專利名稱：：一種檢測(cè)隱性孔雀石綠直接競(jìng)爭(zhēng)elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于食品安全領(lǐng)域中涉及酶聯(lián)免疫和獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種適用于檢測(cè)水產(chǎn)品中隱性孔雀石綠殘留的ELISA試劑盒。
背景技術(shù)：
：孔雀石綠(Malachitegreen)分子式為C23H25C1N2，是一種工業(yè)用三苯甲烷triphenylmehtane類染料，由于具有抗菌及抗格蘭氏陽(yáng)性菌的功效，且價(jià)格便宜，所以被廣泛運(yùn)于養(yǎng)殖漁業(yè)之預(yù)防魚的水霉病、鰓霉病、小瓜蟲病等，而且為了使鱗受損的魚延長(zhǎng)生命，在運(yùn)輸過程中和存放池內(nèi)，也常使用孔雀石綠。當(dāng)養(yǎng)殖水含有孔雀石綠時(shí)，魚體、蝦等會(huì)快速吸收孔雀石綠進(jìn)而代謝成為隱性孔雀石綠(L印comalachitegreen，LMG),即N，N-二甲基苯胺，分子式C23H26N2，隱色孔雀石綠不溶于水，殘留毒性比孔雀石綠更強(qiáng)，可囤積在肌肉中長(zhǎng)達(dá)數(shù)月。近年來有關(guān)此類染料的毒理研究發(fā)現(xiàn)孔雀石綠及其主要代謝物隱性孔雀石綠具有多重毒性，包括致癌性、致基因突變、引起染色體斷裂、致畸胎及呼吸道毒性。鑒于此，許多國(guó)家均將孔雀石綠列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物。因?yàn)樗a(chǎn)品(魚肉、蝦等)具有營(yíng)養(yǎng)齊全、平衡的特點(diǎn)，越來越受到人們的青睞。到1996年，我國(guó)水產(chǎn)品產(chǎn)量已超過2000萬(wàn)噸，占全國(guó)肉類食物生產(chǎn)總量的1/3，躍居世界第一位。隨著人民生活水平的提高，對(duì)水產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量有了更新的要求。然而，我國(guó)漁業(yè)發(fā)展面臨著一系列新的挑戰(zhàn)，其中食品安全問題在一定程度上嚴(yán)重制約了我國(guó)漁業(yè)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，而違法添加孔雀石綠是目前最突出的問題。農(nóng)業(yè)部新聞辦公室發(fā)布了2007年第一次水產(chǎn)品質(zhì)量安全的監(jiān)測(cè)結(jié)果。今年上旬，農(nóng)業(yè)部組織有關(guān)質(zhì)檢機(jī)構(gòu)對(duì)我國(guó)22個(gè)城市水產(chǎn)品中孔雀石綠污染情況進(jìn)行了本年度第一次例行監(jiān)測(cè)，IO個(gè)城市均有樣品檢出了孔雀石綠。由于巨大利益的驅(qū)動(dòng)，很難真正有效的控制杜絕孔雀石綠，這也就意味著對(duì)孔雀石綠檢測(cè)需求是長(zhǎng)期的。目前國(guó)際上對(duì)孔雀石綠和隱性孔雀石綠的檢測(cè)技術(shù)路線主要有兩條一條是以色(質(zhì))譜技術(shù)為核心的化學(xué)檢測(cè)技術(shù)，另一條是快速生物檢測(cè)技術(shù)。高效液相色譜法成本高，操作時(shí)間長(zhǎng)，步驟多且復(fù)雜，因此無(wú)法實(shí)現(xiàn)真正意義上的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。而ELISA檢測(cè)法靈敏度高、快速特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便、分析結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，容易被基層掌握并大面積推廣，適合于大批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，適合我國(guó)當(dāng)前社會(huì)經(jīng)濟(jì)技術(shù)水平，因此是未來孔雀石綠檢測(cè)的主要發(fā)展方向。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種采用ELISA直接競(jìng)爭(zhēng)法快速檢測(cè)隱性孔雀石綠殘留的試劑。本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)隱性孔雀石綠殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒包括隱性孔雀石綠多克隆抗體或單克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的隱性孔雀石綠。所述的隱性孔雀石綠多克隆抗體或單克隆抗體為隱性孔雀石綠半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原通過免疫動(dòng)物(例如兔、鼠)制得。所述的隱性孔雀石綠半抗原是采用化學(xué)方法使其含有活性基團(tuán)，所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白或鑰孔銅蘭蛋白(KLH)。所述的隱性孔雀石綠-載體蛋白偶聯(lián)物采用混合酸酐法、活潑酯法或碳二亞胺法偶聯(lián)得到。所述標(biāo)記隱性孔雀石綠的酶可以用商品化的辣根過氧化物酶，通過混合酸酐法、活潑酯法或碳二亞胺法將辣根過氧化物酶與隱性孔雀石綠偶聯(lián)制得。用于制備所述酶標(biāo)板的固相材料，包括但不限于，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等。為方便現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大量樣本篩査，所述試劑盒還可以進(jìn)一步包括真空包裝可拆96孔酶標(biāo)板、系列標(biāo)準(zhǔn)液、酶標(biāo)抗原、顯色液A和B、20x濃縮洗滌液、樣品稀釋液和終止液。所述的20x濃縮洗滌液為含1.0%吐溫-20的0.2mol/L磷酸緩沖液，顯色液由顯色液A和顯色液B組成，顯色液A為加入過氧化氫或過氧化脲的溶液，顯色液B為加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的溶液，樣品稀釋液為0.05。/。吐溫-20的0.01mol/L磷酸緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)液為精確稱量10mg，先用二甲基甲酰胺0.1mL溶解，然后用lxPBS緩沖液稀釋到10mL，用lxPBS緩沖液配制系列濃度為O，0.1，0.3，1.0，3.0，9.0ng/mL的隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液。另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)水產(chǎn)品中隱性孔雀石綠殘留量的方法，包括步驟(l)樣品前處理取5g樣品(魚肉/蝦)絞碎置入50mL離心管中，加入10mL乙酸乙酯均質(zhì)，以4000g離心5分鐘，取5mL上清液置入玻璃管中，于60'C下以氮?dú)獯蹈桑诖瞬ＡЧ苤屑尤雔mL正己烷和lmL蒸餾水，振蕩混勻2分鐘，室溫4000g離心10分鐘，取100nL下層液，經(jīng)樣品稀釋液稀釋5倍，待測(cè)。P)用權(quán)利要求1所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)向包被有隱性孔雀石綠多克隆抗體或單克隆抗體的微孔酶標(biāo)板中加入標(biāo)準(zhǔn)品或(l)中所得的樣品待測(cè)液50pL/孔，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的隱色孔雀石綠溶液50^iL/孔；輕微震蕩30秒后于37'C下孵育30分鐘；加入洗液300^17孔，洗滌5次后拍干；將顯色液A和B以1:l混合，輕輕震蕩混勻，每孔加入混合后的顯色液100pL，室溫下避光顯色15分鐘；每孔加入終止液50pL，輕輕震蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔的OD值。(3)檢測(cè)結(jié)果分析計(jì)算百分吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品中隱性孔雀石綠的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出，也可以用回歸方程法計(jì)算出在樣本中隱性孔雀石綠的含量。利用專業(yè)電腦軟件更便于大量的樣本的快速分析。根據(jù)酶標(biāo)板上的樣本顏色的深淺與系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色的比較，可以判斷出樣品中隱性孔雀石綠的濃度范圍。有益效果本發(fā)明的檢測(cè)隱性孔雀石綠的試劑盒，采用直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫測(cè)定法、定量檢測(cè)樣品中隱性孔雀石綠殘留量；對(duì)樣品的前處理要求低、處理過程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品。本發(fā)明中試劑盒采用隱性孔雀石綠多克隆抗體或單克隆抗體包被的微孔酶標(biāo)板，主要試劑以工作液形式提供，試劑盒的操作步驟簡(jiǎn)單，為使用者節(jié)省時(shí)間并降低因操作步驟冗繁造成的誤差，本發(fā)明具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高精確度、高準(zhǔn)確度、對(duì)儀器設(shè)備要求低、試劑保存時(shí)間長(zhǎng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)放射性同位素污染的等優(yōu)點(diǎn)，可在水產(chǎn)品檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。圖1為隱性孔雀石綠酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒結(jié)構(gòu)圖圖2為BSA-半抗原的偶聯(lián)物(免疫原)的紫外掃描圖圖3為隱性孔雀石綠(單抗)標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線圖4為隱性孔雀石綠(多抗)標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線具體實(shí)施提供下述實(shí)施例是為了更好地進(jìn)一步理解本發(fā)明，而決不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。實(shí)施例l半抗原及完全抗原(免疫原)合成1.1試劑與儀器隱性孔雀石綠(北京化學(xué)試劑有限公司)，牛血清白蛋白(BSA)、鑰孔銅蘭蛋白(KLH)等(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)，所用試劑均為化學(xué)純或分析純。Yanco顯微熔點(diǎn)儀(溫度計(jì)未校正)；BrukerAMX-300核磁共振儀(IMS為內(nèi)標(biāo)，CDC13為溶劑)。雙光束紫外可見分光光度儀(TM-1909,北京普析通用儀器有限公司)，磁力攪拌器(上海東榮豐科學(xué)儀器有限公司)，臺(tái)式離心機(jī)(Minispin最大轉(zhuǎn)速13400rpm，最大離心力12100rcf，2mLxl2)，ZS-2自動(dòng)板式酶標(biāo)儀(北京新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司)，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠)，電熱恒溫水浴鍋(北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)，0.5-10pL、5-50pL、20-200pL、lOO-lOOOpL單通道連續(xù)可調(diào)移液槍(上海儀器有限公司)。1.2半抗原的合成1.2.1實(shí)驗(yàn)步驟'11,H1.2.2對(duì)隱性孔雀石綠乙酮的制備在100mL三頸瓶中加入20mL二氯甲垸，18g(0.135mol)無(wú)水三氯化鋁。冰鹽浴冷卻至-l(TC，滴加7.1g(0.07mol)醋酐和21.61g(0.065mo1)隱性孔雀石綠的混合液，控制內(nèi)溫不超過-5'C。滴加完畢后，繼續(xù)攪拌15h，溶液從黃色變成暗紅色。將反應(yīng)液傾入50mL濃鹽酸和50g碎冰的混合物中，然后用分液漏斗分出水層，并用二氯甲烷萃取兩次。合并有機(jī)相，用水洗至中性，無(wú)水硫酸鈉干燥。蒸餾除去溶劑得黃色油狀物9.8g。粗品可直接用于溴仿反應(yīng)。1.2.3對(duì)隱性孔雀石綠甲酸的制備氫氧化鈉6.3g溶于54mL水中，冷卻至-5。C。滴加溴6.4g(0.04mol)，控制內(nèi)溫不超過0°C。然后將對(duì)隱性孔雀石綠乙酮粗品5.04g滴加至反應(yīng)液中，控制內(nèi)溫不超過1(TC。滴加完畢，保溫lh，然后于室溫?cái)嚢?h。靜置分層，分去生成的溴仿。水層用濃鹽酸調(diào)至pH12，析出白色固體。抽濾，水洗至中性。將固體溶于20mL氫氧化鈉溶液(5X)中，過濾，淺黃色澄清液體用濃鹽酸調(diào)至pHl~2，析出白色晶體。抽濾，水洗至中性，烘干，得白色晶體1.7g，收率81X(按隱性孔雀石綠計(jì))。m.p.117~120°C。HNMR(300MHz，CDC13)，S:1.28(d，6H，J=6.9Hz);2.99(m，1H，J=6.9Hz);7.33(d，2H，J=8.3Hz);8.05(d，2H，J=8.3Hz)。1.3免疫原的合成活潑酯法制備免疫原是這樣實(shí)現(xiàn)的取等摩爾量的隱性孔雀石綠半抗原和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),環(huán)二己基碳二亞胺(DCC)，用二甲基甲酰胺(DFM)將混合物溶解，室溫下避光反應(yīng)過夜，離心去處沉淀后，取上清液干燥，取其225nL加入含250mgBSA的8mL碳酸鹽緩沖液(Ph9.6含5%甲醇)中，混合物在4"C下磁力攪拌2小時(shí)，在4'C條件下透析過夜4次(pH7.4的磷酸鹽緩沖液)，經(jīng)紫外掃描儀進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描鑒定偶聯(lián)結(jié)果。圖2為釆用活潑酯法制備的BSA-半抗原的偶聯(lián)物(免疫原)的紫外掃描圖，圖中三種物質(zhì)由上到下分別是載體蛋白BSA、載體蛋白BSA-半抗原的偶聯(lián)物、半抗原的紫外吸收?qǐng)D譜，從圖中可看出載體蛋白BSA特征吸收峰在278nm處，半抗原特征吸收峰在260nrn處，載體蛋白BSA-半抗原的偶聯(lián)物特征吸收峰在255nm處，偶聯(lián)物特征峰發(fā)生漂移。實(shí)施例2抗體的制備及效價(jià)檢測(cè)2.1抗體的制備多抗制備選取3只體重22.5kg健康雄性新西蘭大白兔，以BSA-半抗原為免疫原與等量弗氏完全佐劑通過注射器對(duì)抽法混合成油包水的乳濁液，按lmg/kg體重的量進(jìn)行首次免疫，采取背部皮下多點(diǎn)注射。每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，劑量及方法同首次免疫。從第三次免疫開始，每次免疫后10天，耳緣靜脈取血lmL，進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)，當(dāng)抗體效價(jià)不再升高時(shí)，不加佐劑進(jìn)行最后一次(第7次)免疫，大腿肌肉注射，7天后頸動(dòng)脈放血，室溫凝固2h后4。C過夜，8000r/min離心10分鐘，除去血塊，血清部分用50%飽和硫酸銨溶液沉淀，離心去上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，再用33%飽和硫酸銨溶液沉淀兩次，沉淀物用盡可能少的磷酸緩沖液溶解，經(jīng)透析得隱性孔雀石綠多克隆抗體。單抗制備以BSA-半抗原為免疫原，免疫4只BALB/C小鼠，每只小鼠取100pg免疫原，與等體積弗氏完全佐劑混合乳化均勻，沿腹股溝注入腹腔膜內(nèi)。4個(gè)周后，加強(qiáng)免疫，劑量不變，佐劑改為弗氏不完全佐劑。加強(qiáng)免疫三次后，采血測(cè)效價(jià)，待血清效價(jià)不再上升，用兩倍劑量的抗原不加佐劑免疫小鼠，三天后在無(wú)菌條件下取脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞按5-10:1的比例混合于50mL離心管，加入30mL無(wú)血清IPMI1640培養(yǎng)基，1200r/min離心10min棄上清，將細(xì)胞團(tuán)輕輕振松，置于37-C水浴中。把lmL50。/。PEG-4000緩緩加入細(xì)胞中，在lmin內(nèi)滴完，同時(shí)輕輕攪動(dòng)底部沉淀，靜置lmin。沿管壁緩慢加入無(wú)血清培養(yǎng)基終止融合過程。前30秒緩慢勻速加入lmL后30秒加入2mL，然后快速加入27mL無(wú)血清培養(yǎng)基，1200r/min離心10min，棄上清。融合后的細(xì)胞先在HAT選擇性培養(yǎng)液中篩選，5天后換成HT培養(yǎng)液，待孔內(nèi)的雜交細(xì)胞數(shù)量達(dá)到300個(gè)以上時(shí)，用ELISA對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行復(fù)孔檢測(cè)，次日重復(fù)檢測(cè)已確定結(jié)果。將強(qiáng)陽(yáng)性孔內(nèi)的細(xì)胞用有限稀釋法進(jìn)行克隆培養(yǎng)，并跟蹤記錄，經(jīng)3次以上的克隆培養(yǎng)和檢測(cè)，均呈陽(yáng)性的孔內(nèi)細(xì)胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。將雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，選4只經(jīng)產(chǎn)BALB/C小鼠，腹腔注射液體石蠟油0.5mL/只，7天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5乂105-106/只，IO天后，待小鼠腹部明顯膨大時(shí)收集腹水。用正辛酸-硫酸銨沉淀法來純化腹水，經(jīng)核酸蛋白紫外掃描儀蛋白分析初步判斷得到的蛋白為IgG蛋白。2.2檢測(cè)抗體效價(jià)以lpg/mL濃度按每孔100pL包被酶標(biāo)板，4'C包被過夜，洗滌5次，拍干，按每孔200pL封閉液4。C下封閉12h，洗滌3次，拍干。按每孔10(HiL加入抗血清稀釋倍數(shù)為2000、10000、250000、50000、250000、1250000，陰性血清及空白(不加抗血清，只加其稀釋液)室溫作用30min，洗滌五次，拍干。加入每孔10(HiL酶標(biāo)羊抗兔(鼠)抗體，室溫作用30min，洗滌五次，拍干。加入每孔100nL顯色液，37i:避光作用15min。加入每孔50pL終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)A值(450nm)。以兩倍于陰性血清OD值血清OD值對(duì)應(yīng)的抗血清稀釋度為抗血清效價(jià)。檢測(cè)結(jié)果見表l:表1-1多克隆抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從表1-1的數(shù)據(jù)可以推斷本發(fā)明制備的多克隆抗體的效價(jià)達(dá)50000。表1-2單克隆抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從表1-2的數(shù)據(jù)可以推斷本發(fā)明制備的單克隆抗體的效價(jià)達(dá)15000。實(shí)施例3酶標(biāo)抗原的制備活潑酯法制備酶標(biāo)抗原是這樣實(shí)現(xiàn)的取10mol的隱性孔雀石綠半抗原、1(^molN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和lOnmol環(huán)二己基碳二亞胺(DCC)，用lmL二甲基甲酰胺(DFM)將混合物溶解，室溫下避光反應(yīng)過夜，離心去處沉淀后，取上清液干燥，將其加入含200mg辣根過氧化物酶(HRP)的10mL硼酸鹽緩沖液(Ph9.0)中，混合物在4'C下磁力攪拌6小時(shí)，在4'C條件下透析過夜4次(pH7.4的磷酸鹽緩沖液)，通過紫外掃描儀進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描結(jié)果推斷成功偶聯(lián)。實(shí)施例4本發(fā)明試劑盒的建立4.1本發(fā)明試劑盒檢測(cè)原理采用直接競(jìng)爭(zhēng)法，將隱性孔雀石綠多克隆抗體或單克隆抗體包被于微孔酶標(biāo)板，然后將酶標(biāo)板封閉，加入待測(cè)樣本或標(biāo)準(zhǔn)品及酶標(biāo)記隱色孔雀石綠半抗原。樣本中的隱色孔雀石綠或標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)隱色孔雀石綠半抗原競(jìng)爭(zhēng)性的與包被在酶標(biāo)板的抗體反應(yīng)，加入顯色劑后形成肉眼可見的顏色，顏色的深淺與樣本中隱性孔雀石綠的含量成反比，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可定量的讀出樣本中隱性孔雀石綠的含量。4.2本發(fā)明試劑盒組成4.2.1酶標(biāo)板的最佳制備方法用Ph9.6的0.2M碳酸鹽緩沖液作包被稀釋液，將隱性孔雀石綠多克隆抗體稀釋2000x或單克隆抗體稀釋5000x，按100pL/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4。C包被過夜，甩干，按20(HiL/孔加入含1%明膠，pH7.4的磷酸鹽緩沖液37'C封閉2小時(shí)，洗滌甩干，至室溫干燥后裝入包裝袋中抽真空保存。4.2.2工作試劑的配制20x濃縮洗液含1.0%吐溫-20的0.2mol/L磷酸緩沖液(NaCl160.0g，KH2P044g，Na2HP04'12H2058g，KC14g用純水定容至1000mL，pH7.4，再加10mL吐溫-20);樣品稀釋液含0.05%吐溫-20的0.01mol/L磷酸緩沖液(NaCl8g，KH2P040.2g，Na2HP04'12H202.9gKC10.2g用純水定容至lOOOmL，pH7.4，再加0.5mL吐溫-20);顯色液A(TMB20mg，無(wú)水乙醇10mL，加雙蒸水至100mL);顯色液B含Na2HP041.46g，檸檬酸(X933g，0.75%過氧化氫尿素0.64mL,加純水至100mL，調(diào)至pH5.0-5.4(O.lmol/L檸檬酸-0.2mol/L磷酸二氫鈉緩沖液，pH5.0-5.4)，顯色液A和B按1:1混合即成TMB-過氧化氫尿素溶液；終止液為2mol/L硫酸(取濃硫酸4mL加入32mL純凈水中混勻)；隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液為精確稱量LMG10mg，先用二甲基甲酰胺O.lmL溶解，然后用lxPBS緩沖液稀釋到10mL，用"PBS緩沖液配制系列濃度為O，0.1，0.3，1.0，3.0，9.0ng/mL的隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液。4.2.3檢測(cè)孔雀石綠的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測(cè)隱性孔雀石綠的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(直觀圖可見圖l):(1)試劑盒盒體(2)包被有隱性孔雀石綠多克隆抗體或單克隆抗體的酶標(biāo)板(3)隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶濃度分別為Ong/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、1.0ng/mL、3.0ng/mL、9.0ng/mL(4)20x濃縮洗滌液含1.0%吐溫-20的0.2mol/L磷酸緩沖液(5)HRP標(biāo)記的隱性孔雀石綠抗原(6)樣品稀釋液含0.05%吐溫-20的0.01mol/L磷酸緩沖液(7)顯色液A含過氧化脲或過氧化氫(8)顯色液B含四甲基聯(lián)苯胺(9)終止液為2mol/L的硫酸溶液(10)說明書(11)封板膜(12)試劑盒支架實(shí)施例5樣品中隱性孔雀石綠殘留的檢測(cè)(1)樣品前處理取5g樣品(魚肉/蝦)絞碎置入50mL離心管中，加入10mL乙酸乙酯均質(zhì)，以4000g離心5分鐘，取5mL上清液置入玻璃管中，于60'C下以氮?dú)獯蹈?，于此玻璃管中加入lmL正己烷和lmL蒸餾水，振蕩混勻2分鐘，室溫4000g離心10分鐘，取100pL下層液，經(jīng)樣品稀釋液稀釋5倍，待測(cè)。(2)用權(quán)利要求1所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)向包被有隱性孔雀石綠多克隆抗體或單克隆抗體的微孔酶標(biāo)板中加入標(biāo)準(zhǔn)品或(l)中所得的樣品待測(cè)液50pL/孔，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的隱色孔雀石綠溶液5(HiL/孔；輕微震蕩30秒后于37'C下孵育30分鐘；加入洗液300pL/孔，洗滌5次后拍干；將顯色液A和B以1:l混合，輕輕震蕩混勻，每孔加入混合后的顯色液100pL，室溫下避光顯色15分鐘；每孔加入終止液50nL，輕輕震蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔的OD值。(3)檢測(cè)結(jié)果分析計(jì)算百分吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品中隱性孔雀石綠的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出，也可以用回歸方程法計(jì)算出在樣本中隱性孔雀石綠的含量。利用專業(yè)電腦軟件更便于大量的樣本的快速分析。根據(jù)酶標(biāo)板上的樣本顏色的深淺與系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色的比較，可以判斷出樣本中隱性孔雀石綠的濃度范圍。實(shí)施例6試劑盒精密度試驗(yàn)按照本試劑盒的操作說明測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)5孔，以濃度的抑制率計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果見表2:表2-1本發(fā)明采用單克隆抗體的試劑盒精密度<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2-2本發(fā)明采用多克隆抗體的試劑盒精密度<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒的板內(nèi)變異系數(shù)〈5%,板內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，精密度高。實(shí)施例7本發(fā)明試劑盒的特異性試驗(yàn)以交叉反應(yīng)率為指標(biāo)判定試劑盒的特異性，將隱性孔雀石綠與孔雀石綠、隱性結(jié)晶紫、結(jié)晶紫、克倫特羅、磺胺二甲嘧啶、氯霉素、呋喃唑酮等配成不同的濃度，用試劑盒分別測(cè)定IC5Q值，每個(gè)藥物重復(fù)3孔，計(jì)算其交叉反應(yīng)率。見表3:交叉反應(yīng)率(％)=50°/。抑制濃度(LMG)/50%抑制濃度(其他藥物)X100%表3-l本發(fā)明采用單克隆抗體的試劑盒特異性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表3-2本發(fā)明采用多克隆抗體的試劑盒特異性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例8試劑盒的準(zhǔn)確度試驗(yàn)將配制好的隱性孔雀石綠母液(lmg/mL)稀釋成100ng/mL，分別添加到5g魚肉和蟲下肉中使其終濃度為0.5ng/g、1.5ng/g、4.5ng/g，隨機(jī)選5個(gè)批次，每個(gè)批次3個(gè)濃度，每個(gè)濃度重復(fù)3次，按照試劑盒的測(cè)定程序，測(cè)定魚肉中隱性孔雀石綠濃度，并計(jì)算回收率和變異系數(shù)。見表1:回收率(％)-實(shí)測(cè)濃度條加濃度乂100%表4-1本發(fā)明試劑盒釆用單克隆抗體的準(zhǔn)確度和重復(fù)性<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權(quán)利要求1.一種檢測(cè)隱性孔雀石綠的酶聯(lián)免疫試劑盒，其中包括隱性孔雀石綠多克隆抗體或單克隆抗體包被的微孔酶標(biāo)板、隱性孔雀石綠系列標(biāo)準(zhǔn)液、酶標(biāo)抗原、顯色液A和B、20×濃縮洗滌液、樣品稀釋液和終止液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酵聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于隱性孔雀石綠半抗原及完全抗原(免疫原)的合成。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的隱性孔雀石綠多克隆抗體為隱性孔雀石綠完全抗原(免疫原)免疫新西蘭大白兔的純化抗血清，所述的隱性孔雀石綠單克隆抗體為隱性孔雀石綠完全抗原(免疫原)免疫BALB/C鼠純化的腹水。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)抗原為辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記隱性孔雀石綠半抗原。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的隱性孔雀石綠多克隆抗體或單克隆抗體包被的酶標(biāo)板的最佳制備方法:用pH9.6的0.02M碳酸鹽緩沖液作包被稀釋液，將隱性孔雀石綠多克隆抗體2000X或單克隆抗體稀釋5000X,按100(iL/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4'C包被過夜，甩干，按200^孔加入含1%明膠，pH7.4的磷酸鹽緩沖液37"C封閉2小時(shí)，洗滌甩干，至室溫干燥后裝入包裝袋中抽真空保存。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的20x濃縮洗滌液為含1.0%吐溫-20的0.2mol/L磷酸緩沖液，顯色液由顯色液A和顯色液B組成，顯色液A為加入過氧化氫或過氧化脲的溶液，顯色液B為加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的溶液，樣品稀釋液為0.05W吐溫-20的0.01mol/L磷酸緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)液為精確稱量lOmg,先用二甲基甲酰胺O.lmL溶解，然后用lxPBS緩沖液稀釋到10mL，用lxPBS緩沖液配制系列濃度為0，0.1，0.3，1.0,3.0，9.0ng/mL的隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液。7.—種檢測(cè)樣品中隱性孔雀石綠含量的方法，包括步驟(1)樣品前處理取5g樣品(魚肉/奸)絞碎置入50mL離心管中，加入10mL乙酸乙酯均質(zhì)，以4000g離心5分鐘，取5mL上清液置入玻璃管中，于60'C下以氮?dú)獯蹈?，于此玻璃管中加入lmL正己烷和lmL蒸餾水，振蕩混勻2分鐘，室溫4000g離心10分鐘，取100nL下層液，經(jīng)樣品稀釋液稀釋5倍，待測(cè)。(2)用權(quán)利要求1所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)向包被有隱性孔雀石綠多克隆抗體或單克隆抗體的微孔酶標(biāo)板中加入標(biāo)準(zhǔn)品或(l)中所得的樣品待測(cè)液50jiL/孔，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的隱色孔雀石綠溶液50nL/孔；輕微震蕩30秒后于371c下孵育30分鐘；加入洗液300mL/孔，洗滌5次后拍干；將顯色液a和b以1:l混合，輕輕震蕩混勻，每孔加入混合后的顯色液lOOnL,室溫下避光顯色15分鐘；每孔加入終止液50fiL,輕輕震蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450mn處測(cè)定每孔的OD值。(3)檢測(cè)結(jié)果分析計(jì)算百分吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品中隱性孔雀石綠的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出，也可以用回歸方程法計(jì)算出在樣本中隱性孔雀石綠的含量。利用專業(yè)電腦軟件更便于大量的樣本的快速分析。根據(jù)酶標(biāo)板上的樣本顏色的深淺與系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色的比較，可以判斷出樣品中隱性孔雀石綠的濃度范圍。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測(cè)隱性孔雀石綠直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測(cè)隱性孔雀石綠的酶聯(lián)免疫試劑盒包括隱性孔雀石綠多克隆抗體、隱性孔雀石綠半抗原及完全抗原和酶標(biāo)抗原。本發(fā)明的檢測(cè)孔雀石綠的酶聯(lián)免疫試劑盒靈敏、快速、準(zhǔn)確，主要用于大批樣品的篩查；盒中的主要試劑均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特異性、高靈敏性、高精確性、高準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，可快速檢測(cè)水產(chǎn)品中殘留的隱性孔雀石綠。文檔編號(hào)G01N33/577GK101451999SQ20081005627公開日2009年6月10日申請(qǐng)日期2008年1月16日優(yōu)先權(quán)日2008年1月16日發(fā)明者波張,猛張,楊曉慧,熊勇華,王曉航,石立杰,陳實(shí)平,黃啟明申請(qǐng)人:北京中德大地食品安全技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司