專利名稱：一種牛乳中β-乳球蛋白含量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析檢測乳中蛋白的方法，特別是一種檢測牛乳 中p-乳球蛋白含量的方法。屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
卩-乳球蛋白是一種重要的牛乳清蛋白，占總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的8 %~10%， 20-40mg/ml 。卩-乳球蛋白分子量約為18400D，主要由 162個氨基酸所組成。(3-乳球蛋白的二級結(jié)構(gòu)是由9個反平行的卩-折疊和1個一螺旋的分子所組成。p-乳球蛋白是是嬰兒牛乳過敏癥 的主要致壽文原。這是由于P-乳球蛋白被吸附在腸道黏膜上，產(chǎn)生免 疫反應(yīng)而引起過敏。所以降低(3-乳球蛋白的含量有助于改善嬰兒過 敏。因此準(zhǔn)確檢測出P-乳球蛋白含量有非常重要的意義。目前，尚未有(3 -乳球蛋白含量檢測方法的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。 國內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有GB/T 5413. 1、 2 - 1997嬰幼兒配方食品和乳粉-乳清 蛋白的測定。常用乳球蛋白的檢測方法是分光光度計(jì)法、酶聯(lián)免 疫法和高效液相色語法。免疫酶聯(lián)吸附法靈敏度高，最小檢測限低， 適合于p-乳球蛋白分離純化的全程分析；高效液相色譜法快速準(zhǔn)確， 操作簡便，可實(shí)現(xiàn)p-乳球蛋白初步分離時的同步分析；分光光度法快速簡便，準(zhǔn)確性稍差，適合于純化后具有較高濃度的p-乳球蛋白的在 線分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的 一種牛乳中P -乳球蛋白含量的檢測方法。
鑒于現(xiàn)有技術(shù)中方法的優(yōu)缺點(diǎn)，本專利發(fā)明了將使用毛細(xì)管電泳 儀快速4全測乳p-乳球蛋白含量的方法，而且針對此儀器創(chuàng)造性地試 驗(yàn)了 一系列的使用參數(shù)和專用緩沖液，使得檢測的準(zhǔn)確度和速度都非 常理想，是本發(fā)明的創(chuàng)造性所在。
本發(fā)明是一種檢測P-乳球蛋白含量的檢測方法，其中，包括如 下步驟l)將P-乳球蛋白溶于樣品緩沖液，制備得到多個不同含量 P-乳球蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并對多個溶液分別檢測后得到P-乳球蛋白 含量與檢測結(jié)果之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)對樣品進(jìn)行檢測，并得到檢測 結(jié)果；3)將所述的檢測結(jié)果與所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，得到樣品中P-乳球蛋白的含量；其中，檢測樣品的設(shè)備是高壓毛細(xì)管電泳分析儀。
上述步驟1)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定的方法優(yōu)選如下配制p-乳球 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，在樣品緩沖液中溶解P -乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成分 別為2mg/ml、 lmg/ml 、 0.5mg/ml、 0.25mg/ml、 0. lmg/ml，制備得 到標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻后使用高壓毛細(xì)管電泳分析，得到檢測結(jié)果，即得 到P-乳球蛋白含量與平均校正因子的關(guān)系曲線；其中，所述的檢測 結(jié)果按照如下方法計(jì)算按峰面積計(jì)算出平均校正因子。
上述的標(biāo)準(zhǔn)溶液或待檢測樣品的處理方法為把標(biāo)準(zhǔn)溶液或待檢測樣品裝入離心管中，在2000-6000r/min離心條件下離心5-15min， 將樣品與緩沖液:換照1: 4-20的比例加入凍存管(或其他容器)，并 搖勻，精確提取10-200ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清 洗機(jī)1 ~ 1 Omin, ^吏用毛細(xì)管電泳4義測定。
上述的樣品緩沖液為能夠使蛋白質(zhì)M的緩沖液，優(yōu)選如下緩 沖液
160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩沖液中加40 m mol/L 3-嗎啉代 丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，7 mol/L尿素，處理樣品時 添加5ul/ml的e-巰基乙醇，甲基羥乙基纖維素0. 05%, pH值為8. 5
上述的搖勻步驟采用凝渦混合器。
上述高壓毛細(xì)管電泳分析的使用檢測參數(shù)如下毛細(xì)管電泳檢測 檢測的溫度控制在15 40。C之間，毛細(xì)管柱直徑25~75um、長度 20~ 600 mm， DAD (或紫外光)檢測器，壓力進(jìn)樣(或電動進(jìn)樣)，壓 力為0 lpsi，進(jìn)樣時間為ls 20s,分離溫度為15~40°C，工作電 壓為10-30 kV。
上述的毛細(xì)管柱為石英毛細(xì)管柱，包括涂層和未涂層。 上述的高壓毛細(xì)管電泳分析的檢測時電泳才莫式為區(qū)帶電泳，其電 泳緩沖液為pH2. 0~9. 0，主要成分為無機(jī)鹽緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽、 硼酸或檸檬酸。
上述的檢測結(jié)果的處理方法如下檢測結(jié)果為樣品分離的圖譜， 運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀所帶的分析軟件，積分各峰的面積，計(jì)算出試樣濃 度，再乘稀釋倍數(shù)，即得實(shí)際濃度。
6卩-乳球蛋白是一種重要的牛乳清蛋白，占常乳總蛋白質(zhì)質(zhì)量分
數(shù)的8%~10%， 20-40mg/ml 。毛細(xì)管電泳儀檢測最低濃度能達(dá)到 10-5~10—8mol/L。所以毛細(xì)管電泳儀能檢測出其含量。使用毛細(xì)管電 泳儀開發(fā)檢測P-乳球蛋白含量的方法包括樣品性質(zhì)的了解、分離模 式、建立緩沖體系、優(yōu)化緩沖體系和換分離模式等步驟。開發(fā)出的 方法能應(yīng)用于產(chǎn)品開發(fā)、質(zhì)量控制和分析;f企測領(lǐng)域中。
本發(fā)明主要使用毛細(xì)管電泳儀能準(zhǔn)確測定P -乳球蛋白的含量， 從而應(yīng)用于產(chǎn)品開發(fā)、質(zhì)量控制和分析檢測領(lǐng)域中。
本發(fā)明在在傳統(tǒng)的電泳和色i普的原理的基礎(chǔ)上，使用高壓毛細(xì)管 電泳儀檢測p-乳球蛋白的含量，達(dá)到準(zhǔn)確檢測出乳制品中p-乳球蛋 白的含量。通過試驗(yàn)，最終確定檢測方法的最佳參數(shù)條件。具體如下 檢測|3-乳球蛋白含量的檢測方法，包括樣品前處理、上樣檢測， 還包括校準(zhǔn)讀數(shù)等步驟。毛細(xì)管電泳檢測檢測的溫度控制在15 ~ 40 。C之間，毛細(xì)管柱直徑50~75um、長度20 600 mm的石英毛細(xì)管 柱，DAD (或紫外光)檢測器，壓力進(jìn)樣，壓力為0. 5psi，進(jìn)樣時 間為5s 20s,分離溫度為20~40°C，工作電壓為15-25 kV。
校準(zhǔn)曲線的制定配制P -乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 051mg/ml。搖勻后 使用高壓毛細(xì)管電泳分析，按峰高計(jì)算出平均校正因子。 檢測步驟為
把原料奶樣品裝入15ml的離心管中，在5000r/min離心條件下 離心5min。準(zhǔn)確提取樣品100ul置入凍存管。提取400ul樣品緩沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用旋渦混合器混勻。精確提取
40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清洗機(jī)3min，使用毛細(xì) 管電泳儀測定。
樣品定量讀數(shù):根據(jù)樣品分離的圖譜，運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀所帶的 分析軟件，積分各峰高(或峰面積)，計(jì)算出試樣濃度，再乘稀釋倍 數(shù)，即得實(shí)際濃度。 有益效果
本發(fā)明方法現(xiàn)行回歸方程相關(guān)系數(shù)〉0.98，其線性范圍在 0. 01mg/ml ~ 2mg/ml ，最低檢出線為0. 15ng,最低檢出濃度為 0. 005mg/ml。精確度達(dá)90%以上，柱子回收率達(dá)到90%以上，樣品回
收率達(dá)70%以上。能有"效檢測出樣品中的p-乳球蛋白的含量。
本專利發(fā)明了將使用毛細(xì)管電泳儀快速檢測P -乳球蛋白含量的 方法。毛細(xì)管電泳儀是一類包括電泳、色譜及其交叉內(nèi)容的液相微分 離技術(shù)。它能快速精確檢測出牛奶中的織叚成分、抗生素、添加的功 能性因子、乳清蛋白、免疫球蛋白、酶、糖、添加劑和其他小分子的 含量。該方法操作簡便、準(zhǔn)確，檢測到出結(jié)果時間僅為lh左右。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 一種牛乳中P -乳球蛋白含量的檢測方法
毛細(xì)管電泳溫度控制在"。C,使用直徑為50um、長度為20mm 的石英毛細(xì)管柱，DAD檢測器，進(jìn)樣壓力為0.5psi,進(jìn)樣時間為10s， 工作電壓為15 kV。
校準(zhǔn)曲線的制定利用P-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為2mg/ml、 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml的才示準(zhǔn)溶液。 搖勻后〗吏用高壓毛細(xì)管電泳分析，積分后的峰面積分別為378089、 152088、 72110、 33124、 14112,利用軟件得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸 相關(guān)系數(shù)為0.9917,最低檢出線為0. Olug,最低檢出含量為 0. 01mg/ml，標(biāo)準(zhǔn)樣品回收率達(dá)90%。
處理樣品緩沖液配置方法160 m mol/L三甲基氨基曱烷緩沖 液中加40 m mol/L 3-嗎啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二 鈉，6mol/L尿素，處理樣品時添加5ul/ml的e-巰基乙醇，曱基羥 乙基纖維素0. 05%,使用氫氧化鈉溶液把pH值調(diào)至8. 5。
電泳緩沖液的配置方法0. 32 mol/L檸檬酸，20 m mol/L檸檬 酸三鈉，7 mol/L尿素，羥丙基曱基纖維素0. 05%。
檢測步驟為把奶樣品加入15ml的離心管中，在5000r/min 離心條件下離心10min。準(zhǔn)確提取樣品100ul置入凍存管(或其他 容器)。提取400ul樣品緩沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用 旋渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超 聲波清洗機(jī)3m i n ，之后使用毛細(xì)管電泳儀測定。
樣品定量讀數(shù):根據(jù)樣品分離的圖譜，運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀所帶的 分析軟件，積分P -乳球蛋白的峰面積為478090,利用分析軟件自動 套入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程內(nèi)計(jì)算出試樣濃度為2. 7mg/ml,再乘稀釋倍數(shù)5, 即得實(shí)際濃度為13. 5mg/ml，所以該奶樣含有的P -乳球蛋白濃度為 13. 5g/L。
實(shí)施例2 —種牛乳中P -乳球蛋白含量的檢測方法毛細(xì)管電泳溫度控制在30。C,使用直徑為75um、長度為600 mm 的石英毛細(xì)管柱，DAD檢測器，進(jìn)樣壓力為0. 5psi,進(jìn)樣時間為5s, 工作電壓為25 kV。
校準(zhǔn)曲線的制定利用p-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為2 mg/ml、 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。搖 勻后使用高壓毛細(xì)管電泳分析，積分后的峰面積分別為，393142、 178563、 87892、 43728、 21157,利用軟件得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸 相關(guān)系數(shù)為0.998，最低檢出線為O.Olug,最低檢出含量為 0. Olmg/ml,標(biāo)準(zhǔn)樣品回收率達(dá)95%。
處理樣品緩沖液配置方法160 m mol/L三甲基氨基曱烷緩沖 液中加40 m mol/L 3-嗎啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸，6 mol/L尿素，處理樣品時添加5ul/ml的P-巰基乙醇，曱基羥乙基纖 維素0. 4%。使用0. 1M氫氧化鈉調(diào)至pH值為8. 5。
電泳緩沖液的配置方法0. 32 mol/L檸檬酸，20 m mol/L檸檬 酸三鈉，6 mol/L尿素，羥丙基曱基纖維素O. 4%。
檢測步驟為把奶樣品加入15ml的離心管中，在5000r/min 離心條件下離心5min。準(zhǔn)確提取樣品100ul置入凍存管(或其他容 器)。提取400ul樣品緩沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用漩 渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲 波清洗機(jī)3min，之后使用毛細(xì)管電泳儀測定。
樣品定量讀數(shù):根據(jù)樣品分離的圖譜，運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀所帶的 分析軟件，積分P -乳球蛋白的峰面積為514202,利用分析軟件自動套入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程內(nèi)計(jì)算出試樣濃度為2. 6mg/ml，再乘稀釋倍數(shù)5, 即得實(shí)際濃度為13mg/ml,所以該奶樣含有的P-乳球蛋白濃度為 13g/L。
權(quán)利要求
1.一種檢測β-乳球蛋白含量的檢測方法，其特征在于包括如下步驟1)將β-乳球蛋白溶于樣品緩沖液，制備得到多個(優(yōu)選6-10個)不同含量β-乳球蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并對多個溶液分別檢測后得到β-乳球蛋白含量與檢測結(jié)果之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)對樣品進(jìn)行檢測，并得到檢測結(jié)果；3)將所述的檢測結(jié)果與所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，得到樣品中β-乳球蛋白的含量；其中檢測樣品的設(shè)備是高壓毛細(xì)管電泳分析儀。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述步驟l)中 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定的方法優(yōu)選如下配制|3-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液， 在樣品緩沖液中溶解P -乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成分別為 2mg/ml、 lmg/ml 、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml，制備得到 標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻后使用高壓毛細(xì)管電泳分析，得到檢測結(jié)果，即 得到p-乳球蛋白含量與平均校正因子的關(guān)系曲線；其中，所述 的檢測結(jié)果按照如下方法計(jì)算按峰面積計(jì)算出平均校正因子。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于把標(biāo)準(zhǔn)溶液或 待檢測樣品裝入離心管中，在2000-6000r/min離心條件下離心 5-15min，將樣品與緩沖液按照1: 4-20的比例加入凍存管(或 其他容器)，并搖勻，精確提取10-200ul處理樣品加入樣品管中， 放置于超聲波清洗機(jī)1 ~ 10min,使用毛細(xì)管電泳儀測定。
4. 如權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述的樣品緩沖液為能夠使蛋白質(zhì)分散的緩沖液，優(yōu)選如下緩沖液 160 ra mol/L三曱基氨基曱烷緩沖液中加40 m mol/L 3-嗎啉代 丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，7mol/L尿素，處理樣 品時添加5ul/ml的e-巰基乙醇，曱基羥乙基纖維素0. 05%， pH值為8.5。
5. 如權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于所述的搖勻步驟采 用旋渦混合器。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于所述高壓毛細(xì) 管電泳分析的使用檢測參數(shù)如下毛細(xì)管電泳檢測檢測的溫度為 15 ~ 40°C ,毛細(xì)管柱直徑25 ~ 75 u m、長度20 ~ 600 mm, DAD (或 紫外光)檢測器，壓力進(jìn)樣，壓力為0 lpsi,進(jìn)樣時間為ls~ 20s，分離溫度為15~40°C,工作電壓為7~30 kV。
7. 如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于所述的毛細(xì)管柱為 石英毛細(xì)管柱，包括涂層和未涂層。
8. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于所述的高壓毛 細(xì)管電泳分析的檢測時電泳模式為區(qū)帶電泳，其電泳緩沖液為 pH2. 0-9. 0,主要成分為無機(jī)鹽緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽、硼酸或 檸檬酸。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2中所述的檢測方法，其特征在于所述的檢測結(jié) 果的處理方法如下檢測結(jié)果為樣品分離的圖譜，運(yùn)用毛細(xì)管電 泳儀所帶的分析軟件，積分各峰的面積，計(jì)算出試樣濃度,再乘稀 釋倍數(shù)，即得實(shí)際濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測乳中成分的方法，特別是一種檢測β-乳球蛋白含量的檢測方法。屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明毛細(xì)管電泳儀檢測β-乳球蛋白含量的檢測方法，包括樣品前處理、上樣檢測，還包括校準(zhǔn)讀數(shù)，編輯報告等步驟。本發(fā)明是樣品在毛細(xì)管電泳儀上跑電泳，從而毛細(xì)管色譜系統(tǒng)檢測出樣品的吸光值，以圖譜的形式表達(dá)出來，從而能準(zhǔn)確檢測出β-乳球蛋白的含量，為產(chǎn)品研發(fā)、質(zhì)量控制和分析成分提供技術(shù)支持。
文檔編號G01N27/447GK101294931SQ200810126799
公開日2008年10月29日 申請日期2008年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月24日
發(fā)明者劉衛(wèi)星, 孫國慶, 康小紅, 胡新宇 申請人:內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司