專利名稱：食品中動(dòng)物用藥殘留的檢測(cè)試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種偵測(cè)食品中動(dòng)物用藥殘留的檢驗(yàn)試劑套組，特別是以利用磁性納米粒子的磁性標(biāo)記免疫測(cè)定配合測(cè)量磁減量的方式來做檢驗(yàn)。
背景技術(shù)：
動(dòng)物用藥品及含藥物飼料添加物雖可維護(hù)畜禽水產(chǎn)動(dòng)物健康，促進(jìn)畜牧事業(yè)發(fā)展，但若不當(dāng)使用則會(huì)造成食品中的殘留，或可能傳遞抗藥性菌株，引起食品安全之疑慮，直接或間接危害國民健康。為預(yù)防并遏止動(dòng)物用藥品被濫用于產(chǎn)食動(dòng)物，配合中國臺(tái)灣地區(qū)衛(wèi)生署訂定的《食品中動(dòng)物用藥殘留標(biāo)準(zhǔn)》，中國臺(tái)灣地區(qū)藥檢局自92年起即協(xié)調(diào)縣市衛(wèi)生局，稽查傳統(tǒng)市場(chǎng)、超級(jí)市場(chǎng)、生鮮超市、商號(hào)、肉鋪、餐廳、小吃店、海產(chǎn)店等，抽驗(yàn)市售農(nóng)畜禽水產(chǎn)品及其加工制品等進(jìn)行動(dòng)物用藥殘留檢測(cè)，檢測(cè)項(xiàng)目包括氯霉素、羥四環(huán)霉素、氯四環(huán)霉素、脫氧輕四環(huán)霉素(doxycycline)、四環(huán)霉素、諾伯霉素、乃卡巴精(nicarbazin)、こ型受體素類(β-Agonists)、孔雀綠、還原型孔雀綠、硝基呋喃代謝物及喹諾酮(Quinolone)類動(dòng)物用藥等。歷年市售農(nóng)畜禽產(chǎn)品中殘留動(dòng)物用藥抽驗(yàn)結(jié)果，禽產(chǎn)品的不合格率相對(duì)較高，其中雞肉不合格率約10. 0%，烏骨雞為40. 0% 50. 0%，雞內(nèi)臟為30. 0% 33. 3%，鵝肉14. 6%，蜂產(chǎn)品中蜂王漿不合格率為10. 0% 30. 0%。雞肉檢出不符規(guī)定藥品項(xiàng)目為乃卡巴精及脫氧羥四環(huán)霉素，烏骨雞主要為恩氟奎林羧酸，其次為脫氧羥四環(huán)霉素，雞內(nèi)臟為乃卡巴精，鵝肉為沙丁胺醇(salbutamol)及萊克多巴胺(ractopamine),蜂王衆(zhòng)為氯霉素及四環(huán)霉素類抗生素。歷年市售水產(chǎn)品中殘留動(dòng)物用藥抽驗(yàn)結(jié)果，魚類產(chǎn)品的不合格率相對(duì)較高，香魚的不合格率為5. 3% 22. 2% ;鱒魚為5. 3% 60. 0% ;石斑魚為27.2% ;吳郭魚為3. 8% 18. 1%，蝦類為10. 0%。其中鱒魚為檢出氯霉素及硝基呋喃代謝物風(fēng)險(xiǎn)高產(chǎn)品；香魚不符規(guī)定藥品項(xiàng)目為恩氟奎林羧酸及硝基呋喃代謝物；吳郭魚為氯霉素及還原型孔雀緑；鰻魚及石斑魚為硝基呋喃代謝物及還原型孔雀緑。由上述資料來看，動(dòng)物用藥殘留于食品內(nèi)的比例甚高，而檢測(cè)必然會(huì)持續(xù)進(jìn)行，以保護(hù)國人的健康。目前用來檢測(cè)水產(chǎn)品中動(dòng)物用藥殘留的儀器主要是液相層析質(zhì)譜儀(LC/MS/MS)，其對(duì)各種動(dòng)物用藥殘留的檢驗(yàn)靈敏度約是零點(diǎn)幾個(gè)ppb ( 10,)。使用LC/MS/MS進(jìn)行動(dòng)物用藥殘留，固然很精確，但在商業(yè)應(yīng)用上，仍呈現(xiàn)出許多問題；如必須對(duì)所取得的水產(chǎn)品進(jìn)行繁雜且冗長的前處理程序后，才能使用LC/MS/MS量測(cè)藥殘含量；LC/MS/MS的操作，必須在20-25°C的環(huán)境下，因此需要一個(gè)特別的空間來安置LC/MS/MS ；LC/MS/MS的精確操作與維護(hù)，實(shí)不容易，故需聘請(qǐng)一位受過專業(yè)訓(xùn)練的人員，專職負(fù)責(zé)操作該儀器，無形中限制了該技術(shù)的應(yīng)用層面，亦増加檢測(cè)成本。近年來，雖然有眾多的研究團(tuán)隊(duì)欲使用ELISA及其它已有的技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物用藥殘留檢驗(yàn)，然而常因檢測(cè)時(shí)的操作復(fù)雜度、或過高的假陽假陰性，而無法將該種技術(shù)普遍地推廣。因此，市場(chǎng)上仍期待能開發(fā)出ー種在水產(chǎn)品中動(dòng)物用藥殘留的檢測(cè)技木，以符合市場(chǎng)所需。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了ー種用于檢測(cè)食品中動(dòng)物用藥殘留的試劑，包括多個(gè)磁性納米粒子，分布于溶液中；其中磁性納米粒子的構(gòu)造為ー個(gè)磁性核；ー個(gè)界面活性劑層，被覆于該磁性核上；以及待測(cè)的動(dòng)物用藥抗體，結(jié)合于該界面活性劑層上。本發(fā)明中所指的磁性核，其材料包括但不限于Fe3O4, Fe2O3, MnFe2O4, CoFe2O4及NiFe2O4,于較佳的實(shí)施例中，磁性核的材料為Fe3O4。本發(fā)明中所指的 界面活性劑是指能使目標(biāo)溶液表面張カ顯著下降的物質(zhì)，以及降低兩種液體之間表面張カ的物質(zhì)，界面活性剤一般為具有親水與疏水基團(tuán)的有機(jī)兩性分子，可溶于有機(jī)溶液和水溶液。于本發(fā)明中，所使用的界面活性剤材料包含但不限于有機(jī)酸、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G、葡聚醣或微脂粒，于較佳的實(shí)施例中，界面活性剤的材料為葡聚醣。本發(fā)明中,可測(cè)試的動(dòng)物用藥包含但不限于氯霉素(Chloramphenicol,CAP)、輕四環(huán)霉素、氯四環(huán)霉素、脫氧羥四環(huán)霉素、四環(huán)霉素、諾伯霉素、乃卡巴精、こ型受體素類、孔雀綠、還原型孔雀緑、硝基呋喃代謝物及喹諾酮(Quinolone)類，于較佳之實(shí)施例中，本發(fā)明檢測(cè)的動(dòng)物用藥為氯霉素。在本發(fā)明中，所指的動(dòng)物包含任何可食用的動(dòng)物，于較佳的實(shí)施例中，動(dòng)物為水產(chǎn)動(dòng)物，于更佳的實(shí)施例中,此水產(chǎn)動(dòng)物為蝦。本發(fā)明另提供一種檢測(cè)食品中動(dòng)物用藥殘留的方法，包括提供本發(fā)明的萃取檢體內(nèi)殘留的動(dòng)物用藥，將萃取物與試劑混合后，量測(cè)磁減量訊號(hào)，且比對(duì)受測(cè)藥物的磁減量訊號(hào)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以定量動(dòng)物用藥的殘留量。由于每顆單獨(dú)磁性核的磁偶極方向，在沒有外加磁場(chǎng)時(shí)，由于熱運(yùn)動(dòng)，每顆磁性核的磁偶極方向都是指向隨意的方向，而各方向的機(jī)率都是ー樣的，因此，當(dāng)檢測(cè)試劑無外加磁場(chǎng)下，并不會(huì)表現(xiàn)出磁性。當(dāng)外加磁場(chǎng)為交流變化時(shí)，單顆磁性納米粒子因?yàn)榇抛饔?，?huì)隨外加交流磁場(chǎng)轉(zhuǎn)動(dòng)，因而使試劑產(chǎn)生交流磁化率。而當(dāng)試劑與樣品混合后，部分的納米粒子上的抗動(dòng)物用藥抗體會(huì)與待測(cè)樣品中的動(dòng)物用藥相結(jié)合，造成磁性納米粒子體積變大，或多顆納米粒子聚集成磁性納米粒子的叢集。如此ー來，會(huì)使與待測(cè)動(dòng)物用藥相結(jié)合的磁性納米粒子無法再隨著外加交流磁場(chǎng)轉(zhuǎn)動(dòng)，而造成試劑的交流磁化率減?。灰虼?，若待測(cè)樣品中含有越多的殘留動(dòng)物用藥，會(huì)有越多的磁性納米粒子與其結(jié)合，而使試劑的交流磁化率降低越多。因此，檢測(cè)出樣品中磁化率減少多少的量，即可比對(duì)該動(dòng)物用藥的磁減量訊號(hào)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以定量動(dòng)物用藥的殘留量。為配合本發(fā)明的檢驗(yàn)方式，本發(fā)明另提供ー種萃取檢體內(nèi)殘留的動(dòng)物用藥的方法，其步驟為(I)、將檢體打成泥狀，(2)、加入萃取液萃取后離心留上清液，(3)、以低壓真空揮發(fā)法(使用抽氣幫輔協(xié)助萃取液的揮發(fā))，使該上清液濃縮干燥，且(4)、以稀釋液溶解該濃縮干燥物。本發(fā)明方法中的萃取液為有機(jī)溶劑，于較佳的實(shí)施例中，萃取液為こ酸こ酷；于較佳的實(shí)施例中，稀釋液則為ニ甲基亞砜以及磷酸鹽緩沖液。若想要得到較佳的萃取率，步驟(2)可重復(fù)多次以提高萃取率。此萃取方式萃取程序需時(shí)約60分鐘，現(xiàn)行用于LC/MS/MS的萃取程序需時(shí)約180分鐘，大大的縮減了萃取的時(shí)間，并且不需要再用正己烷進(jìn)行繁雜的萃取步驟。本發(fā)明所開發(fā)出的萃取程序，相較于現(xiàn)行用于LC/MS/MS的萃取程序，能有效提升萃取時(shí)效，并增加萃取程序的使用便利性。且本萃取程序中所使用的儀器較為簡易。例如現(xiàn)行用于LC/MS/MS的萃取儀器,需要使用減壓真空濃縮機(jī)(vacuum evaporator),在本發(fā)明的萃取程序中，不需使用，而是以一個(gè)抽氣幫輔協(xié)助萃取液揮發(fā)的簡易的幫輔來取代。如此，不僅可降低檢測(cè)成本，亦有助于將來對(duì)動(dòng)物用藥殘留檢測(cè)的推廣。本發(fā)明的檢測(cè)食品中動(dòng)物用藥殘留的方法，其中的動(dòng)物體內(nèi)藥物包括但不限于氯霉素、羥四環(huán)霉素、氯四環(huán)霉素、脫氧羥四環(huán)霉素、四環(huán)霉素、諾伯霉素、乃卡巴精、こ型受體素類、孔雀綠、還原型孔雀緑、硝基呋喃代謝物及喹諾酮(Quinolone)類，較佳實(shí)施例中的動(dòng)物用藥為氯霉素。


圖Ia為本發(fā)明的檢測(cè)試劑示意圖；圖Ib為檢測(cè)試劑接合待測(cè)物的示意圖；圖2為合成出的氯霉素檢測(cè)試劑中的磁性粒子粒徑分布圖；圖3a為表面接有氯霉素抗體(Anti-CAP)的磁性納米粒子與附有FITC的ニ級(jí)抗體的示意圖；圖3b為表面接有氯霉素抗體(Anti-CAP)的磁性納米粒子與附有FITC的ニ級(jí)抗體在熒光顯微鏡下觀察到受磁鐵吸引的移動(dòng)行為圖；圖3c為表面接有氯霉素抗體(Anti-CAP)的磁性納米粒子與附有FITC的ニ級(jí)抗體在熒光顯微鏡下觀察到受磁鐵吸引的移動(dòng)行為圖； 圖4為氯霉素磁減量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖5為含有不同干擾物的溶液對(duì)氯霉素磁減量訊號(hào)的影響比較圖；圖6為本發(fā)明實(shí)施例四的從蝦中萃取氯霉素的流程圖；圖7為MR以及LC/MS/MS檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)度曲線圖。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例僅代表本發(fā)明幾種不同態(tài)樣及特征，但不用于限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例ー試劑合成將化學(xué)計(jì)量比率為I : 2的硫酸亞鐵七水(FeSO4 · 7H20)與氯化鐵六水(FeCl3 · 6H20)混合的鐵溶液與等量的水性葡聚醣，使其作為四氧化三鐵的接ロ活性劑而能使其分散在水中。該混合物加熱至70-90°C并以強(qiáng)堿溶液滴定形成黒色的四氧化三鐵粒子。叢聚物以及多余的葡聚醣則以離心的方式移除，并以凝膠過濾層析已獲得高度濃縮的磁流體。該試劑可透過PH-7. 4的磷酸鹽緩沖液稀釋以獲得合適的濃度。為了使抗體結(jié)合至磁性納米粒子外層的葡聚醣上，以抗氯霉素抗體(Ab35658-500，Abeam)為例，加入NaIO4溶液至磁性溶液中，使葡聚醣氧化以得到醛基(-CH0)，之后，葡聚醣可透過-CH = N-的連結(jié)與抗氯霉素抗體反應(yīng)，因而能使抗氯霉素抗體共價(jià)的連接到葡聚醣上，如圖Ia所示。未接合的抗氯霉素抗體則可透過磁性分離，從溶液中移除，此試劑可于檢體內(nèi)的待測(cè)樣品結(jié)合，而造成磁化率的降低，如圖Ib所示。使用磁力顯微鏡(magnetic force microscope, MFM),量測(cè)到所合成出的氯霉素檢測(cè)試劑中的磁性粒子粒徑分布如圖2所示。粒徑平均值在63nm，標(biāo)準(zhǔn)差為3. 5nm。為確定磁性粒子表面有接合上氯霉素抗體，本實(shí)施例使用一端接有FITC熒光(異硫氰酸突光素，F(xiàn)luorescein isothiocynate)的ニ級(jí)抗體,來標(biāo)示披覆在磁粒子表面的氯霉素抗體，如圖3a所示。實(shí)驗(yàn)中，加入過量的FITC ニ級(jí)抗體與披覆有氯霉素抗體的磁性粒子混合。充分混合后，再通過磁性分離技木，將混合液中的磁性粒子分離出，而未與磁性粒子表面的氯霉素抗體接合的FITC ニ級(jí)抗體，因不具有磁性，會(huì)留在原混合液中。將分離出的磁性粒子再分散到PBS溶液中。由于熒光標(biāo)記FITC可吸收495nm波長的紫外光，并發(fā)散528nm波長的綠光，因此，將此溶液放入熒光顯微鏡下觀察，首先會(huì)看到綠色亮點(diǎn)，如圖3b中箭頭所指之處。此亮點(diǎn)是FITC所發(fā)出的光亮。繼之，在溶液旁擺上磁鐵。此時(shí)溶液中的磁性粒子會(huì)受到磁鐵的吸引而移動(dòng)。倘若磁性粒子表面已接上氯霉素抗體，附有FITC的ニ級(jí)抗體會(huì)應(yīng)與磁性粒子上的氯霉素抗體結(jié)合，而披覆在磁珠表面上。當(dāng)磁珠受到磁鐵的吸弓I而移動(dòng)時(shí)，圖3b所觀察到的綠色亮點(diǎn)，也會(huì)往磁鐵的方向移動(dòng)。本實(shí)施例中，將磁鐵放于圖3b的下方，磁性粒子應(yīng)該往下方移動(dòng)，因此圖3b的綠色亮點(diǎn)也應(yīng)該往下方移動(dòng)。此預(yù)測(cè)在圖3c中被觀察到,這證實(shí)磁性粒子上確實(shí)已接上氯霉素抗體(Anti-CAP)。實(shí)施例ニ氯霉素含量的磁減量標(biāo)準(zhǔn)曲線建立不同量的氯霉素(C1863-25G，Sigma)溶于pH_7. 4的磷酸鹽緩沖液以獲得不同濃度由O. lng/g至30ng/g的標(biāo)準(zhǔn)氯霉素溶液。每種濃度的標(biāo)準(zhǔn)氯霉素溶液作三重復(fù)的磁減量(IMR)測(cè)試，測(cè)試方法如下40μ I的磁試劑與60 μ I的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)氯霉素溶液于玻璃管中混合，MR檢測(cè)使用的磁試劑濃度為O. lemu/g( = 5mg-Fe/ml)。先以磁性免疫分析儀(XacPro-E IO I, MagQu)量測(cè)未結(jié)合成氯霉素-抗氯霉素抗體-葡聚醣-納米磁性粒子前的X ac,0交流信號(hào)，之后，不同濃度的混合物于室溫下形成氯霉素-抗氯霉素抗體-葡聚醣-納米磁性粒子，量測(cè)并紀(jì)錄其交流信號(hào)Xip透過量測(cè)出的xac,0及Xip可用下列的公式計(jì)算出IMR訊號(hào)。IMR(%) = (xac,0-xac,Φ)/Χ3ε,0χ 100%對(duì)每ー個(gè)給定濃度的樣品溶液，其時(shí)間依賴的Xa。交流信號(hào)皆檢測(cè)三次重復(fù)?？色@得如圖4的MR訊號(hào)為氯霉素濃度(ΦαΡ)函數(shù)的實(shí)驗(yàn)圖。圖4中可見MR訊號(hào)隨著氯霉素濃度的增加而降低，而當(dāng)磁性免疫分析儀(XacPro-ElOl, MagQu)分析的IMR訊號(hào)幾近噪聲(約為虛線所示的O. 82%)時(shí)，氯霉素的濃度低于O. lng/g。由以前的試驗(yàn)結(jié)果可知，待測(cè)物濃度與MR訊號(hào)符合下列的邏輯特函數(shù)(Logistic Function)
權(quán)利要求
1.ー種用于檢測(cè)食品中動(dòng)物用藥殘留的試劑，其特征在于，包括 多個(gè)磁性納米粒子，分布于溶液中，其中磁性納米粒子的構(gòu)造為ー個(gè)磁性核， ー個(gè)界面活性劑層，被覆于該磁性核上，以及 待測(cè)的動(dòng)物用藥抗體，結(jié)合于該界面活性劑層上。
2.如權(quán)利要求I所述的用于檢測(cè)食品中動(dòng)物用藥殘留的試劑，其特征在于，所述磁性核的材料選自 Fe304、Fe203、MnFe2O4, CoFe2O4 和 NiFe204。
3.如權(quán)利要求I所述的用于檢測(cè)食品中動(dòng)物用藥殘留的試劑，其特征在于，所述磁性核的材料為Fe304。
4.如權(quán)利要求I所述的用于檢測(cè)食品中動(dòng)物用藥殘留的試劑，其特征在于，所述動(dòng)物用藥選自氯霉素、羥四環(huán)霉素、氯四環(huán)霉素、脫氧羥四環(huán)霉素、四環(huán)霉素、諾伯霉素、乃卡巴 精、こ型受體素類、孔雀綠、還原型孔雀緑、硝基呋喃代謝物和喹諾酮類。
5.如權(quán)利要求I所述的用于檢測(cè)食品中動(dòng)物用藥殘留的試劑，其特征在于，所述的動(dòng)物用藥為氯霉素。
6.如權(quán)利要求I所述的用于檢測(cè)食品中動(dòng)物用藥殘留的試劑，其特征在于，所述的動(dòng)物用藥為硝基呋喃代謝物。
7.如權(quán)利要求I所述的用于檢測(cè)食品中動(dòng)物用藥殘留的試劑，其特征在于，所述界面活性劑選自有機(jī)酸、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G、葡聚醣和微脂粒。
8.如權(quán)利要求I所述的用于檢測(cè)食品中動(dòng)物用藥殘留的試劑，其特征在于，所述界面活性劑為葡聚醣。
9.如權(quán)利要求I所述的用于檢測(cè)食品中動(dòng)物用藥殘留的試劑，其特征在于，所述的動(dòng)物為水產(chǎn)動(dòng)物。
10.如權(quán)利要求9所述的用于食品中動(dòng)物用藥殘留的試劑，其特征在于，所述水產(chǎn)動(dòng)物為蝦。
全文摘要
本發(fā)明提供一種食品中動(dòng)物用藥殘留的檢測(cè)試劑，該試劑為帶有抗動(dòng)物用藥抗體的生物化磁性納米粒子，其與待測(cè)樣品混合，由于磁性納米粒子上的抗體與動(dòng)物用藥結(jié)合，而造成磁化率的降低，進(jìn)而可得知食品中動(dòng)物用藥殘留的量。
文檔編號(hào)G01N27/76GK102650634SQ20111004439
公開日2012年8月29日 申請(qǐng)日期2011年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月24日
發(fā)明者楊謝樂 申請(qǐng)人:磁量生技股份有限公司