一種檢測農(nóng)、獸藥殘留的裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測農(nóng)、獸藥殘留的裝置，包括上樣系統(tǒng)和量熱免疫傳感器，上樣系統(tǒng)包括加樣閥，加樣閥通過管道分別與樣品罐，底物罐，載液罐，再生液罐連接；量熱免疫傳感器包括HPLC泵，HPLC泵通過管道分別與第一、第二熱調(diào)節(jié)器的上端口連接，第一、第二熱調(diào)節(jié)器的下端口分別通過管道與第一、第二ProteinG瓊脂糖凝膠柱14的下端口連接，第一、第二ProteinG瓊脂糖凝膠柱的上端口分別通過管道與廢液罐11連接，N2000色譜數(shù)據(jù)工作站10與惠斯通電橋7電連接，惠斯通電橋分別與第一、第二ProteinG瓊脂糖凝膠柱電連接，加樣閥4與HPLC泵6通過管道連接。本發(fā)明的裝置高特異性快速檢測農(nóng)、獸藥殘留。
【專利說明】一種檢測農(nóng)、獸藥殘留的裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種檢測農(nóng)、獸藥殘留的裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]量熱生物傳感器探索的是生物反應(yīng)中最基本的特性一吸熱或產(chǎn)熱。幾乎所有的物理、化學(xué)、生物的反應(yīng)，尤其在酶催化反應(yīng)中都涉及熱量交換。尤其在酶催化反應(yīng)中，通常伴有20?IOOkJ moF1的熱量變化。1962年Clark和Lyons首先提出酶電極概念并對酶催化反應(yīng)進(jìn)行量熱研究。上世紀(jì)70年代人們制備出了如今我們稱為量熱生物傳感器的裝置。其共性之一就是使用固定化酶，一方面降低成本另一方面提高了反應(yīng)效能。量熱計(jì)的研究著力于量熱裝置的研發(fā)，主要檢測經(jīng)酶催化底物后流動相溫度的變化。與其它分析方法相比較，固定化酶與量熱技術(shù)的結(jié)合具有諸多優(yōu)勢，諸如:可對大多數(shù)生物樣品進(jìn)行分析、固定化酶可重復(fù)使用、檢測不受樣品光學(xué)或離子環(huán)境特性的干擾，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)流動相下檢測、檢測過程簡便、可引入?yún)⒈炔考?。酶量熱傳感器最先用于對葡萄糖及尿素的檢測，然后逐漸應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、食品衛(wèi)生、工業(yè)過程監(jiān)測等領(lǐng)域。由于檢測熱信號反應(yīng)總的放熱量，因而缺乏檢測特異性。對于由于載液與樣品在PH及離子強(qiáng)度上的不匹配造成的非特異性信號響應(yīng)可以通過對樣品稀釋加以克服，也可以在檢測裝置中放入惰性的參比柱進(jìn)行信號差異性檢測以去除非特異性信號。量熱檢測方法中由于上樣量太少不足以產(chǎn)生放熱信號的穩(wěn)定態(tài)而是以峰的形式出現(xiàn)。在一定底物濃度下峰高正比于放熱量。峰面積及峰上升斜率與底物濃度呈線性關(guān)系。
[0003]量熱酶聯(lián)免疫吸附檢測(TELISA)是基于酶聯(lián)免疫吸附檢測方法基本原理并結(jié)合量熱儀檢測標(biāo)記酶催化特異性底物產(chǎn)生的熱信號的檢測方法。
[0004]專利CN103134930A公開了一種“用于農(nóng)藥阿特拉津的量熱酶聯(lián)免疫吸附(TELISA)檢測方法”，其固相載體采用表面氨基化修飾的可控多孔玻璃珠(CPG)。在應(yīng)用這個儀器檢測過程中需要使用戊二醛等化學(xué)試劑將抗體與固相載體偶聯(lián)，偶聯(lián)效果的不同，直接影響了檢測的重復(fù)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測農(nóng)、獸藥殘留的裝置。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0007]—種檢測農(nóng)、獸藥殘留的裝置，包括上樣系統(tǒng)和量熱免疫傳感器，上樣系統(tǒng)包括加樣閥4，加樣閥4通過管道分別與樣品罐1，底物罐2，載液罐3，再生液罐5連接；量熱免疫傳感器包括HPLC泵6，HPLC泵6通過管道分別與第一熱調(diào)節(jié)器8的上端口和第二熱調(diào)節(jié)器13的上端口連接，第一熱調(diào)節(jié)器8的下端口通過管道與第一 ProteinG瓊脂糖凝膠柱9下端口連接，第二熱調(diào)節(jié)器13的下端口通過管道與第二 ProteinG瓊脂糖凝膠柱14的下端口連接,第一 ProteinG瓊脂糖凝膠反應(yīng)柱9上端口和第二 ProteinG瓊脂糖凝膠柱的上端口 14分別通過管道與廢液罐11連接，N2000色譜數(shù)據(jù)工作站10與惠斯通電橋7電連接，惠斯通電橋分別與第一 ProteinG瓊脂糖凝膠柱和第二 ProteinG瓊脂糖凝膠柱電連接,所述加樣閥4與HPLC泵6通過管道連接。
[0008]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明的一種檢測農(nóng)、獸藥殘留的裝置中的Protein G瓊脂糖凝膠能對小鼠源IgG抗體Fe片段特異結(jié)合，省去現(xiàn)有技術(shù)的化學(xué)偶聯(lián)過程，避免CPG玻璃珠與抗體偶聯(lián)效果不同對檢測結(jié)果的影響，進(jìn)一步增強(qiáng)了方法通用性的優(yōu)勢。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)不同目標(biāo)物的檢測。發(fā)明的裝置可以高特異性快速檢測農(nóng)、獸藥殘留，為其在食品安全檢測領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1本發(fā)明一種檢測農(nóng)、獸藥殘留的裝置示意圖。
[0010]圖2檢測阿特拉津(ATR)原理示意圖。
[0011]圖3羧基化阿特拉津_β -內(nèi)酰胺酶質(zhì)譜圖。
[0012]圖4本發(fā)明檢測阿特拉津(ATR)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0014]一種檢測農(nóng)、獸藥殘留的裝置，包括上樣系統(tǒng)和量熱免疫傳感器，上樣系統(tǒng)包括加樣閥4，加樣閥4通過管道分別與樣品罐1，底物罐2，載液罐3，再生液罐5連接；量熱免疫傳感器包括HPLC泵6，HPLC泵6通過管道分別與第一熱調(diào)節(jié)器8的上端口和第二熱調(diào)節(jié)器13的上端口連接，第一熱調(diào)節(jié)器8的下端口通過管道與第一 ProteinG瓊脂糖凝膠柱9下端口連接，第二熱調(diào)節(jié)器13的下端口通過管道與第二 ProteinG瓊脂糖凝膠柱14的下端口連接,第一 ProteinG瓊脂糖凝膠反應(yīng)柱9上端口和第二 ProteinG瓊脂糖凝膠柱的上端口 14分別通過管道與廢液罐11連接，Ν2000色譜數(shù)據(jù)工作站10與惠斯通電橋7電連接，惠斯通電橋分別與第一 ProteinG瓊脂糖凝膠柱和第二 ProteinG瓊脂糖凝膠柱電連接,所述加樣閥4與HPLC泵6通過管道連接。
[0015]本發(fā)明一種檢測農(nóng)、獸藥殘留的裝置，包括上樣系統(tǒng)和量熱免疫傳感器，經(jīng)上樣系統(tǒng)通入載液并平衡流動體系后，使用經(jīng)過優(yōu)化配比的β_內(nèi)酰胺酶與羧基化抗原偶聯(lián)物、抗體復(fù)合物，以及待測樣品(樣品罐)經(jīng)孵育后，由上樣系統(tǒng)進(jìn)入量熱免疫傳感器的ProteinG瓊脂糖凝膠上的識別位點(diǎn)，接下來通過上樣系統(tǒng)加入氨芐西林溶液(底物罐)經(jīng)酶催化產(chǎn)生熱信號，并被惠斯通電橋收集、轉(zhuǎn)化后在Ν2000色譜數(shù)據(jù)工作站(酶量熱工作站)上，以峰信號顯示并記錄。檢測完成后使用再生液(再生液罐)對量熱免疫傳感器中管路進(jìn)行沖洗，對ProteinG瓊脂糖凝膠進(jìn)行再生。在檢測過程中產(chǎn)生的廢液進(jìn)入廢液罐。最終根據(jù)數(shù)據(jù)繪制檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0016]實(shí)施例1
[0017]以農(nóng)藥(除草劑)阿特拉津?yàn)槟繕?biāo)物采用本發(fā)明的裝置進(jìn)行檢測:
[0018]I實(shí)驗(yàn)方法
[0019]1.1 β -內(nèi)酰胺酶與羧基化阿特拉津分子的偶聯(lián)
[0020](I)將9.2mg羧基化阿特拉津溶于200 μ L N, N- 二甲基亞酰胺(DMF)中，震蕩使其完全溶解；[0021](2)將6.0mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)加入步驟⑴的混合溶液中，溶解完全后攪拌下快速加入10.2mgl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC-HCL)，室溫避光攪拌反應(yīng)8小時，得到溶液A ；
[0022](3)稱取催化活性為IOku的內(nèi)酰胺酶溶解溶于雙蒸水6.5mL中，制備溶液B，
4°C保存；
[0023](4)室溫下，500轉(zhuǎn)/分鐘攪拌下，將溶液A滴加到溶液B中，滴加完畢后置于4°C繼續(xù)緩慢攪拌12小時；
[0024](5)將步驟(4)產(chǎn)物用0.02mol/L、pH = 7.0磷酸鹽緩沖液4°C透析I天，期間換透析液4次，得羧基化阿特拉津-β -內(nèi)酰胺酶，分裝于EP管中，_20°C保存?zhèn)溆?。對所得產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定(MALD1-T0F-MS)，結(jié)果圖3。
[0025]由圖3結(jié)果可知，β -內(nèi)酰胺酶的分子量約為28678，如圖3Β。偶聯(lián)后羧基化阿特拉津-β-內(nèi)酰胺酶分子量約為31783，如圖3Α。羧基化阿特拉津分子量約為283.38。因此可知產(chǎn)物中蛋白-小分子摩爾比約為11:1，證明偶聯(lián)成功。
[0026]1.2采用本發(fā)明的一種檢測農(nóng)、獸藥殘留的裝置檢測阿特拉津:
[0027](I)將經(jīng)0.22 μ m針式濾器過濾及超聲除氣后的含質(zhì)量濃度為2%的二甲基亞砜的0.02mol ?ΛρΗ = 7.0的PBS載液貯存于載液罐3中，通過加樣閥4，以流速400 μ LmirT1作為載液平衡流動體系通過量熱免疫傳感器，獲得穩(wěn)定的基線信號；
[0028](2)以 0.02mol L—1，pH = 7.0 的 PBS 為溶劑配制梯度濃度為 OngmL'0.lQngmL、0.39ng mL \ 0.78ng mL \ 1.56ng mL \ 3.12ng mL \ 6.25ng mL \ 12.5ng mL \ 25ng mL 1的阿特拉津溶液，取上述的九個溶液各IOOmL中分別加入阿特拉津單克隆抗體(ATR-mAb)([8.F.20] (ab30533) abeam? 1:8000 稀釋)12.5 μ L、羧基化阿特拉津-β -內(nèi)酰胺酶(1.1獲得用載液稀釋，稀釋1:100) 2.5 μ L和甘油，并使甘油的終濃度為0.5 % (v/v)，將上述各個混合溶液在37°C下孵育30分鐘，依次放入樣品罐(I)中待上樣；
[0029](3)加樣閥加入步驟(2)中獲得的第一個混合液(其中阿特拉津濃度為OngmL—1)，通過量熱免疫傳感器，獲得信號；(孵育過程中產(chǎn)生的抗原抗體復(fù)合物及酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物競爭結(jié)合ProteinG瓊脂糖凝膠上的識別位點(diǎn))
[0030](4)使用加樣閥加入貯存在底物罐2中的4mmol l-1的氨芐西林一載液溶液(1.2步驟(1)獲得)通過量熱免疫傳感器，經(jīng)酶催化產(chǎn)生熱信號，并被惠斯通電橋收集、轉(zhuǎn)化后在N2000色譜數(shù)據(jù)工作站(酶量熱工作站)上以峰信號顯示；
[0031](5)使用加樣閥加入貯存于再生液罐5中再生液，再生液是以雙蒸水為溶劑，加入DMSO(二甲基亞砜)使終質(zhì)量濃度為1%，加入Triton X-100使終質(zhì)量濃度為0.1%，加入氯化鈉，使終摩爾濃度為0.5mol L—1，加入甘氨酸-鹽酸(Gly-HCl)，使終摩爾濃度0.1molL—1，pH = 2.3，流速1200 μ LmirT1通過量熱免疫傳感器，再生12分鐘；
[0032](6)將流速調(diào)整回400 μ L mirT1，體系用載液平衡，經(jīng)約14分鐘基線恢復(fù)；
[0033](7)重復(fù)步驟(2-6)直到第九個濃度的阿特拉津溶液樣品的測試完成。[0034]反應(yīng)原理如圖2所示:
[0035]1.3用檢測農(nóng)、獸藥殘留的裝置檢測阿特拉津方法的建立
[0036]1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲取:
[0037]在優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，將測得的信號值整理并繪制檢測方法標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。方法線性范圍:0.728-4.831ng/mL，靈敏度(IC50) = 1.808ng/mL，最低檢測限:0.728ng/
mLo
[0038]1.3.2方法特異性實(shí)驗(yàn):
[0039]選用了與ATR結(jié)構(gòu)類似的西瑪津(Simazine，SIM)、三聚氰胺、三聚氰酸及結(jié)構(gòu)差異較為明顯的類似物毒死蜱測定方法的特異性，結(jié)果見表1:
[0040]表1.ATR結(jié)構(gòu)及功能類似物交叉反應(yīng)性
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測農(nóng)、獸藥殘留的裝置，包括上樣系統(tǒng)和量熱免疫傳感器，上樣系統(tǒng)包括加樣閥(4)，加樣閥(4)通過管道分別與樣品罐(1)，底物罐(2)，載液罐(3)，再生液罐(5)連接；量熱免疫傳感器包括HPLC泵出)，HPLC泵(6)通過管道分別與第一熱調(diào)節(jié)器(8)的上端口和第二熱調(diào)節(jié)器(13)的上端口連接，第一熱調(diào)節(jié)器(8)的下端口通過管道與第一 ProteinG瓊脂糖凝膠柱(9)下端口連接，第二熱調(diào)節(jié)器(13)的下端口通過管道與第二ProteinG瓊脂糖凝膠柱(14)的下端口連接,第一 ProteinG瓊脂糖凝膠反應(yīng)柱(9)上端口和第二 ProteinG瓊脂糖凝膠柱的上端口(14)分別通過管道與廢液罐(11)連接，N2000色譜數(shù)據(jù)工作站(10)與惠斯通電橋(7)電連接，惠斯通電橋分別與第一 ProteinG瓊脂糖凝膠柱和第二 ProteinG瓊脂糖凝膠柱電連接，所述加樣閥(4)與HPLC泵(6)通過管道連接。
【文檔編號】G01N35/00GK104007275SQ201410279494
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】寧保安, 孫思明, 高志賢, 彭媛, 白家磊, 郄志偉 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所