖圖6為試劑盒包裝材料圖7試劑盒附件具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1克倫特羅雙功能基因工程抗體的制備設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物.-VH(Back):5，-TTACTCGCGGCCCAGCCGCCATGGCCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3，VH(For):5，-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTGCC-3，VL(Back):5，-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGGGATCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3'VL(For):5，-GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGmTATTTCCAGCTTGGTCCC-3'R"5，-CCATGATTACGCCAAGClTTGGAGCC-3，R2:5，-CGATCTAAAGTTTTGTCGTCTTTCC-3，其中引物VH(Back)含SfiI酶切位點(diǎn)，VH(For)含(Gly4Ser)3連接肽部分序列；VL(For)含NotI酶切位點(diǎn)，VL(Back)含(Gly4Ser)3連接肽部分序列，其中21個(gè)堿基與VH(For)部分序列相重疊。112為載體特異性引物，用于插入片段的PCR鑒定。以合成的CBL人工抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行了免疫，檢測(cè)血清效價(jià)滴度達(dá)到要求；取致敏動(dòng)物脾臟，提取總RNA，利用設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物經(jīng)RT-PCR成功擴(kuò)增出了免疫小鼠的全套輕、重鏈可變區(qū)基因，輕鏈的擴(kuò)增條件為94'Cx5min變性，加入14高保真Pfu酶(2.5U)，進(jìn)行以下循環(huán)94°Cx30s，54°Cxlmin，72°Cxlmin，共25個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸10min。重鏈的擴(kuò)增條件為94'Cx5min變性，加入1^iL高保真Pfa酶(2.5U)，進(jìn)行以下循環(huán)94°Cx30s，60。Cxlmin，72。Cxlmin，共30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min。Vh基因片段大小約為350bp，VL基因片段大小為320bp。以擴(kuò)增出的VH、VL片段互為模板，采用含(Gly4Ser)3連接肽的接頭引物，重疊延伸PCR法合成抗體基因片段，并采用兩條含Bg/I及I酶切位點(diǎn)的上下游引物對(duì)scFv進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增，條件為94°Cx5min預(yù)變性，加0.5^iL高保真Pfti酶，進(jìn)行以下循環(huán)94°Cx45s，50°Cxlmin，72°Cxlmin,共30個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min，得到760bp的全長(zhǎng)抗體基因片段。將抗體片段用Bg/I及NWI雙酶切后，與載體pCANTAB5E連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，用輔助噬菌體MnK07進(jìn)行超感染，構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)?？贵w庫(kù)庫(kù)容約為1.6X104。采用固相抗原法，以CBL-OVA為包被抗原，對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行親和富集，經(jīng)ELISA篩選出15個(gè)陽(yáng)性重組噬菌體克隆。將篩選出具有抗體活性的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒用BgZI及NofI雙酶切后與經(jīng)相同酶切的載體pPhoA(+)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌抗性篩選陽(yáng)性克隆，并經(jīng)過(guò)酶切、PCR鑒定。從上面鑒定為陽(yáng)性的克隆中提取質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化琥珀終止非抑制型大腸桿菌HB2151,IPTG誘導(dǎo)抗CBL雙功能抗體進(jìn)行可溶性表達(dá)。采用滲透休克法提取了菌體細(xì)胞周質(zhì)腔中的可溶性雙功能抗體，并對(duì)培養(yǎng)上清及周質(zhì)腔提取物中表達(dá)的抗體進(jìn)行SDS-PAGE，Western-Blotting及ELISA鑒定，并利用親和層析對(duì)其進(jìn)行純化。實(shí)施例2酶聯(lián)免疫試劑盒組分的配制(1)濃縮洗滌緩沖液的配制含0.51.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液，緩沖液pH值為7.4，濃度為0.1mol/L，為現(xiàn)有常規(guī)方法使用濃度的1525倍。(2)封閉液的配制脫脂奶粉1.05.0g溶于lOOmL蒸餾水。(3)底物緩沖液的配制30%過(guò)氧化氫30pL溶于19mL的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖液中，4"C保存。磷酸-檸檬酸緩沖液采用0.2MNa2HP0425.7mL、0.1M檸檬酸24.3mL、加蒸餾水50mL配制而成。(4)底物液的配制當(dāng)酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)時(shí)底物液是將3，3，5,5—四甲基聯(lián)苯胺(TMB)80mg溶于10mLpH5.0磷酸-檸檬酸緩沖液中，4X:保存。所述的磷酸-檸檬酸緩沖液采用0.2MNa2HP0425.7mL、0.1M擰檬酸24.3mL、加蒸餾水50mL配制而成。當(dāng)酶為堿性磷酸酶(AP)時(shí)底物液是將4-硝基酚磷酸鈉鹽(PNPP)100mg溶解于100mLpH9.8的二乙醇胺緩沖液中，4。C保存。二乙醇胺緩沖液采用二乙醇胺97mL、疊氮鈉0.2g溶解于1000mL蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至9.8，并儲(chǔ)存于4'C。(5)酶標(biāo)板微孔板的包被包被抗原用pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖溶液稀釋成0.15ug/mL，在酶標(biāo)板的每孔加100uL，37。C包被lh后4。C下包被過(guò)夜，傾去包被液，用PBST洗滌3次，拍干，然后在每孔中加入200uL1.05.0免脫脂奶粉，放入37。C溫箱中l(wèi)h后用PBST洗滌3次，干燥后封入鋁箔袋中4。C保存。碳酸鹽緩沖溶液采用12g碳酸鈉和24g碳酸氫鈉溶于雙蒸水1L配制而成。(6)克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取克倫特羅標(biāo)樣8.1mg，溶于0.1L緩沖液中，然后用緩沖液稀釋分別配制8.1pg/L、2.7pg/L、0.9|_ig/L、0.3pg/L、0.1pg/L克倫特羅溶液，另外緩沖液配制Opg/L對(duì)照樣，4。C保存。(7)試劑分裝各種試劑按要求配制，測(cè)定合格后無(wú)菌分裝?？藗愄亓_雙功能基因工程抗體工作液7mL/瓶，克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)樣品lmL/瓶，底物液7mL/瓶，底物緩沖液7mL/瓶，終止液7mL/瓶，濃縮洗液50mL/瓶，濃縮樣品稀釋液50mL/瓶。分裝后貼標(biāo)簽，注明批號(hào)和有效期，4"C保存。(8)試劑盒的組裝分別將可拆卸包被好包被抗原的微孔板1塊，克倫特羅雙功能基因工程抗體工作液、底物液、底物緩沖液、終止液、濃縮洗液、濃縮樣品稀釋液各l瓶，克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，使用說(shuō)明書(shū)1份置試劑盒內(nèi)指定位置。試劑盒檢驗(yàn)合格后封裝，4°C保存。實(shí)施例3檢測(cè)克倫特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建的檢測(cè)克倫特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒結(jié)構(gòu)如附圖2附圖7所示，除了試劑盒盒體外，其包含下述組分(1)包被克倫特羅抗原的酶標(biāo)板，96孔；(2)克倫特羅雙功能基因工程抗體工作液，7mL/瓶；(3)克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為Ojag/L、0.1pg/L、0.3[ig/L、0.9|ig/L、2.7ng/L、8.1|ig/L，lmL/瓶；(4)底物液，7mL/瓶；(5)底物緩沖液，7mL/瓶；(6)終止液，7mL/瓶；(7)濃縮洗滌液，50mL/瓶；(8)使用說(shuō)明書(shū)，l份；(9)蓋板膜，2張；(10)自封袋(含干燥劑)，l個(gè)。附圖2中1:克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液；2:克倫特羅雙功能基因工程抗體工作液；3:包被了克倫特羅抗原的酶標(biāo)板；4:使用說(shuō)明書(shū)；5:20倍濃縮洗滌液；6:底物緩沖液；7:底物液；8:終止液；9:自封袋；10:蓋板膜；附圖3中11:鋁箔袋；附圖4中12:96孔酶標(biāo)板板框；13:96孔可拆酶標(biāo)條；附圖5中14:20倍濃縮洗滌液(透明白蓋)；15:酶標(biāo)記物(綠蓋)；16:底物液(黑蓋)；17:底物緩沖液(白蓋)；18:終止液(黃蓋)；19:標(biāo)準(zhǔn)溶液(6瓶紅蓋)；附圖6中20:標(biāo)準(zhǔn)品凹孔；21:終止液凹孔；22:底物液凹孔；23:底物緩沖液凹孔；24:酶標(biāo)記物凹孔；25:20倍濃縮液凹孔；26:外包裝紙盒；附圖7試劑盒附件中27:蓋板膜(2個(gè))；28:自封袋(帶干燥劑)；29:說(shuō)明書(shū)。實(shí)施例4試劑盒用于檢測(cè)克倫特羅的實(shí)驗(yàn)一、樣品前處理(1)尿液樣本處理清澈尿液樣品可以直接進(jìn)行檢測(cè)分析。若尿樣呈渾濁狀，2000g離心5min或過(guò)濾，用上清液檢測(cè)。(2)飼料用研缽研碎飼料樣品，稱取2.0g研碎的樣品，加入2mLlmoL/LHCL，加入16mL去離子水均質(zhì)；渦旋混勻5min后，放振蕩器上振蕩15min;以2000r/min離心20min，轉(zhuǎn)移出上清液并加入2mLlmoL/LNaOH至上清液中混合，檢査pH值是否在6.57.5之間，若沒(méi)在此范圍應(yīng)檢査溶液是否配錯(cuò)，加以校正；以2000r/min離心20min，轉(zhuǎn)移出上清液，如果上清液仍然渾濁可適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過(guò)濾；用去離子水10倍稀釋上清液，稀釋方法是加100^iL清液到900^iL蒸餾水中，并且混合均勻；取50(iL進(jìn)行分析。(3)組織，例如肌肉、肝臟、腎臟等將動(dòng)物組織樣品用組織搗碎器搗碎，或用刀剁碎(可剁碎至成漿狀)；稱取5l0.05g樣品裝入15mL離心管中或其他容器，加入5mL蒸餾水，混勻；沸水浴中煮1015min;在4000g或更大離心力下離心1015min，或過(guò)濾；離心后的上清液或過(guò)濾后的澄清濾液作為樣品提取液，取50pL進(jìn)行分析。樣品提取液于4"C條件下可保存24h。二、試劑盒的檢測(cè)方法(1)將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(2024°C)平衡30min以上，將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的條板固定于支架，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，按順序編號(hào)。(2)在標(biāo)準(zhǔn)品孔加入50ML標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔加入50^iL待測(cè)樣品。然后每孔加入50(iL雙功能抗體，輕拍混勻。蓋上蓋板膜，在室溫孵育20min。(3)倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打(每輪洗板拍打3次)以保證完全除去孔中的液體。用250jxL蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中的液體，再重復(fù)操作3遍。(4)每孔加入IOOmL顯色液，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，暗處室溫孵育15min。(5)加入50iaL反應(yīng)終止液到微孔中?；旌虾迷诓ㄩL(zhǎng)450nm，以空氣為空白，測(cè)定各孔吸光值，必須在加入終止液后60min內(nèi)讀取吸光值。三、檢測(cè)結(jié)果計(jì)算與分析.-以所獲標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光值的平均值計(jì)算百分吸光度值，以百分吸光度值為縱坐標(biāo)，克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程為y=-14.951x+88.156，R2=0.998。用同樣的方法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，根據(jù)方程式求出對(duì)應(yīng)樣品的克倫特羅濃度。所述百分吸光度值的計(jì)算式為百分吸光度值(％)=(B/BQ)xlOO其中，B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品的平均吸光值，Bo為0ug/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。檢測(cè)結(jié)果的分析還可以利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件進(jìn)行計(jì)算與分析，對(duì)克倫特羅線性檢測(cè)范圍為0.18.1pg/L，檢測(cè)限為0.1pg/L，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需35min就可以完成。實(shí)施例5試劑盒精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)1、標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)性試驗(yàn)從3批按照實(shí)施例2(6)中的方法制備的酶標(biāo)板中，各抽出20個(gè)微孔，測(cè)定0.9pg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值(OD值)，重復(fù)20次，計(jì)算變異系數(shù)CVX，結(jié)果見(jiàn)表l。表1標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)性試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>結(jié)果表明試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的批內(nèi)變異系數(shù)范圍在3.14.2%之間，批間變異系數(shù)為8.1%。2、樣本重復(fù)性與準(zhǔn)確度試驗(yàn)準(zhǔn)確度是指測(cè)得值與真值的符合程度，在ELISA測(cè)定中，準(zhǔn)確度常以回收率表示，精密度常以變異系數(shù)來(lái)表示。在空白豬尿、豬肝中，將克倫特羅添加至終濃度為l嗎/L(嗎/kg)、5嗎/L(嗎/kg)，在空白飼料中，將克倫特羅添加至終濃度為50昭/kg、100嗎/kg，每個(gè)濃度各10個(gè)平行，測(cè)定3批。計(jì)算平均值、添加回收率及批內(nèi)與批間變異系數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表2。表2樣本重復(fù)性與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>結(jié)果表明尿樣、豬肝、飼料樣本的添加回收率在81.0108%之間，批內(nèi)變異系數(shù)在3.18.9%之間，批間變異系數(shù)在11.917.7%之間。實(shí)施例6試劑盒保存期試驗(yàn)(1)將試劑盒放置于28。C，分別取O、2、4、6、8、9、10、11和12個(gè)月的試劑盒，對(duì)克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)樣品(0.1pg/L)的吸光度值、50%抑制濃度、添加回收率、批內(nèi)變異系數(shù)各參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。(2)將試劑盒在37。C保存的條件下放置12天，每天對(duì)克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)樣品(0.1ng/L)的吸光度值、50%抑制濃度、添加回收率、批內(nèi)變異系數(shù)各參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。(3)將試劑盒在一2(TC冰箱保存12天，每天對(duì)克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)樣品(0.1Kig/L)的吸光度值、50%抑制濃度、添加回收率、批內(nèi)變異系數(shù)各參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。從結(jié)果可看出，經(jīng)過(guò)三種條件保存試驗(yàn)，克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)樣品(0.1Hg/L)的吸光度值下降小于5%，且OD不低于1.5;50%抑制率在0.71.0ug/L之間；添加回收率在80110%之間；批內(nèi)變異系數(shù)小于10%;各項(xiàng)指標(biāo)均符合質(zhì)量要求，因此，試劑盒可以在28"C保存12個(gè)月。權(quán)利要求1、一種克倫特羅的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟(1)將克倫特羅抗原包被于固相載體上；(2)加入標(biāo)樣或待測(cè)樣品，再加入克倫特羅雙功能基因工程抗體，反應(yīng)后加入底物液進(jìn)行顯色，測(cè)定百分吸光度；(3)根據(jù)百分吸光度值與克倫特羅濃度之間的半對(duì)數(shù)關(guān)系作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)克倫特羅的標(biāo)準(zhǔn)曲線和待檢樣品的百分吸光度值，推算出待測(cè)樣品中克倫特羅的濃度。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述克倫特羅的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于步驟(1)所述固相載體為96孔或40孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，包被有能與克倫特羅雙功能基因工程抗體特異結(jié)合的克倫特羅抗原，并封閉微孔表面未吸附位點(diǎn)；所述克倫特羅雙功能基因工程抗體為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶克倫特羅雙功能基因工程抗體，基因工程抗體為Fab、Fv、ScFv或單域抗體。3、一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述克倫特羅的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的試劑盒，其特征在于包含下列成分(1)試劑盒盒體；(2)包被克倫特羅抗原的酶標(biāo)板，1塊；(3)克倫特羅雙功能基因工程抗體工作液，l瓶；(4)克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品溶液，共6瓶；(5)底物液，l瓶；(6)底物緩沖液，1瓶；(7)終止液，l瓶；(8)濃縮洗滌液，l瓶；(9)使用說(shuō)明書(shū)，l份；(10)蓋板膜，2張；(11)含干燥劑的自封袋，l個(gè)。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于當(dāng)酶為辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，所述底物液為含有3，3，5，5—四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液、所述底物緩沖液為含有過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲的pH5.0磷酸-擰檬酸緩沖溶液、所述終止液為12mol/L硫酸溶液；當(dāng)酶為堿性磷酸酯酶時(shí)，底物液為pH9.8的4-硝基酚磷酸鈉鹽二乙醇胺溶液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉溶液。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述6瓶克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為0jig/L、0.1(ig/L、0.3pg/L、0.9ng/L、2.7ng/L和8.1pg/L;所述濃縮洗滌液為含0.51.5免吐溫20的磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液pH值為7.4，濃度為0.1mol/L;所述克倫特羅雙功能基因工程抗體工作液體積為7mL;克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品溶液lmL/瓶；底物液體積為7mL;底物緩沖液體積為7mL;終止液體積為7mL;濃縮洗滌液體積為50mL。6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述盒體為硬紙盒；酶標(biāo)板是96孔的聚苯乙烯酶標(biāo)板，放于鋁鉑袋內(nèi)；蓋板膜是不透明塑料貼紙；標(biāo)準(zhǔn)溶液、克倫特羅雙功能基因工程抗體、底物液、底物緩沖液、終止液和濃縮洗滌液采用不同顏色蓋的透明塑料瓶分裝；盒內(nèi)設(shè)有內(nèi)墊，內(nèi)墊為塑料泡沫材料制成，設(shè)有下凹瓶位。7、一種權(quán)利要求3所述試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)制備克倫特羅基因工程抗體；(2)制備酶標(biāo)板；(3)按照要求配制所需溶液并分裝；(4)組裝試劑盒。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述制備方法，其特征在于步驟(1)所述制備克倫特羅基因工程抗體包括以下步驟(a)提取克倫特羅單克隆細(xì)胞或經(jīng)克倫特羅免疫原免疫后的小鼠脾細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)抗體輕重鏈與連接肽的擴(kuò)增引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出抗體的輕重鏈基因并將其連接起來(lái)，將其插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中表達(dá)，利用免疫親和方法進(jìn)行純化；(b)以重組噬菌體陽(yáng)性克隆質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增抗克倫特羅基因工程抗體片段；經(jīng)酶切，純化，亞克隆到攜帶辣根過(guò)氧化物酶HRP或堿性磷酸酶AP基因的載體pPhoA(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗性篩選，獲得重組大腸桿菌陽(yáng)性克??；誘導(dǎo)雙功能基因抗體表達(dá)，得到克倫特羅雙功能基因工程抗體。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述制備方法，其特征在于所述擴(kuò)增引物為VH(Back):5，-TTACTCGCGGCCCAGCCGCCATGGCCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3，；VH(For):5，-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTGCC-3';VL(Back):5,-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGGGATCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3，；VL(For):5，-GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3，；Rf5，-CCATGATTACGCCAAGCTTTGGAGCC-3，；R2:5，-CGATCTAAAGTTTTGTCGTCTTTCC-3，；其中引物Vu(Back)含SfiI酶切位點(diǎn)，VH(For)含(Gly4Ser)3連接肽部分序列；VL(For)含NotI酶切位點(diǎn)，VL(Back)含(Gly4Ser)3連接肽部分序列，其中21個(gè)堿基與VH(For)部分序列相重疊；RpR2為載體特異性引物，用于插入片段的PCR鑒定。10、根據(jù)權(quán)利要求7所述制備方法，其特征在于步驟(2)所述制備酶標(biāo)板的方法是用包被緩沖液將克倫特羅抗原按需要稀釋，向酶標(biāo)板微孔中加入抗原稀釋液，放入37。C環(huán)境進(jìn)行孵育，再放入4°。環(huán)境中過(guò)夜孵育；傾去包被液，用洗滌液洗滌，在每孔中加入封閉液，37。C孵育；傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種克倫特羅的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法和試劑盒及其制備方法。檢測(cè)方法包括將克倫特羅抗原包被于固相載體上、加入標(biāo)樣或待測(cè)樣品，再加入克倫特羅雙功能基因工程抗體，反應(yīng)后加入底物液進(jìn)行顯色，測(cè)定百分吸光度、根據(jù)克倫特羅的標(biāo)準(zhǔn)曲線和待檢樣品的百分吸光度值，推算出待測(cè)樣品中克倫特羅的濃度等步驟；本發(fā)明同時(shí)公開(kāi)了實(shí)現(xiàn)所述檢測(cè)方法的試劑盒及試劑盒的制備方法。本發(fā)明采用克倫特羅雙功能基因工程抗體與直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)，靈敏度高、穩(wěn)定性好，大大簡(jiǎn)化了操作步驟和反應(yīng)時(shí)間，且降低了成本，非常適合大量樣品的篩查，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。文檔編號(hào)G01N33/543GK101290315SQ20081002863公開(kāi)日2008年10月22日申請(qǐng)日期2008年6月6日優(yōu)先權(quán)日2008年6月6日發(fā)明者劉細(xì)霞,孫遠(yuǎn)明,楊金易,柳春紅,燕梁,沈玉棟,科潘,弘王,肖治理,雷紅濤申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)