專利名稱：一種amacr自身抗體的檢測方法及在前列腺癌診斷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種AMACR自身抗體的檢測方法及在前列腺癌診斷中的應(yīng)用，本發(fā)明涉 及體外免疫檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，美國男性每年有179， OOO人被診斷為前列腺癌，死亡率大 約是25%。我國每年新增前列腺癌的病例為70， 000-80, 000人。晚期前列腺 癌的死亡率很高，但如果發(fā)現(xiàn)得早，前列腺癌病人可以獲得很高的五年生存率。 因而，對前列腺癌的早期診斷十分重要。傳統(tǒng)前列腺癌的診斷依靠病理學(xué)檢査， 需取活體組織，給病人帶來痛苦和不便。PSA (前列腺特異性抗原)是僅發(fā)現(xiàn)于 男性前列腺的一種蛋白酶。目前，血液中PSA濃度作為前列腺癌的重要指標(biāo)。 但是它的靈敏度和特異性都很低，不能作為大規(guī)模診斷普查之用。所以，新的 腫瘤標(biāo)志物的研究一直是腫瘤研究的重要領(lǐng)域。[參考文獻(xiàn)馬樂、吳小晶、冉 ??；前列腺癌腫瘤標(biāo)記物研究的歷史、現(xiàn)狀和發(fā)展，中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志2001年 7月第24巻第四期]
AMACR ((x-甲基?；o酶A消旋酶)是最新研究發(fā)現(xiàn)的一種消旋酶，在前 列腺癌組織中表達(dá)水平顯著高于正常人，可以作為早期前列腺癌病變的診斷指 標(biāo)。AMACR的優(yōu)點在于它是癌癥特異性，只存在于癌癥組織。AMACR亦可用 作其他癌癥，例如結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤和黑 素瘤等等的診斷標(biāo)志物。以結(jié)腸直腸癌和前列腺癌表達(dá)最高。但是AMACR在血 液中的濃度太低，不適合單獨作前列腺癌標(biāo)記物。最新的臨床研究表明，AMACR 引起血液中抗AMACR抗體的增加，前列腺癌病人血樣中產(chǎn)生明顯的抗AMACR 自身抗體。如檢測血液中抗AMACR抗體，檢出前列腺癌的靈敏度是77%，特異 性是80M(pO.001)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)強于PSA作為前列腺癌的檢測指標(biāo)。[參考文獻(xiàn)Journal of the National Cancer Institute, Vol. 96, No. 11， June 2， 2004]

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過間接ELISA法檢測人體內(nèi)AMACR自身抗體來提供 一種高靈敏、可大規(guī)模檢查前列腺癌的方法。
本發(fā)明所說的AMACR自身抗體的檢測是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的 一種a-甲基?；o酶A消旋酶AMACR自身抗體的檢測方法 A、試劑的配制
(1) 0.05M、 pH9.6包被緩沖液1.59gNa2C03 、 2,93gNaHC03，加超純
水定容至lOOOmL;
(2) 0.15M、 pH7.4磷酸鹽緩沖液PBS: 8.0g NaCl、 0.2g KCl、 2.9g Na2HP04'12H20和0.2g KH2P04，調(diào)pH至7.4后加超純水定容至lOOOmL;
(3) 0.15M, pH7.4磷酸鹽-吐溫緩沖液PBST: 8.0g NaCl、 0.2gKCl、 2.9g Na2HP04'12H20、 0.2g KH2P04和0.5mL Tween-20，調(diào)pH至7.4后加超純水定容 至lOOOmL;
(4) 封閉液1.0g明膠溶于100mL0.15M、 pH7.4磷酸鹽緩沖液PBS中；
(5) 0.05M、 pH5.6底物緩沖液39.8gNa2HP04'12H20、 6.3g檸檬酸，加 超純水定容至lOOOmL;
(6) 顯色液10mLpH5.6底物緩沖液、O.lmL 1%四甲基聯(lián)苯胺(10mg四 甲基聯(lián)苯胺溶于lmL二甲基亞砜)和32^iL0.75XH202，混合均勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；
(7) 終止液2MH2S04;
(8) 陽性對照血清取篩出的陽性血清OD45(^0.500，按每mL血清加1000 單位青霉素和IOOO單位鏈霉素，無菌過濾；
(9) 陰性對照血清取正常男性血清OD45()^).100，按每mL血清加lOOO 單位青霉素和1000單位鏈霉素，無菌過濾；
所述的試劑的配制可按照實際需要按比例來配制； B、 AMACR自身抗體ELISA檢測方法
(1) 包被用包被緩沖液將特異性抗原AMACR稀釋至0.1 l(Vg/mL， 在微孔反應(yīng)板中每孔加入50pL, 37'C水浴中反應(yīng)2h或4X:冰箱過夜，倒凈，以 洗滌緩沖液磷酸鹽-吐溫緩沖液PBST洗滌5 7次并倒置、在吸水紙上拍干；
(2) 封閉微孔反應(yīng)板中每孔加入150nL封閉液，37"C反應(yīng)1.5小時，倒 凈，以磷酸鹽-吐溫緩沖液PBST洗滌5 7次并倒置、在吸水紙上拍干；
(3) 加待測血清用磷酸鹽-吐溫緩沖液PBST將待測血清稀釋10 500倍 后以每孔50pL加到微孔反應(yīng)板中，同時設(shè)空白對照、陰性對照、陽性對照，37°C 反應(yīng)1小時，倒凈，以磷酸鹽-吐溫緩沖液PBST洗滌5 7次并倒置、在吸水紙 上拍干；
所述的加待測血清過程中，空白對照、陰性對照、陽性對照分別為應(yīng)加的 稀釋后的待測血清作如下替代空白對照為只加50pLPBST稀釋液；陰性對 照為加相同于待測血清稀釋倍數(shù)的陰性對照血清5(HlL;陽性對照為加相同 于待測血清稀釋倍數(shù)的陽性對照血清5(^L;其余操作均與待測血清的操作相同；
(4) 加酶標(biāo)二抗用磷酸鹽-吐溫緩沖液PBST將商品化的HRP-鼠抗人IgG (辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgG)稀釋至工作濃度(可以根據(jù)購買HRP-鼠
抗人IgG時所附的說明書來稀釋)，微孔反應(yīng)板中每孔加50nL， 37i:反應(yīng)1小 時，倒凈，以磷酸鹽-吐溫緩沖液PBST洗滌5 7次并倒置、在吸水紙上拍干；
(5) 顯色微量反應(yīng)板每孔加50pL的顯色液，37。C顯色反應(yīng)10 15分鐘；
(6) 終止反應(yīng)并讀數(shù)微量反應(yīng)板每孔加2M的硫酸25ML終止顯色反應(yīng)， 酶標(biāo)儀上450nm處讀出吸光值，正常血清作為陰性對照吸光值Bo，待測樣品吸 光值B，當(dāng)B^2.1Bo定為陽性。
所述AMACR自身抗體的檢測方法的應(yīng)用，在前列腺癌診斷中，檢測人血 液中AMACR自身抗體，作為診斷前列腺癌的標(biāo)志物。 本發(fā)明的有益效果-
1. 盡管腫瘤組織中AMACR表達(dá)很高，但病人的血液中的濃度卻很低。本 發(fā)明便是通過測定血液中AMACR自身抗體的濃度來預(yù)測腫瘤組織中AMACR 蛋白的表達(dá)。
2. 直接檢測腫瘤組織中AMACR的表達(dá)需要從病人身上取活體標(biāo)本，增加 了病人的痛苦，不適用于健康檢査。本發(fā)明的檢測方式是無創(chuàng)檢查，只要常規(guī) 抽血即可。所以，可以用于大規(guī)模健康檢査。
3. 本發(fā)明的靈敏度和特異性好于臨床上常用的PSA檢測。 本發(fā)明的檢測方式優(yōu)點如下
1. 檢測的是抗體，適合特定目的的特定需求；
2. 包被的AMACR抗原純度高，從而特異性高；
3. 操作簡單易行，可以標(biāo)準(zhǔn)化為產(chǎn)品；
4. 檢測成本低廉，適于推廣；
5. 通過酶標(biāo)儀判讀，減少主觀性；
6. 可以進(jìn)行大批量檢測。
具體實施例方式
一、試劑的配制
(1) 包被緩沖液(0.05M， pH9.6): 1.59gNa2C03 、 2.93gNaHC03，加超純 水定容至lOOOmL;
(2) 磷酸鹽緩沖液(PBS， 0.15M， pH7.4): 8.0g NaCl、 0.2gKCl、 2.9g Na2HPCV12H20、 0.2g KH2P04，調(diào)pH至7.4后加超純水定容至lOOOmL;
(3) 磷酸鹽-吐溫緩沖液(PBST， 0.15M, pH7.4): 8.0gNaCl、 0.2gKCl、 2.9g Na2HP04'12H20、 0.2g KH2P04、 0.5ml Tween-20，調(diào)pH至7.4后加超純水定容 至lOOOmL;
(4) 封閉液l.Og明膠溶于100ml磷酸鹽緩沖液(PBS， 0.15M, pH7.4)中；
(5) 底物緩沖液(0.05M， pH5.6): 39.8gNa2HP04'12H20、 6.3g檸檬酸，加 超純水定容至lOOOmL;
(6) 顯色液10mL pH5.6底物緩沖液、O.lmL 1%四甲基聯(lián)苯胺(10mg四 甲基聯(lián)苯胺溶于lmL二甲基亞砜)和32^iL0.75XH202，混合均勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；(7) 終止液2MH2S04;
(8) 陽性對照血清取篩出的陽性血清(OD450^0.500)按1000單位/mL 加青霉素和鏈霉素，無菌過濾；
(9) 陰性對照血清取正常男性血清(OD45(^0.100)按1000單位/mL加 青霉素和鏈霉素，無菌過濾；
二、 AMACR自生抗體ELISA檢測方法
(1) 包被用包被緩沖液將特異性抗原AMACR稀釋至0.1 10|ug/mL， 按5(Hil每孔加入微孔反應(yīng)板中，37'C水浴中反應(yīng)2h，倒凈，以洗滌緩沖液磷酸 鹽-吐溫緩沖液(PBST)洗滌5 7次并倒置、在吸水紙上拍干；
(2) 封閉每孔加入15(HiL封閉液，37'C反應(yīng)1.5小時，倒凈，以磷酸鹽 -吐溫緩沖液(PBST)洗滌5 7次并倒置、在吸水紙上拍干；
(3) 加待測血清用磷酸鹽-吐溫緩沖液(PBST)將待測血清稀釋10 500 倍后以每孔50pL加到微孔反應(yīng)板中，同時設(shè)空白對照、陰性對照、陽性對照， 37。C反應(yīng)l小時，倒凈，以磷酸鹽-吐溫緩沖液(PBST)洗滌5 7次并倒置、 在吸水紙上拍干；
(4) 加酶標(biāo)二抗用磷酸鹽-吐溫緩沖液(PBST)將商品化的HRP-鼠抗人 IgG (辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgG)稀釋至工作濃度(可以根據(jù)購買HRP-鼠抗人IgG時所附說明書來稀釋)，微孔反應(yīng)板每孔加50|iL， 37'C反應(yīng)1小時， 倒凈，以磷酸鹽-吐溫緩沖液(PBST)洗滌5 7次并倒置、在吸水紙上拍干；
(5) 顯色微量分析板每孔加50pL的顯色液，37'C顯色反應(yīng)10 15分鐘；
(6) 終止反應(yīng)并讀數(shù)加2M的硫酸，微量分析板每孔加25pL終止顯色反 應(yīng)，酶標(biāo)儀上450nm處讀出吸光值，正常血清作為陰性對照吸光值Bo，待測樣 品吸光值B，當(dāng)B^2.1Bo定為陽性。
三、 臨床上檢測方法的應(yīng)用
按上述實施步驟進(jìn)行臨床檢測，表明本發(fā)明與傳統(tǒng)PSA的檢測方法相比， 具有更高的靈敏度和特異性。
取前列腺癌病人血樣30例、正常男性血樣45例。
利用本發(fā)明所述方法進(jìn)行檢測，得出真陽性23例、真陰性36例、假陽 性9例、假陰性7例。
利用傳統(tǒng)PSA的檢測方法進(jìn)行檢測，得出真陽性13例、真陰性23例、 假陽性22例、假陰性17例。
經(jīng)靈敏度公式[真陽性數(shù)/ (真陽性數(shù)+假陰性數(shù))]X100。/。和特異性公式:X100n/?？梢缘贸隼帽景l(fā)明檢測前列腺
癌靈敏度為76.7%，特異性為80%;利用PSA來檢測前列腺癌靈敏度為43.3%, 特異性為51.1%。
權(quán)利要求
1、一種α-甲基?；o酶A消旋酶AMACR自身抗體的檢測方法，其特征是A、試劑的配制(1)0.05M、pH9.6包被緩沖液1.59g Na2CO3、2.93g NaHCO3，加超純水定容至1000mL；(2)0.15M、pH7.4磷酸鹽緩沖液PBS8.0g NaCl、0.2g KCl、2.9gNa2HPO4·12H2O和0.2g KH2PO4，調(diào)pH至7.4后加超純水定容至1000mL；(3)0.15M，pH7.4磷酸鹽-吐溫緩沖液PBST8.0g NaCl、0.2gKCl、2.9gNa2HPO4·12H2O、0.2g KH2PO4和0.5mL Tween-20，調(diào)pH至7.4后加超純水定容至1000mL；(4)封閉液1.0g明膠溶于100mL 0.15M、pH7.4磷酸鹽緩沖液PBS中；(5)0.05M、pH 5.6底物緩沖液39.8g Na2HPO4·12H2O、6.3g檸檬酸，加超純水定容至1000mL；(6)顯色液10mL pH5.6底物緩沖液、10mg四甲基聯(lián)苯胺溶于1mL二甲基亞砜配制的1％四甲基聯(lián)苯胺0.1mL和32μL 0.75％H2O2混合均勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；(7)終止液2M H2SO4；(8)陽性對照血清取篩出的陽性血清OD450≥0.500，按每mL血清加1000單位青霉素和1000單位鏈霉素，無菌過濾；(9)陰性對照血清取正常男性血清OD450≤0.100，按每mL血清加1000單位青霉素和1000單位鏈霉素，無菌過濾；所述的試劑的配制按照實際需要按比例來配制；B、AMACR自身抗體ELISA檢測方法(1)包被用包被緩沖液將特異性抗原AMACR稀釋至0.1～10μg/mL，在微孔反應(yīng)板中每孔加入50μL，37℃水浴中反應(yīng)2h或4℃冰箱過夜，倒凈，以洗滌緩沖液磷酸鹽-吐溫緩沖液PBST洗滌5～7次并倒置、在吸水紙上拍干；(2)封閉微孔反應(yīng)板中每孔加入150μL封閉液，37℃反應(yīng)1.5小時，倒凈，以磷酸鹽-吐溫緩沖液PBST洗滌5～7次并倒置、在吸水紙上拍干；(3)加待測血清用磷酸鹽-吐溫緩沖液PBST將待測血清稀釋10～500倍后以每孔50μL加到微孔反應(yīng)板中，同時設(shè)空白對照、陰性對照、陽性對照，37℃反應(yīng)1小時，倒凈，以磷酸鹽-吐溫緩沖液PBST洗滌5～7次并倒置、在吸水紙上拍干；所述的加待測血清過程中，空白對照、陰性對照、陽性對照分別為應(yīng)加的稀釋后的待測血清作如下替代空白對照為只加50μL PBST稀釋液；陰性對照為加相同于待測血清稀釋倍數(shù)的陰性對照血清50μL；陽性對照為加相同于待測血清稀釋倍數(shù)的陽性對照血清50μL；其余操作均與待測血清的操作相同；(4)加酶標(biāo)二抗用磷酸鹽-吐溫緩沖液PBST將商品化的HRP-鼠抗人IgG稀釋至工作濃度，根據(jù)購買HRP-鼠抗人IgG時所附的說明書來稀釋，微孔反應(yīng)板中每孔加50μL，37℃反應(yīng)1小時，倒凈，以磷酸鹽-吐溫緩沖液PBST洗滌5～7次并倒置、在吸水紙上拍干；(5)顯色微量反應(yīng)板每孔加50μL的顯色液，37℃顯色反應(yīng)10～15分鐘；(6)終止反應(yīng)并讀數(shù)微量反應(yīng)板每孔加2M的硫酸25μL終止顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀上450nm處讀出吸光值，正常血清作為陰性對照吸光值Bo，待測樣品吸光值B，當(dāng)B≥2.1Bo定為陽性。
2、權(quán)利要求1所述AMACR自身抗體的檢測方法的應(yīng)用，其特征是在前列 腺癌診斷中，檢測人血液中AMACR自身抗體，作為診斷前列腺癌的標(biāo)志物。
全文摘要
一種AMACR自身抗體的檢測方法及在前列腺癌診斷中的應(yīng)用，涉及體外免疫檢測領(lǐng)域。本發(fā)明提供一種AMACR自身抗體ELISA檢測方法，用特異性抗原AMACR包被微孔反應(yīng)板，加待測血清到微孔反應(yīng)板中，同時設(shè)空白對照、陰性對照、陽性對照；加酶標(biāo)二抗，顯色和終止反應(yīng)并讀數(shù)；酶標(biāo)儀上450nm處讀出吸光值，正常血清作為陰性對照吸光值Bo，待測樣品吸光值B，當(dāng)B≥2.1Bo定為陽性。所述AMACR自身抗體的檢測方法的應(yīng)用，在前列腺癌診斷中，檢測人血液中AMACR自身抗體，作為診斷前列腺癌的標(biāo)志物。本發(fā)明優(yōu)點在于相對于目前國內(nèi)市場上利用檢測人血液中PSA的濃度來診斷前列腺癌的方法，在靈敏度和特異性上都有很大的提高。
文檔編號G01N33/574GK101344525SQ20081012450
公開日2009年1月14日 申請日期2008年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月22日
發(fā)明者斌 吳, 楊靜華 申請人:無錫納生生物科技有限公司