專利名稱：：一種用于胎膜早破診斷的試紙條及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于免疫應(yīng)用領(lǐng)域，涉及分子生物學(xué)、免疫、醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。具體地講涉及胎膜早破、羊水外溢，然后檢測(cè)外溢羊水中特異性的標(biāo)記物進(jìn)而診斷胎膜早破這種疾病的試紙條及試劑盒。
背景技術(shù)：
：月臺(tái)月莫早石皮(prematureruptureofmembrane,PROM)是產(chǎn)牙牛常見的并發(fā)癥，易導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)感染、胎兒窘迫等并發(fā)癥，圍生兒死亡率和發(fā)病率升高，但無理想方法準(zhǔn)確評(píng)估胎兒宮內(nèi)安危。在所有病人中分娩之前胎膜破裂發(fā)生率在6.6%-13.9%，而且在接下來的48小時(shí)，在這些病例中70°/。-9W會(huì)發(fā)生自發(fā)流產(chǎn)。胎膜早破不但直接或間接引起4.5%-14%的早產(chǎn)，而且引起顯著的死亡率和與分娩相關(guān)的患病率。在對(duì)109位和111位孕婦研究中分別對(duì)新生兒研究結(jié)果顯示，在34周或之前PROM會(huì)導(dǎo)致一個(gè)總體上16.8%-26.6%的死亡率，和68.8%的發(fā)病率。因此建立一種筒單準(zhǔn)確的PROM診斷方法是有很重要意義的。在有些情況下，PROM可以根據(jù)陰道里釋放的清澈的羊水和之后羊水的繼續(xù)存在，而很容易的判斷出。在某些情況下PROM不是那樣明顯，而且很難區(qū)分泄露的羊水和尿液以及陰道的宮頸分泌物。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道可以通過很多程序診斷PROM,這些程序主要包括胎兒鱗片狀上皮細(xì)胞或絨毛的鑒定、在胎兒細(xì)胞著色后在其內(nèi)部或外部對(duì)胎兒細(xì)胞脂肪球顯微鏡鑒定的方法、陰道粘液pH的估算、干燥羊水的結(jié)晶型、加熱的羊水、陰道粘液中二元胺氧化酶活性的測(cè)量、陰道粘液泌乳刺激素、陰道粘液中透明的胎蛋白、陰道粘液中的類胰島素生長因子結(jié)合蛋白、抑制素B的測(cè)量等等。然而，所有這些診斷方法都是在PROM已經(jīng)發(fā)生的情況下進(jìn)行的，它們不是完全準(zhǔn)確的。因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下，干擾物質(zhì)的存在而且有些在陰道里面產(chǎn)生，比如尿、胎糞、孕婦血清和血。這些干擾物質(zhì)的存在很容易引起對(duì)PROM的誤判。免疫層析(imm圃chromatography)是出現(xiàn)于八十年代初期的一種獨(dú)特的免疫分析方式，該方法的核心技術(shù)是以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細(xì)管作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng)，并同時(shí)使樣品中的待測(cè)物與層析材料上針對(duì)待測(cè)物的受體如抗原或抗體發(fā)生高特異、高親和性的免疫反應(yīng)。膠體金免疫層析分析(gold-immunochromatographyassayGICA)是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。層析過程中，金標(biāo)記物與事先固相化于層析材料如硝酸纖維素膜即NC膜上的抗原或抗體發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)而被截留，進(jìn)一步富集，形成肉眼可見紫紅色條帶，從而得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，達(dá)到檢測(cè)的目的。這種方法對(duì)所使用的抗原抗體的要求較高，要求具有好的特異性和高純度。依據(jù)這種原理，已經(jīng)發(fā)展出了很多膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條。在人醫(yī)應(yīng)用方面，國內(nèi)外已在激素、傳染病病原的抗原和抗體、性病病原、細(xì)菌、寄生蟲、腫瘤標(biāo)記物、心血管病標(biāo)志物、藥物以及其他一些蛋白質(zhì)等方面應(yīng)用了金標(biāo)免疫層析試紙條。在獸醫(yī)應(yīng)用方面，例如在豬瘟、犬細(xì)小病毒病等方面也應(yīng)用了金標(biāo)免疫層析試紙條。在胎膜早破診斷相關(guān)方面，存在有三個(gè)專利。第一個(gè)名稱為檢測(cè)陰道分泌物中羊水的裝置和方法(國際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US2003/0251252003,8.12)，雖然該專利與本發(fā)明申請(qǐng)的專利原理相同均為雙抗夾心膠體金免疫層析法。但本發(fā)明與已有的這個(gè)專利在運(yùn)用上述方法上的關(guān)鍵性物質(zhì)完全不同已有的專利使用的兩種單克隆抗體是針對(duì)al-微球蛋白(PAMG-1)的不同抗原表位的，而本發(fā)明所使用的兩種單克隆抗體是針對(duì)AMNI-ProteinorAMNI-Pr的。本發(fā)明組裝的試劑盒特異性較好，敏感度較高。另一
專利名稱：為一次性胎膜早破pH試紙?jiān)\斷棒(200620083734.1),這個(gè)發(fā)明的缺點(diǎn)是敏感度不高，易引起假陰性。又一
專利名稱：AMARKERFORPROLONGEDRUPTUREOFMEMBRANES(WO2007030890),該專利中檢測(cè)羊水的方法為ELISA方法，該方法與膠體金免疫層析方法相比缺點(diǎn)是耗時(shí)長，需要操作儀器，對(duì)操作人員要求較高
發(fā)明內(nèi)容"測(cè)胎膜早破的試紙條及試劑盒，本發(fā)明的試紙條及試劑盒特異性較好，敏感度較高。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種用于胎膜早破診斷的試紙條，試紙條水平面自上而下依次為吸水墊、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊，其特征在于硝酸纖維素膜上包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線，其中檢測(cè)線為單克隆抗體11B6,質(zhì)控線為兔抗鼠IgG抗體；金標(biāo)墊上涂覆有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體14A3;再將吸收墊、包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜、涂覆有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體14A3的金標(biāo)墊、樣品墊按自上而下的順序依次粘附在不吸水的支撐薄片上組裝而成，且在樣品墊上設(shè)有一加樣孔，其中單克隆抗體11B6和單克隆抗體14A3為羊水中的特異性標(biāo)記物即AMNI-ProteinorAMNI-Pr,公開的專利號(hào)為WO/2007/030890,針對(duì)特異性標(biāo)記物AMNI—ProteinorAMNI-Pr的不同抗原表位而制備的雜交瘤細(xì)胞林11B6和HA3。這兩抹細(xì)胞編號(hào)為14A3和11B6，于2008年01月17日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏編號(hào)分別為CCTCC-C200801和CCTCC-C200802。所述硝酸纖維素膜、吸收墊、金標(biāo)墊、樣品墊、不吸水的支撐薄片均可購自Mil1ipore公司。所述單克隆抗體11B6和14A3的制備方法(1)用羊水特異性蛋白AMNI-Pr免疫BALB/c小鼠取含150pg的羊水特異性蛋白AMNI-Pr蛋白溶液與等體積的弗氏完全佐劑乳化后注射小鼠腹腔，21天后，取含lS(^g的羊水特異性蛋白A顧I-Pr蛋白溶液與等體積的弗氏不完全佐劑乳化后注射小鼠腹腔，最后于融合前三天或與第一次免疫時(shí)間相隔4周以上，再在BALB/c小鼠的腹腔進(jìn)行強(qiáng)化免疫，抗原量加倍到300l^g,不加佐劑；(2)融合時(shí)，取經(jīng)最后強(qiáng)化免疫的BALB/c小鼠一只，眼眶放血處死，收集陽性血清，在濃度75%酒精溶液中浸泡5min消毒，無菌取出小鼠脾臟，分離出脾細(xì)胞，與新鮮制備的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，按1~2x107個(gè)SP2/0與108個(gè)免疫脾細(xì)胞1:10-1:15的比例于50mL離心管中混勻，1500rpm,離心10min,倒掉上清，將裝有細(xì)胞混合物的離心管放于37。C水浴中，然后在lmin內(nèi)慢慢滴入預(yù)溫至37。C的濃度為50%聚乙二醇(PEG)0.8mL,邊加邊用吸管尖攪拌，繼續(xù)攪拌lmin;然后加入37。C預(yù)溫的P詣I-1640基礎(chǔ)液lOmL，PRMI-1640購自GIBCO公司，具體方法為第一分鐘逐滴滴入lmL,第二分鐘加lmL,第3~4分鐘加3mL，第5分鐘加其余的5mL,最后加入30mLPRMI-1640液，800rpm離心5min，去上清，于37。C放置5~8min;用HAT培養(yǎng)基懸??；(3)將用HAT培養(yǎng)基懸浮的細(xì)胞混合物分種于96孔培養(yǎng)板中250(iL/孔，每孔接種量含104個(gè)SP2/0細(xì)胞，于37°C，濃度為5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，融合后的第二天開始觀察有無污染，于第4天補(bǔ)加1滴HAT培養(yǎng)基，第8~10天吸去100l-tL培養(yǎng)基換HT培養(yǎng)基10(mL,待融合細(xì)胞集落長至培養(yǎng)孔1/4，培養(yǎng)基變黃時(shí)，進(jìn)行抗體檢測(cè)；采用免疫原作為篩選抗原，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法篩選出分泌抗AMNI-Pr的陽性孔；(4)對(duì)篩選出來的陽性孔用有限稀釋法進(jìn)行克隆、篩選，經(jīng)過3~4次克隆，最終篩選出分泌兩林抗AMNI-Pr的單克隆雜交瘤細(xì)胞，這兩才朱細(xì)胞編號(hào)為14A3和11B6。一種用于胎膜早破診斷的試劑盒，將所述的試紙條、樣品稀釋液、棉簽、離心管、吸管放置在同一個(gè)盒中，樣品稀釋液為濃度0.85%的生理鹽水。本發(fā)明的原理是單克隆抗體11B6作為檢測(cè)線包被物，單克隆抗體14A3作為膠體金標(biāo)記的抗體，利用雙抗夾心法來檢測(cè)待檢樣品中是否含有羊水。檢測(cè)時(shí)，待檢樣品中若有羊水存在時(shí)羊水中多肽標(biāo)記物首先與金標(biāo)記抗體14A3發(fā)生抗原抗體反應(yīng)形成復(fù)合物多肽標(biāo)記物-金標(biāo)記單克隆抗體14A3復(fù)合物，由于毛細(xì)管作用，反應(yīng)復(fù)合物沿硝酸纖維素膜(NC膜)向前泳動(dòng)，到達(dá)檢測(cè)線時(shí)，遇到NC膜上的單克隆抗體11B6，就會(huì)形成單克隆抗體11B6-多肽標(biāo)記物-金標(biāo)記單克隆抗體14A3復(fù)合物，從而富集在檢測(cè)線上，形成紅色沉淀線，未結(jié)合在檢測(cè)線上的復(fù)合物繼續(xù)向前涌動(dòng)，最后富集在質(zhì)控線上，判為陽性結(jié)果；若樣品中不含有羊水時(shí)金標(biāo)單克隆抗體14A3到達(dá)檢測(cè)線時(shí)，遇到包被在檢測(cè)線上的單克隆抗體11B6就不會(huì)發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，因此也就不會(huì)在檢測(cè)線上富集，金標(biāo)單克隆抗體14A3通過檢測(cè)線，富集在質(zhì)控線上，形成紅色沉淀線，判為陰性結(jié)果。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、對(duì)胎膜早破中外溢的羊水檢測(cè)具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短，只要510分鐘，檢測(cè)樣品可以是血液、陰道粘液、宮頸液，這樣檢測(cè)樣品范圍寬；2、本發(fā)明的檢測(cè)方法不需要任何特殊儀器、設(shè)備，具有檢測(cè)成本低的特點(diǎn)；3、本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒操作簡(jiǎn)便，不需由專業(yè)人員操作；4、本發(fā)明的試劑盒儲(chǔ)存方便，對(duì)溫度要求不高，在48。C下有效保存期可達(dá)一年；在室溫下可保存六個(gè)月。圖1為本發(fā)明的試紙條的俯視圖。圖2為本發(fā)明試紙條的側(cè)視圖。圖中1-吸水墊，2-質(zhì)控線，3-檢觀'j線，4-金標(biāo)墊，5-樣品墊，6-硝酸纖維素膜，7-襯板。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1AMNI-Pr的制備羊水標(biāo)本從經(jīng)剖腹產(chǎn)手術(shù)的婦女身上獲取25-975ml，并在以2ml—份分裝到5ml離心管中，分裝之前用玻璃棉過濾。每管2ml，混合二十管羊水制備樣品池，然后用如下方法純化首先用Affi-Gel藍(lán)月交(AurumAffi-GelBlueMiniKit)預(yù)處理除去內(nèi)源性白蛋白，Affi-Gel藍(lán)膠購自美國Bio-Rad公司，根據(jù)所購買的Affi-Gel藍(lán)膠說明書預(yù)處理樣品池中的樣品。被用Affi-Gel藍(lán)膠處理過的樣品接下來用國際專利號(hào)為W003/018634描述的免疫層析法處理，可得到羊水特異性的蛋白。最后用兩種截留分子量分別為300kD和lOOkD離心超濾管(AmiconUltra-4)，300kD和lOOkD離心超濾管購自美國密理博(Mi11ipore)公司,按照所購買離心超濾管說明書處理羊水特異性蛋白，最后可得到三種濾過液，按分子量大小排列分別為AF1、AF2和AF3，這三種標(biāo)記物均為羊水中的特異性標(biāo)記物即A匪I-Pr的制備。實(shí)施例2抗AMNI-Pr單克隆抗體的制備參照薛慶善《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》科學(xué)出版社2001年版中的方法用上述所制備的AF1、AF2和AF3分別免疫BALB/c小鼠，BALB/c小鼠購自湖北省醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，免疫程序是取含15(mg的AF1或AF2或AF3蛋白溶液與等體積的弗氏完全佐劑乳化，弗氏完全佐劑購自Sigma公司，注射小鼠腹腔，21天后加強(qiáng)免疫，換用弗氏不完全佐劑乳化，弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；最后于融合前三天，也可以是與第一次免疫時(shí)間相隔4周以上，在BALB/c小鼠的腹腔強(qiáng)化免疫，抗原量加倍到30(mg，不加佐劑，融合時(shí)，取經(jīng)最后強(qiáng)化免疫的BALB/c小鼠一只，眼眶放血處死，收集陽性血清，在75%酒精中浸泡5min消毒，無菌取出小鼠脾臟，分離出脾細(xì)胞，與新鮮制備的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，按2x107個(gè)SP2/0與10s個(gè)免疫細(xì)胞1:15的比例于50mL離心管中混勻，SP2/0骨髓瘤細(xì)胞購自衛(wèi)生部武漢生物制品所，1500rpm，離心10min。倒掉上清，也可用滅菌的濾紙吸干，輕輕敲擊管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)；將裝有細(xì)胞混合物的離心管放于37。C水浴中，然后在lmin內(nèi)慢慢滴入預(yù)溫至37。C的50%聚乙二醇(PEG)0.8mL，50%聚乙二醇購自Sigma公司，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌，繼續(xù)攪拌lmin;然后慢慢加入37。C預(yù)溫的PRMI-1640基礎(chǔ)液10mL，PRMI-1640購自Sigma公司，基礎(chǔ)液的配方PRMI-164010.4g,NaHC032g，用蒸餾水定容至100畫1,調(diào)pH至7.2;具體方法為第一分鐘逐滴滴入lmL,第二分鐘加lmL,第3~4分鐘加3mL，第5分鐘加其余的5mL,每次加時(shí)需緩慢加入，并不斷輕輕地?cái)嚢瑁蛔詈蠹尤?0mLPRMI-1640液，也需慢慢加入，800rpm離心5min，去上清，于37。C放置5~8min;用HAT培養(yǎng)基懸浮，HAT購自Sigma公司，HAT培養(yǎng)基的成分80mL基礎(chǔ)液，20mL滅菌小牛血清，lmL100。/。的HAT,lmL雙抗，雙抗配制取青霉素G鈉100萬單位和硫酸慶大霉素lg溶入lOOmL三蒸水；同時(shí)也用HAT培養(yǎng)基懸浮制備好的飼養(yǎng)細(xì)胞并與融合后的細(xì)胞混合。根據(jù)需要補(bǔ)加HAT培養(yǎng)基，分種于96孔培養(yǎng)板中，約250吣/孔。一次融合可接種4~8塊96孔板。根據(jù)需要也可少種，一般按SP2/0的細(xì)胞數(shù)計(jì)算，每孔接種量約含104左右個(gè)SP2/0細(xì)胞。于37°C,5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后的第二天開始觀察有無污染，于第4天補(bǔ)加1滴HAT培養(yǎng)基，第8~10天吸去IOO吣培養(yǎng)基換HT培養(yǎng)基lOOl^L,HT購自Sigma公司，HT培養(yǎng)基的成分80mL基礎(chǔ)液，20mL滅菌小牛血清，lmL100%的HT,lmL雙抗；待融合細(xì)胞集落長至培養(yǎng)孔1/4，培養(yǎng)基變黃時(shí)，進(jìn)行抗體^r測(cè)；采用免疫原作為篩選抗原，利用ELISA方法篩選出分泌抗AMNI-Pr的陽性孔。對(duì)篩選出來的陽性孔立刻用有限稀釋法進(jìn)行克隆、篩選，有限稀釋法參照薛慶善《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》科學(xué)出版社2001年版；經(jīng)過34次克隆，最終篩選出分泌兩抹抗AMNI-Pr的單克隆雜交瘤細(xì)胞，這兩林細(xì)胞編號(hào)為14A3和11B6，于2008年01月17日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)分別為CCTCC-C200801和CCTCC-C200802。對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行了染色體計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，SP2/0的染色體平均數(shù)為70，脾細(xì)胞染色體為40條，而雜交瘤細(xì)胞的數(shù)目在81~93之間。均高于兩親本細(xì)胞的染色體數(shù)目，說明融合細(xì)胞的確是SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞的雜交產(chǎn)物，雜交瘤細(xì)胞的染色體明顯多于骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的染色體。將該細(xì)胞注射BALB/c小鼠腹腔，生產(chǎn)單克隆抗體。采用購自ROCKLAND公司的鼠源單抗亞型鑒定試劑盒(MouseMabIsotypingTestKit)對(duì)本發(fā)明所得到的單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果小鼠IgG2b亞類。實(shí)施例31.腹水的制備采用滅菌液體石蠟預(yù)處理BALB/c小鼠后，再注射雜交瘤細(xì)胞的方法生產(chǎn)腹水，其具體過程如下BALB/c小鼠的預(yù)處理用滅菌的液體石蠟處理小鼠，腹腔注射0.5mL/只，十天后即可注射雜交瘤細(xì)胞。陽性孔的擴(kuò)大培養(yǎng)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入飼養(yǎng)細(xì)胞，4滴/孔，將96孔板內(nèi)的陽性細(xì)胞轉(zhuǎn)到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。注射待到細(xì)胞長滿孔底將24孔板的細(xì)胞重懸，1200r/min,離心5min,細(xì)胞計(jì)數(shù)，用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋成5X106個(gè)/毫升，腹腔注射小鼠O.5mL/只，8天左右觀察到小鼠腹部隆起，即可采集腹水。2.腹水的預(yù)處理3000g,離心10min，取上清，上清用0.45|um濾膜過濾。3.腹水中單抗的初步純化使用羥基磷灰石層析柱純化羥基磷灰石(HA)層析柱購自BioRad公司羥基磷灰石(HA)層析柱的原理HA的Ca2+基團(tuán)和生物分子蛋白質(zhì)、核酸、病毒和其它生命物質(zhì)表面的負(fù)電荷基團(tuán)的相互反應(yīng)，在用HA分離生物分子過程中起著重要作用。而HA的P04-3基團(tuán)與生物分子表面的陽電荷基團(tuán)的相互反應(yīng)，則起著次要作用。羥基磷灰石(HA)層析柱緩沖液的制備平衡柱子的緩沖液25隨ol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0。具體配方為5.45gNa2HP04.12H20，1.52gNaH2P04.2H20，定容至lOOOml。洗脫柱子的緩沖液500隱ol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0。具體配方為109gNa2HPO4.12H20，30.4gNaH2P04.2H20，定容至lOOOml。羥基磷灰石(HA)層析柱使用的步驟將預(yù)處理的腹水上清直接上柱。用25mmol/L磷酸鹽緩沖液沖洗柱子，直至OD280小于0.2。用500mmol/L磷酸鹽緩沖液洗脫柱子，收集洗脫峰。將收集的洗脫峰脫鹽，用超濾杯或透析脫鹽，將磷酸鹽降低至20mmol/L。4.用單抗純化凝膠親和層析(HiTrapProteinGHP)純化柱將腹水中單抗進(jìn)一步純化HiTrapProteinGHP純化柱購白GEHealthcareBio-Scie腦sAB公司。HiTrapProteinGHP這種純4b牙主的原理蛋白G是G類鏈球菌細(xì)胞表面的一個(gè)蛋白，是一個(gè)能夠通過非免疫機(jī)制與IgG的Fc結(jié)合的III型Fc受體，這種結(jié)合的原理與金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)A類似。然而蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)G有不同的結(jié)合特異性，這主要取決于IgG的來源。與蛋白質(zhì)A比較，蛋白質(zhì)G在結(jié)合單抗IgG時(shí)更強(qiáng)，比如來自牛、綿羊和馬的單抗IgG。與蛋白質(zhì)A不同的是蛋白質(zhì)G能夠結(jié)合鼠單抗IgG、人lgG3和小白鼠IgGl。HiTrapProteinGHP這種純化柱中填充的高性能蛋白質(zhì)G瓊脂糖凝膠中的蛋白質(zhì)G由在大腸桿菌中重組蛋白產(chǎn)生，這種重組蛋白含有兩個(gè)IgG結(jié)合區(qū)域。天然蛋白質(zhì)G的清蛋白結(jié)合區(qū)域在遺傳過程中已經(jīng)被刪除，因此這種重組的IgG能夠避免與清蛋白的交叉反應(yīng)。HiTrapProteinGHP這種純化柱-故設(shè)計(jì)的目的就是將IgG從來自腹水、血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清的多抗或單抗中分離并純化出來。HiTrapProteinGHP這種純化柱平衡純化后樣品酸度平衡緩沖液的制備由于蛋白質(zhì)G與IgG在pH7.0時(shí)有很強(qiáng)的親合性，因此在洗脫時(shí)所用的洗脫液pH值通常較低。由于某些純化后的IgG可能對(duì)過低的酸度敏感從而影響它的活性，為了避免這種情況的發(fā)生，我們?cè)谑占瘶悠窌r(shí)通常提前加入了一些酸度平衡緩沖液。酸度平衡緩沖液的配方為lMTris-HCl，pH9.0,用0.45pm濾膜過濾處理。具體配方為121g三(羥甲基)氨基曱烷(Tris-base),用濃鹽酸調(diào)pH9.0，定容至1000ml。HiTrapProteinGHP這種純化柱緩沖液的制備吸附緩沖液20mM磷酸鈉緩沖液，pH7.0,用0.45jum濾膜過濾。具體配方為3.12g磷酸二氫鈉，用lM氫氧化鈉調(diào)pH7.0，定容至1000ml。洗脫緩沖液0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH2.7，用0.45jum濾膜過濾。具體配方0.75g甘氨酸，0.28ml濃鹽酸，pH2.7,定容至100ml。HiTrapProteinGHP這種純化柱對(duì)樣品處理的要求樣品首先要進(jìn)行去鹽處理，這可以通過用吸附緩沖液稀釋樣品或用HiTrap、HiPr印TM26/10或者PD-10這幾種通過離子交換的脫鹽柱子來實(shí)現(xiàn)樣品脫鹽處理。脫鹽處理后的樣品需用0.45jum濾膜過濾處理。HiTrapProteinGHP這種純化柱使用的操作步驟在收集管中添加200mL酸度平衡緩沖液。用10倍柱體積的吸附緩沖液洗柱子，流速為lml/min。根據(jù)柱子結(jié)合單抗的容量大小，適當(dāng)選擇一次上柱樣品的量。用10倍體積的吸附緩沖液洗柱子，去除樣品中非結(jié)合物。用5倍體積的洗脫緩沖液洗脫柱子，每個(gè)收集管收集lml。收集的純化物可以通過HiTrap、HiPrepTM26/10或者PD-10這幾種通過離子交換的脫鹽柱子來實(shí)現(xiàn)樣品脫鹽處理。實(shí)施例4兔抗鼠IgG抗體的制備參照何昭陽等主編，《動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》長春吉林科學(xué)技術(shù)出版社，2002中的方法利用發(fā)明人所在的微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室提取的BALB/c小鼠IgG免疫健康家兔，制備高特異性、高效價(jià)的兔抗鼠IgG高免血清，對(duì)高免血清采用飽和硫酸銨沉淀法進(jìn)行粗提，經(jīng)G-200過柱后得到高純度的兔抗鼠IgG抗體。利用該抗體可作為質(zhì)控線。實(shí)施例5包被檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的制備1、包被緩沖液的配制0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)為包被緩沖液，0.22MJ莫濾過,置4'C備用，有效期一周;1000ml0.01MpH7.2PBS緩沖液配方NaCl8g，KC10.2g，Na2HP0412H202.9g,KH2P040.2g,雙蒸去離子水定容至1000ml。2、包被檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的制備用包被緩沖液將11B6稀釋到lmg/ml，調(diào)整機(jī)器，劃線為T線，即為纟企測(cè)線，T線靠近金標(biāo)墊端，距金標(biāo)墊端約5mm;用包被緩沖液將兔抗鼠IgG抗體稀釋到0.5mg/ml，調(diào)整機(jī)器，劃線為C線，即為質(zhì)控線，C線靠近吸收墊，距吸收墊約3mm。兩線距離5~8mm,線應(yīng)細(xì)致、均勻。37€烘干，封裝備用。實(shí)施例6膠體金、金標(biāo)記單克隆抗體的制備1、溶液的配制(1)1%氯金酸的配制用雙蒸去離子水溶解氯金酸，配成1%溶液，置4。C備用，有效期四個(gè)月。1000mir/。氯金酸溶液配方10g氯金酸；雙蒸去離子水定容至1000ml。(2)檸檬酸三鈉的配制用雙蒸去離子水溶解柙檬酸三鈉，配成1%溶液，0.224膜濾過，置4。C備用，定容至1000ml。(3)0.1MK2C03的配制用雙蒸去離子水配制，0.22^膜濾過,置4'C備用，有效期四個(gè)月。1000ml0.1MK2C03溶液配方13.8gK2C03,雙蒸去離子水定容至1000ml。(4)5%牛血清白蛋白(BSA)的配制用雙蒸去離子水配制，0.22(^膜濾過，置4。C備用，有效期四個(gè)月。100ml5。/。BSA溶液配方5gBSA;雙蒸去離子水定容至100ml。(5)硼酸緩沖液的配制2mM的硼酸，0.2%的PEG-20000，0.02°/。的疊氮鈉(NaN3)。1000ml硼酸緩沖液的配方為:0.124g硼酸,2gPEG-20000，0.2g歸3,0.22(1膜濾過，用雙蒸去離子水定容至1000ml。2、膠體金的制備用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%，置加熱磁力攪拌器上加熱攪拌煮沸，按每100ml0.01%氯金酸加入2ml1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足失水。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期一周。3、膠體金標(biāo)記單克隆抗體的制備用0.1MK2C03調(diào)膠體金的pH值至8.2，按8)Lig抗體/ml膠體金加入單克隆抗體14A3，磁力攪拌器混勻30min，攪拌下加入BSA至終濃度為1%,靜置1小時(shí)。8600rpm、4。C離心45min,棄上清，沉淀用硼酸緩沖液重懸，然后用12000rpm、4。C離心30min,棄上清，沉淀重復(fù)上述離心一次，最后用十分之一初始膠體金體積的硼酸緩沖液將沉淀重懸，置4。C備用，有效期一周。實(shí)施例7涂覆膠體金標(biāo)記的單克隆抗體14A3的金標(biāo)墊的制備1、封閉液的配制2%BSA,2%聚乙烯吡咯烷酮K-30(PVP-K30)、0.05%NaN3,0.01MPH7.2PBS溶液，0.22卿^f鼓孔濾膜濾過，置4。C備用，有效期四個(gè)月。1000ml封閉液配方20gBSA，0.5gNaN3、20gPVP-K30、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2、涂覆膠體金標(biāo)記的單克隆抗體14A3的金標(biāo)墊的制備將金標(biāo)墊浸泡于封閉液中30min后，于37。C烘千。將實(shí)施例4中濃縮好的標(biāo)記抗體的膠體金溶液用硼酸緩沖液稀釋，比例為1:4.5。然后將制備好的標(biāo)記抗體的膠體金溶液均勻的鋪在金標(biāo)墊上，每毫升溶液鋪20平方厘米，冷凍干燥，封裝，置4。C備用。實(shí)施例8試紙條樣品墊的制備1、封閉液的配制2%BSA,2%PVP-K30、0.05%NaN3，0.01MpH7.4PBS溶液，0.22卿微孔濾膜濾過，置4。C備用，有效期四個(gè)月。1000ml封閉液配方20gBSA，0.5gNaN3、20gPVP-K30、8gNaCl、2.9gNa2HP04.12H20、0.2gKCl、0.2gKH2P04:容液定容至1QGGml。2、樣品墊的制備將樣品墊浸泡于封閉液中30min后，于37。C烘干，封裝，置4'C備用。實(shí)施例9試紙條的組裝將包被檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜、涂覆膠體金標(biāo)記的單克隆抗體14A3的金標(biāo)墊、吸收墊、樣品墊按圖l依次粘附在不吸水的支撐薄片上組裝而成，且在樣品墊上設(shè)有一加樣孔，切成3隱寬的小條。每十小條一包，加入干燥劑，真空封裝。4-8。C保存，有效期一年；常溫保存，有效期6個(gè)月。實(shí)施例10胎膜早破診斷試劑盒的組成1、胎膜早破診斷試劑盒包括(1)、試紙條(2)、樣品稀釋液(3)、棉簽(4)、離心管(5)、吸管2、相關(guān)溶液的配制樣品稀釋液樣品稀釋液為0.85%的NaCl溶液。配制方法8.5gNaCl,加雙蒸去離子水定容至1000ml。本發(fā)明試劑盒的使用方法1、樣品制備用棉簽蘸取陰道或?qū)m頸外口的粘液，然后用約0.5ml的0.85%生理鹽水沖洗并積壓棉簽獲得。2、檢測(cè)取出試劑盒，室溫平衡20分鐘；打開包裝袋，取出試紙條，用吸管吸取已制備好的樣品，然后在試紙條加樣孔中滴加2-3滴即可。3、結(jié)果判定當(dāng)試紙條出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測(cè)線，結(jié)果判為陰性，記為"一"；當(dāng)試紙條出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，同時(shí)也出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測(cè)線，結(jié)果判為陽性，記為"+";檢測(cè)線顏色越深說明被檢測(cè)樣品的羊水含量越高；當(dāng)試紙條沒出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，不管有沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測(cè)線，結(jié)果都判為^r測(cè)試紙條失效，應(yīng)廢棄。實(shí)施例11胎膜早破診斷試劑盒試劑盒的應(yīng)用1、樣品的采集樣品采集的來源地為武漢和裏樊這兩地的多家醫(yī)院。羊水的釆集主要從剖腹產(chǎn)的婦女身上獲得。其它的臨床樣品來自孕婦的陰道粘液、血液及宮頸液等，采集的途徑是用棉簽蘸取陰道或?qū)m頸外口的粘液，然后用約0.5ml的0.85%生理鹽水沖洗并積壓棉簽獲得。2.特異性試驗(yàn)將0.85°/。的生理鹽水、取自正常孕婦陰道粘液的樣品、取自孕婦羊水的樣品、取自正常未懷孕的婦女陰道粘液的樣品分別滴加到試紙條加樣孔。得到的試驗(yàn)結(jié)果為除羊水樣品為陽性外，其它的幾種樣品均為陰性。另外還采集了26份正常的孕婦的血液和尿液，測(cè)試的結(jié)果為<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由此結(jié)果獲知，該試紙條與孕婦的尿液或血液無交叉反應(yīng)。然后取采集到孕婦的羊水150份，用本發(fā)明的試紙條檢測(cè)陽性率為100%。由此獲知該試紙條具有良好的特異性。3、敏感性試驗(yàn)將從孕婦體中采集的羊水樣品倍比稀釋，然后分別滴加到試紙條檢測(cè)得到的結(jié)果為孕婦的羊水可稀釋到16倍。4、胎膜早破試紙條檢測(cè)卡在臨床上的初步應(yīng)用取20份人為制造的胎膜早破病例樣品，然后用本發(fā)明的試紙條檢測(cè)卡檢測(cè)，結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>取22份臨床上診斷為胎膜早破的患者的樣品，用本發(fā)明的試紙條檢測(cè)卡檢測(cè)的結(jié)果為:<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由此初步獲知本發(fā)明的胎膜早破試紙條檢測(cè)卡具有與臨床診斷結(jié)果很高的符合率。權(quán)利要求1、一種用于胎膜早破診斷的試紙條，試紙條水平面自上而下依次為吸收墊、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊，其特征在于硝酸纖維素膜上包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線，其中檢測(cè)線為單克隆抗體11B6，質(zhì)控線為兔抗鼠IgG抗體；金標(biāo)墊上涂覆有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體14A3；再將吸收墊、包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜、涂覆有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體14A3的金標(biāo)墊、樣品墊按自上而下的順序依次粘附在不吸水的支撐薄片上組裝而成，且在樣品墊上設(shè)有一加樣孔。2、根據(jù)權(quán)要求1所述的用于胎膜早破診斷的試紙條，其特征在于所述單克隆抗體11B6和14A3的制備方法(1)用羊水特異性蛋白AMNI-Pr免疫BALB/c小鼠取含150Mg的羊水特異性蛋白A匪I-Pr蛋白溶液與等體積的弗氏完全佐劑乳化后注射小鼠腹腔，21天后，取含15(mg的羊水特異性蛋白A顧I-Pr蛋白溶液與等體積的弗氏不完全佐劑乳化后注射小鼠腹腔，最后于融合前三天或與第一次免疫時(shí)間相隔4周以上，再在BALB/c小鼠的腹腔進(jìn)行強(qiáng)化免疫，抗原量加倍到300Pg，不加佐劑；(2)融合時(shí)，取經(jīng)最后強(qiáng)化免疫的BALB/c小鼠一只，眼眶放血處死，收集陽性血清，在濃度75。/。酒精溶液中浸泡5min消毒，無菌取出小鼠脾臟，分離出脾細(xì)胞，與新鮮制備的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，按1~2x107個(gè)SP2/0與108個(gè)免疫脾細(xì)胞1:10~1:15的比例于50mL離心管中混勾，1500rpm，離心10min,倒掉上清，將裝有細(xì)胞混合物的離心管放于37。C水浴中，然后在lmin內(nèi)慢慢滴入預(yù)溫至37。C的濃度為50%聚乙二醇(PEG)0.8mL，邊加邊用吸管尖攪拌，繼續(xù)攪拌lmin;然后加入37。C預(yù)溫的P腿I-1640基礎(chǔ)液10mL,P腿I-l640購自GIBCO,具體方法為第一分鐘逐滴滴入lmL,第二分鐘加lmL,第3~4分鐘加3mL,第5分鐘加其余的5mL,最后加入30mLPRMI-1640液，800rpm離心5min，去上清，于37。C放置5~8min;用HAT培養(yǎng)基懸??；(3)將用HAT培養(yǎng)基懸浮的細(xì)胞混合物分種于96孔培養(yǎng)板中250147孔，每孔接種量含104個(gè)SP2/G細(xì)胞，于37。C，濃度為5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，融合后的第二天開始觀察有無污染，于第4天補(bǔ)加1滴HAT培養(yǎng)基，第8~10天吸去100ML培養(yǎng)基換HT培養(yǎng)基10(mL,待融合細(xì)胞集落長至培養(yǎng)孔1/4，培養(yǎng)基變黃時(shí)，進(jìn)行抗體檢測(cè)；采用免疫原作為篩選抗原，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法篩選出分泌抗雄NI-Pr的陽性孔；(4)對(duì)篩選出來的陽性孔用有限稀釋法進(jìn)行克隆、篩選，經(jīng)過34次克隆，最終篩選出分泌兩林抗AMNI-Pr的單克隆雜交瘤細(xì)胞，這兩林細(xì)胞編號(hào)為14A3和11B6。3、一種用于胎膜早破診斷的試劑盒，其特征在于將所述的試紙條、樣品稀釋液、棉簽、離心管、吸管放置在同一個(gè)盒中，樣品稀釋液為濃度0.85°/的生理鹽水。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于胎膜早破診斷的試紙條及試劑盒，試紙條水平面自上而下依次為吸水墊、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊，硝酸纖維素膜上包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線，其中檢測(cè)線為單克隆抗體11B6，質(zhì)控線為兔抗鼠IgG抗體；金標(biāo)墊上涂覆有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體14A3；再將吸收墊、包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜、涂覆有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體14A3的金標(biāo)墊、樣品墊按自上而下的順序依次粘附在不吸水的支撐薄片上組裝而成，且在樣品墊上設(shè)有一加樣孔。本發(fā)明的試劑盒中試紙條特異性強(qiáng)，靈敏度高，能夠用于胎膜早破的臨床診斷。該試劑盒操作簡(jiǎn)單，結(jié)果在十分鐘內(nèi)就可判斷出來。文檔編號(hào)G01N33/577GK101216493SQ200810046729公開日2008年7月9日申請(qǐng)日期2008年1月21日優(yōu)先權(quán)日2008年1月21日發(fā)明者王宇波申請(qǐng)人:創(chuàng)源生物科技(武漢)有限公司