專利名稱：：頭孢氨芐殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種獸藥殘留的免疫化學(xué)速測技術(shù)，特別是涉及一種用于頭孢氨芐殘留檢測的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：頭孢氨芐(Cephalexin)是P-內(nèi)酰胺類抗生素。獸醫(yī)臨床廣泛用于控制奶牛的乳房炎，治療動物尿道、胃腸道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不當(dāng)或不遵守休藥期規(guī)定等原因，均可造成它在畜產(chǎn)品中的殘留，給人類健康帶來嚴(yán)重危害。針對該藥物在食品中的殘留，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定，牛奶中的最大殘留限量為100pg/kg,肌肉、脂肪中的最大殘留限量為200pg/kg。目前，用于檢測頭孢氨芐的方法主要有微生物法、色譜法或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法、免疫分析法等。微生物檢測法操作簡單，但其檢測周期長且結(jié)果誤差較大。色譜法或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)雖然靈敏度高，但是樣品前處理及測定操作繁瑣、費(fèi)用高，不適于大量樣品的快速檢免疫分析法(Immunoassay)具有極高的選擇性和靈敏度，是廣泛使用的快速篩查方法?；诿笜?biāo)記物放大作用的免疫分析稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,即ELISA)，ELISA以其具有靈敏、快速、特異、簡便等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場監(jiān)控和大規(guī)模樣品篩査。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本篩查，用于檢測牛奶及動物組織中頭孢氨芐藥物殘留量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。一種頭孢氨芐殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其中設(shè)置有以下成分包被有包被原的酶標(biāo)板，所述包被原為頭孢氨芐與載體蛋白的偶聯(lián)物；頭孢氨芐特異性抗體；酶標(biāo)記物；頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品溶液0嗎/L-5嗎/L;底物顯色液；終止液；濃縮洗滌液；和樣品稀釋液。本發(fā)明的試劑盒，其中所述酶標(biāo)板的制備過程為用包被緩沖液將包被原稀釋成0.5-1pg/mL，每孔加入100pL，37t:溫育2h，再4'C過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200^L封閉液，37i:溫育2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。本發(fā)明的試劑盒，其中所述酶標(biāo)板在制備過程中所用的包被緩沖液為pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；所用的封閉液是1%-5%牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明的試劑盒，其中所述頭孢氨芐特異性抗體為頭孢氨芐單克隆抗體，其是用頭孢氨芐與載體蛋白采用碳化二亞胺法得到的偶聯(lián)物作為免疫原，利用雜交瘤技術(shù)得到的。其具體制備過程為(1)動物免疫采用雌性BALB/C純系小鼠作為免疫動物，以頭孢氨芐與載體蛋白牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原；(2)細(xì)胞融合與克隆化取免疫BALB/C小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選細(xì)胞株，得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；(3)單克隆抗體的制備與純化使用雌性BALB/C純系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐劑，5天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞株106個(gè)/只，7天后取小鼠腹水，進(jìn)行純化后得單克隆抗體分裝，-2(TC保存。本發(fā)明的試劑盒，其中所述載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)、甲狀腺蛋白(BCG)、卵清蛋白(OVA)或血藍(lán)蛋白(KLH)等常用蛋白。本發(fā)明的試劑盒，其中所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記羊抗鼠抗抗體，其中酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物，酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體是采用過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與羊抗鼠抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的。本發(fā)明的試劑盒，其中所述底物顯色液由體積比為1:1的顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過氧化脲，顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺。本發(fā)明的試劑盒，其中所述終止液為1-2mol/L的硫酸。所述濃縮洗滌液為pH7.4含0.5%-1%吐溫20的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。所述樣品稀釋液為含有0.1%-1%牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明還提供一種利用所述的頭孢氨芐殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測頭孢氨芐殘留的方法，包括以下步驟(1)樣品前處理脫脂牛奶樣品用樣品稀釋液稀釋后直接測定；動物組織用含吐溫20磷酸鹽緩沖液抽提，再用三氯甲垸去除脂肪后測定；(2)用試劑盒檢測向酶標(biāo)板微孔中加入頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液50pL，再加入頭孢氨芐特異性抗體50pL，用蓋板膜封板，37C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，每孔加入250pL濃縮洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干；加入酶標(biāo)記物100pL，37'C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟，每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺各50pL，輕輕振蕩混勻，37。C恒溫箱避光顯色15min，每孔加入2mol/L終止液硫酸50^L，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)測定450nm處吸光度值；(3)檢測結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(Bo)再乘以100%，得到百分吸光度值；計(jì)算公式為百分吸光度值(％)=(8/80)xlOO%;公式中B為標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值，BQ為0pg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液得平均吸光度值；以頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品濃度的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)出一個(gè)樣品的濃度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品中頭孢氨芐的殘留量。本發(fā)明的檢測原理為在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被頭孢氨芐偶聯(lián)包被抗原，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入頭孢氨芐特異性抗體溶液，樣本中殘留的頭孢氨芐或頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)板上包被的頭孢氨芐偶聯(lián)抗原競爭頭孢氨芐特異性抗體，加入酶標(biāo)記二抗，用顯色液顯色后，在450nm處檢測吸光度，吸光度值與樣本中頭孢氨芐的濃度成反比?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中頭孢氨芐的濃度。本發(fā)明中檢測動物性食品中頭孢氨芐的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定性或定量檢測牛奶及動物組織(豬、牛的肌肉、肝臟、腎臟等)中頭孢氨芐的殘留量，樣品前處理過程簡單，脫脂牛奶樣品，用樣品稀釋液稀釋后可直接測定，動物組織用含吐溫20磷酸鹽緩沖液抽提，再用三氯甲烷去除脂肪后測定，并且能同時(shí)檢測大批樣品。測定方法簡單、省時(shí)，整個(gè)檢測過程只需1.5小時(shí)可以完成。牛奶和肌肉中的最低檢測線分別為0.5嗎/L和0.5嗎/kg，具有特異性高、靈敏度高、精確度高等特點(diǎn)，可在動物性食品中頭孢氨芐的殘留檢測中發(fā)揮重要作用。圖1為實(shí)施例1中的頭孢氨芐的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:頭孢氨芐殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備1.蛋白偶聯(lián)抗原的合成(1)頭孢氨芐免疫抗原的合成將頭孢氨芐和牛血清白蛋白(BSA)采用碳二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫抗原。具體操作如下取頭孢氨芐15mg溶于5mLPBS(0.01mol/L,pH7.4)中，加入25mg碳二亞胺(EDC)和10mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)攪拌30分鐘，取BSA10mg溶于活化的頭孢氨芐溶液中，25"C攪拌反應(yīng)2小時(shí)，再4'C反應(yīng)過夜。4'C條件下，用PBS透析3天，得到頭孢氨芐免疫抗原，分裝凍存。(2)頭孢氨芐包被抗原的合成將頭孢氨芐和卵清蛋白(OVA)，采用戊二醛法進(jìn)行偶聯(lián)得到包被抗原。具體操作如下取頭孢氨節(jié)10mg溶于5mLPBS(0.01mol/L,pH7.4)中，加入1%戊二醛溶液攪拌30分鐘，取OVA30mg溶于lmLPBS，加入到活化的頭孢氨芐溶液中，25'C攪拌反應(yīng)2小時(shí)，4'C反應(yīng)過夜。4'C條件下，用PBS透析3天，得到頭孢氨芐包被抗原，分裝凍存。2.單克隆抗體的制備(1)動物免疫將合成的免疫原與等量的弗氏完全佐劑乳化，腹腔注射8周齡雌性BALB/C小鼠，劑量為100昭/只。然后以100嗎/只的劑量加弗氏不完全佐劑腹腔注射加強(qiáng)免疫3次，間隔2周。分別于每次免疫后IO天小鼠眼眶后緣靜脈采血，測定抗體效價(jià)。(2)細(xì)胞融合和克隆化取免疫小鼠的脾細(xì)胞，按5:l比例與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，制備雜交瘤細(xì)胞。采用有限稀釋法篩選能夠穩(wěn)定分泌頭孢氨芐單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)后液氮凍存。(3)單克隆抗體的制備與純化使用雌性BALB/C純系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐劑0.5mL/只，5天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞106個(gè)/只，7天后取小鼠腹水，經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，分裝，-20°〇保存。3.試劑盒的制備(1)酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將頭孢氨芐包被抗原稀釋成0.5-1pg/mL，每孔加入100^L，37'C溫育2h再4'C過夜，傾去包被液，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌4次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200pL封閉液，37'C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。(2)所用試劑的配1)頭孢氨芐系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度分別為0ng/L，0.05pg/L，0.1pg/L，0.5pg/L，2)蛋白濃度為0.1-1mg/L的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG。3)蛋白濃度為0.1-1mg/L的頭孢氨芐單克隆抗體。4)底物顯色液由A液和B液組成，A液為用0.1mol/LpH5.0的檸檬酸緩沖液配制成0.1-1mg/mL的過氧化脲溶液，B液為四甲基聯(lián)苯胺先用無水乙醇配制2mg/mL的溶液，再用0.1mol/LpH5.0的檸檬酸緩沖液配制成0.1-1mg/mL溶液。5)終止液為l-2mol/L硫酸。6)濃縮洗滌液為pH7.4含0.8-1.2%吐溫20的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。7)樣品稀釋液為0.1%-1%牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。實(shí)施例1制備的試劑盒的試驗(yàn)例試驗(yàn)例1樣品中頭孢氨芐殘留的檢測(1)樣品前處理牛奶樣本取適量牛奶樣本，4'C，4000r/min，離心15min，去除上層脂肪，取下層溶液用樣品稀釋液按1:10稀釋后，取50pL用于分析。肌肉組織和臟器稱取1-5g組織樣搗碎后，加入9-45mL含吐溫20磷酸鹽緩沖液混合，4000r/min，離心20min，取上清液，加入4-20mL三氯甲烷，振搖，4000r/min，離心20min，取50pL用于分析。(2)用試劑盒檢測向頭孢氨芐偶聯(lián)抗原包被的酶標(biāo)板微孔中加入頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液50pL，再加入頭孢氨芐單克隆抗體工作液50^L，用蓋板膜封板，37"C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，每孔加入250pL洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液100pL，37t;恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟，每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺各50nL，輕輕振蕩混勻，37。C恒溫箱避光顯色15min，每孔加入2mol/L終止液硫酸50pL，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)測定450nm處吸光度值。(3)檢測結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(Bo)再乘以100%，得到百分吸光度值。計(jì)算公式為百分吸光度值(n/。)-(B/Bo)xl00%公式中B為標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值，BQ為0pg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。以頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品濃度的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(見圖l)。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本中頭孢氨節(jié)的殘留量。試驗(yàn)例2試劑盒靈敏度試驗(yàn)分別測定20個(gè)不同批次的空白標(biāo)準(zhǔn)液，計(jì)算A45o的平均百分吸光度值(BQ)和標(biāo)準(zhǔn)差")，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出Bo+3S對應(yīng)的質(zhì)量濃度為理論檢測下限(LOD)，該濃度即為靈敏度。結(jié)果表明本發(fā)明開發(fā)的試劑盒對牛奶樣品的最低檢測限為0.5Kig/L，對動物組織樣品的最低檢測線為0.5pg/kg。試驗(yàn)例3試劑盒特異性測定選擇與頭孢氨芐結(jié)構(gòu)和功能類似的3種藥物測定交叉反應(yīng)率。通過各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50%抑制濃度。用下式計(jì)算試劑盒對其它藥物的交叉反應(yīng)率交叉反應(yīng)率(％)=(引起50%抑制頭孢氨芐的濃度/引起50%抑制的類似物濃度)xlOO%。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，測試的3種藥物與頭孢氨芐沒有交叉反應(yīng)。表1頭孢氨芐檢測試劑盒的交叉反應(yīng)性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>試驗(yàn)例4精密度、準(zhǔn)確度試驗(yàn)樣品精密度試驗(yàn)-1)取頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)樣品，添加20pg/L到樣品中，分別取三個(gè)不同批次的試劑盒各三個(gè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)。結(jié)果表明，牛奶、組織樣本中的變異系數(shù)均低于25%。2)分別在空白牛奶、牛肉樣品中添加頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)液至終濃度為10pg/L(kg)、20pg/L(kg)和50pg/L(kg)。分別對樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)算準(zhǔn)確度。結(jié)果表明牛奶、組織樣品添加準(zhǔn)確度在79.5-98.7%之間。試驗(yàn)例5試劑盒保存期試驗(yàn)試劑盒保存條件為2-8°C，經(jīng)過6個(gè)月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50%抑制濃度、頭孢氨芐添加實(shí)際測定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運(yùn)輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37'C保存的條件下放置4天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8。C至少可以保存6個(gè)月以上。以上所述的實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種頭孢氨芐殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于其中設(shè)置有以下成分包被有包被原的酶標(biāo)板，所述包被原為頭孢氨芐與載體蛋白采用戊二醛法進(jìn)行偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物；頭孢氨芐特異性抗體；酶標(biāo)記物；頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品溶液0μg/L-5μg/L；底物顯色液；終止液；濃縮洗滌液；和樣品稀釋液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)板的制備過程為用包被緩沖液將包被原稀釋成0.5-1)xg/mL，每孔加入100pL，37'C溫育2h，再4。C過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200pL封閉液，37'C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)板在制備過程中所用的包被緩沖液為pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；所用的封閉液是1%-5%牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述頭孢氨芐特異性抗體為頭孢氨芐單克隆抗體，其是用頭孢氨芐與載體蛋白采用碳化二亞胺法得到的偶聯(lián)物作為免疫原，利用雜交瘤技術(shù)得到的。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述頭孢氨芐單克隆抗體的具體制備過程為(1)動物免疫采用雌性BALB/C純系小鼠作為免疫動物，以頭孢氨芐與載體蛋白牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原；(2)細(xì)胞融合與克隆化取免疫BALB/C小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選細(xì)胞株，得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；(3)單克隆抗體的制備與純化使用雌性BALB/C純系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐劑，5天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞株106個(gè)/只，7天后取小鼠腹水，進(jìn)行純化后得單克隆抗體分裝，-20°C保存。6.根據(jù)權(quán)利要求1或4或5任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)、甲狀腺蛋白(BCG)、卵清蛋白(OVA)或血藍(lán)蛋白(KLH)。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記羊抗鼠抗抗體，其中酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物，酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體是采用過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與羊抗鼠抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述底物顯色液由體積比為1:l的顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過氧化脲，顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述終止液為1-2mol/L的硫酸；濃縮洗滌液為pH7.4含0.5%-1%吐溫20的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液；樣品稀釋液為含有0.1%-1%牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。10.—種利用權(quán)利要求1所述的頭孢氨芐殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測頭孢氨節(jié)殘留的方法，其特征在于包括以下步驟(1)樣品前處理脫脂牛奶樣品用樣品稀釋液稀釋后直接測定；動物組織用含吐溫20磷酸鹽緩沖液抽提，再用三氯甲烷去除脂肪后測定；(2)用試劑盒檢測向酶標(biāo)板微孔中加入頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液50^L，再加入頭孢氨芐特異性抗體50pL，用蓋板膜封板，37"C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，每孔加入250濃縮洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干；加入酶標(biāo)記物100pL，37'C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟，每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺各50^L，輕輕振蕩混勻，37"C恒溫箱避光顯色15min，每孔加入2mol/L終止液硫酸50^L，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)測定450nm處吸光度值；(3)檢測結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(Bo)再乘以100%，得到百分吸光度值；計(jì)算公式為百分吸光度值(％)=(8/80)xl00%;公式中B為標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值，Bc為Opg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值；以頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品濃度的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)出一個(gè)樣品的濃度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品中頭孢氨芐的殘留量。全文摘要一種頭孢氨芐殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其中設(shè)置有以下成分包被有包被原的酶標(biāo)板，所述包被原為頭孢氨芐與載體蛋白的偶聯(lián)物；頭孢氨芐特異性抗體；酶標(biāo)記物；頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品溶液0μg/L-5μg/L；底物顯色液；終止液；濃縮洗滌液；和樣品稀釋液。本發(fā)明的檢測動物性食品中頭孢氨芐殘留的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定性或定量檢測牛奶及動物組織(豬、牛的肌肉、肝臟、腎臟等)中頭孢氨芐的殘留量，樣品前處理過程簡單，能同時(shí)檢測大批樣品。測定方法簡單、省時(shí)，整個(gè)檢測過程只需1.5小時(shí)就可以完成。文檔編號G01N33/543GK101354401SQ20081022209公開日2009年1月28日申請日期2008年9月9日優(yōu)先權(quán)日2008年9月9日發(fā)明者王羚鴻,鄒明強(qiáng),剛郝,涌金,陳立本申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院