專利名稱：：適用于快速檢測食品中微生物總數(shù)狀況的微量熱法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于食品安全微生物快速檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種適用于檢測食品中的微生物總數(shù)狀況的微量法。
背景技術(shù)：
：目前，國內(nèi)外研究的基于代謝學(xué)的快速檢測技術(shù)快速檢測食品中微生物總數(shù)的方法主要有ATP生物發(fā)光技術(shù)、酶底物法、電化學(xué)技術(shù)、噬菌體技術(shù)等。這些方法大多存在操作繁瑣、檢測時間太長的缺點且受樣品復(fù)雜性的影響，造成結(jié)果的不準(zhǔn)確性。微量熱技術(shù)是一種通過測定細(xì)菌生長時熱量的變化對細(xì)菌進(jìn)行鑒別和檢測的方法。通過敏感的微量熱計對微生物在生長過程中產(chǎn)生的熱量進(jìn)行測量，由于不同細(xì)菌新陳代謝各異，因而經(jīng)測量得到的熱圖譜也各不相同。但是由于放熱量與微生物數(shù)量呈相關(guān)性，一旦建立了參考熱譜圖，就可以對細(xì)菌進(jìn)行鑒定和檢測，使鑒定檢測步驟大為簡化，一般只需數(shù)小時，因此微量熱技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用前景。實驗證實微量熱法可用于檢測食品中的微生物總數(shù)的狀況，采用量熱的方式來進(jìn)行分析，具有通用性強、適用于大多數(shù)生化樣品、在測量時不受其他電化學(xué)活性物質(zhì)或光學(xué)物質(zhì)的干擾等優(yōu)點。但是由于微生物生長放熱量過于微小，利用高精度的MicroDSCIII微量熱儀才能夠檢測出，但由于測量結(jié)果平行性較差，降低了這種方法的實用性。
發(fā)明內(nèi)容為克服微量熱法檢測食品中微生物總數(shù)狀況中微生物生長放熱量過于微小的缺點，本發(fā)明提出一種適用于快速檢測食品中微生物總數(shù)狀況的微量熱法。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種適用于快速檢測食品中微生物總數(shù)狀況的微量熱法，通過檢測微生物生長過程中產(chǎn)生的C02的量檢測食品中微生物總數(shù)狀況。進(jìn)一步地，所述產(chǎn)生的C02的量的計算方法為將產(chǎn)生C02與堿液發(fā)生酸堿化學(xué)反應(yīng)，通過計算被消耗掉的堿液的量，推算出C02的量。進(jìn)一步地，所述被消耗掉的堿液的量的計算方法為計算未與C02發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的相同的堿液與酸中和產(chǎn)生的熱量值，計算與C02發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的剩余堿液與酸中和產(chǎn)生的熱量值，計算兩者之間的熱量差值，算出被消耗的堿的量。本發(fā)明將熱與微生物生長過程緊密結(jié)合在一起，利用微生物生長呼吸產(chǎn)生的C02與堿液反應(yīng)所產(chǎn)生的熱量實現(xiàn)對樣品的檢測。針對熱量過小的問題，改進(jìn)微量熱法的檢測方式，利用酸液再次中和與C02反應(yīng)后剩余的堿液的方式，將待測熱量值放大，在保持結(jié)果準(zhǔn)確的同吋提高了試驗結(jié)果的平行性，使微量熱法真正成為簡易、方便、實用的快速檢測微生物方法。圖1為本發(fā)明檢測C02溶于堿液的實驗裝置；圖2為本發(fā)明驗證檢測C02與堿液反應(yīng)熱量被檢測的可行性的實驗裝置；圖3為本發(fā)明微量熱儀槍測得到的C02與堿液反應(yīng)曲線；圖4為本發(fā)明含菌的標(biāo)準(zhǔn)菌液釋放的C02與堿液反應(yīng)的熱圖譜；圖5為本發(fā)明不含菌的標(biāo)準(zhǔn)菌液釋放的C02與堿液反應(yīng)的熱圖譜；圖6為本發(fā)明測定細(xì)菌總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖7為本發(fā)明測定另一種細(xì)菌總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實施例方式一種適用于快速檢測食品中微生物總數(shù)狀況的微量熱法，通過檢測微生物生L侖過程中產(chǎn)生的C02的量檢測食品中微生物總數(shù)狀況。由于菌體生長放熱是每一種菌體都會產(chǎn)生的，而替代物也需要具有同樣的普遍性。微生物的基本生長過程是C源+0一N源一細(xì)胞量+H"+C02+產(chǎn)物+熱量從上面方程式看出，微生物將各種能源物質(zhì)分解利用，除了生長用之外，還會產(chǎn)生水、C02、各種產(chǎn)物以及熱量。由于微生物是培養(yǎng)在水環(huán)境中，因此無法對產(chǎn)生的水進(jìn)行檢測，而熱量已經(jīng)被否定了，同時不同的微生物所產(chǎn)生的產(chǎn)物是不同的，無法從中找到共同性，因此C02將是最好的選擇。由于食品中易污染的菌體通常都是好氧菌，菌體在呼吸過程中均會產(chǎn)生C02，C02能溶于水(體積比l:l)生成碳酸，即可與堿反應(yīng)。利用二氧化碳與堿液發(fā)生酸堿化學(xué)反應(yīng)放熱，與微生物生長熱相比，熱值有了較大的提升。進(jìn)一步地，本發(fā)明將微生物生長直接放的微小熱量檢測轉(zhuǎn)化為酸堿反應(yīng)放熱檢測，具體檢測方法為用酸去同時中和微量熱儀(MicroDSCIII)樣品池和參比池中的剩余堿液，通過熱量差值推算樣品中微生物總數(shù)。由于整個實驗的檢測時間約8個小時，這些熱量平均在8個小時內(nèi)，所需檢測的熱值仍然是很小的，通過量熱儀器檢測是很難實現(xiàn)的。因此有必要將待測熱量放大，最好能在短時間內(nèi)釋放大量的熱。由于C02在與堿液反應(yīng)時會消耗掉部分堿，反應(yīng)結(jié)束時，樣品池內(nèi)的堿液與參比池內(nèi)的堿液濃度必然會有差別，酸液過量情況下用酸去同時中和樣品池和參比池中的剩余堿液，參比池釋放的熱量必然會大于樣品池的熱量，這兩個熱值的差即為被消耗的堿的量，從而可以推算出這部分堿消耗掉的C02的量，繼而推算出樣品中含有的微生物的量。而且，由于酸堿反應(yīng)屬于無機化學(xué)反應(yīng)，短時間內(nèi)放出的熱量很大，因此，在利用C02與堿反應(yīng)的基礎(chǔ)上，再添加一步用酸去中和剩余的堿，就達(dá)到了放大熱量的目的。為驗證本發(fā)明方法的可行性，本發(fā)明采用圖1所示的實驗裝置檢測C02溶于堿液的可行性，圖l中各部分功能如下蠕動泵l，用于向微生物培養(yǎng)瓶中不斷吹入含氧的空氣；空氣洗脫瓶2，用于處理蠕動泵1吹入含氧的空氣中的C02,如果空氣不經(jīng)處理就直接吹入堿瓶中將會引起堿液的消耗而得出錯誤的結(jié)論；微生物的培養(yǎng)裝置3，包括培養(yǎng)瓶和在培養(yǎng)瓶周圍設(shè)置的溫度環(huán)境，此處的溫度環(huán)境為恒溫(37°C)水浴，因為微生物的生長是有最適合生長的溫度，選擇合適生長的溫度培養(yǎng)能夠加快檢測速度；堿瓶，包括樣品瓶41和參比瓶42，堿瓶中的堿液中含有酸堿指示劑(藍(lán)色)，以方便觀察顏色的變化。培養(yǎng)12小時(h)后，堿瓶中原本藍(lán)色的堿液，參比瓶42中顏色基本沒有變化；而樣品瓶41中由于吸收了細(xì)菌呼吸產(chǎn)生的C02而成為黃色，效果十分明顯?？梢娋w呼吸產(chǎn)生的C02是能夠溶于堿液并與堿液反應(yīng)的。碳酸與堿液反應(yīng)消耗堿，堿液的pH會發(fā)生變化。利用酸堿指示劑會對不同pH的液體產(chǎn)生不同顏色變化的特性，實現(xiàn)對堿液的pH的簡單測定。如果菌體產(chǎn)生的C02消耗了堿，就會引起堿液的顏色發(fā)生變化，可以直觀的觀測到檢測C02溶于堿液是可行的。進(jìn)一步地，通過圖2中的裝置驗證檢測C02與堿液反應(yīng)熱量被檢測的B/行性。如圖2所示，將圖1中的堿瓶換成微量熱儀(本實施例中采用的型號為MicroDSCIII),由于微量熱儀有一種循環(huán)池非常適合氣液混合放熱的檢測，本試驗選擇微量熱儀作微量熱儀器，其余各部分與圖丄相同。圖3為微量熱儀檢測得到的C02與堿液反應(yīng)曲線，圖中橫坐標(biāo)為時間單位(秒)，縱坐標(biāo)為熱量單位(毫瓦mW)。從圖3看出，熱值曲線在后期有一個明顯的上升峰，與菌體的生長過程狀態(tài)十分吻合，由此可知C02與堿液反應(yīng)產(chǎn)生的熱量也是可以被檢測得的。在細(xì)菌培養(yǎng)的優(yōu)化條件下，利用已知濃度的B3菌液作為待測菌液，可得到一條與菌體生長狀態(tài)相關(guān)的熱圖譜，如圖4、圖5所示，圖4為標(biāo)準(zhǔn)菌液釋放的C02與堿液反應(yīng)的熱圖譜(含菌)，圖中橫坐標(biāo)為時間單位(小時)，縱坐標(biāo)為熱量單位(毫瓦mW)，圖5為標(biāo)準(zhǔn)菌液釋放的C02與堿液反應(yīng)的熱圖譜(不含菌)，圖中橫坐標(biāo)為時間單位(小時)，縱坐標(biāo)為熱量單位(毫瓦mW)。通過對熱圖譜中4h到8h的累積放熱值進(jìn)行面積積分，就得到了8h內(nèi)菌體生長釋放出的C02與堿液反應(yīng)產(chǎn)生的熱量值。在相同條件下，用已知的不同細(xì)菌總數(shù)的B3菌懸液重復(fù)試驗，將熱量值與初始細(xì)菌總數(shù)一一對應(yīng)，即得到此種細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6所示。經(jīng)過對所得試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，得到曲線方程為y=0.0007x+l.5375，R2=0.9738。線性關(guān)系非常好。下表1為標(biāo)準(zhǔn)曲線驗證實驗結(jié)果-<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表1從表1中看出，利用最佳培養(yǎng)條件，對未知濃度的B3菌液檢測，同時利用標(biāo)準(zhǔn)曲線及平板計數(shù)法進(jìn)行對比，所得的結(jié)果偏差不大，誤差值為8.86%和0.7%，基本符合要求，證明了這條標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。同時，標(biāo)準(zhǔn)曲線提供了500cfu/ml左右菌量的熱量值，可以滿足大多數(shù)食品安全標(biāo)準(zhǔn)對細(xì)菌總數(shù)的要求，也表明這種方法得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線有著實際應(yīng)用價值。為了驗證這種方法有普遍的應(yīng)用性，選擇另一種菌再次驗證。測定細(xì)菌總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示，從實驗結(jié)果看，對于不同的菌體，利用C02作為測量對象檢測樣品初始細(xì)菌總數(shù)的方法仍然可行，因此這種方法在檢測食品中微生物含量時是完全可行的，并可以普遍應(yīng)用于不同的微生物檢測中。權(quán)利要求1、一種適用于快速檢測食品中微生物總數(shù)狀況的微量熱法，其特征在于通過檢測微生物生長過程中產(chǎn)生的CO2的量檢測食品中微生物總數(shù)狀況。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的適用于快速檢測食品中微生物總數(shù)狀況的微量熱法，其特征在于所述產(chǎn)生的C02的量的計算方法為將產(chǎn)生C02與堿液發(fā)生酸堿化學(xué)反應(yīng)，通過計算被消耗掉的堿液的量，推算出C02的量。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的適用于快速檢測食品中微生物總數(shù)狀況的微量熱法，其特征在于所述被消耗掉的堿液的量的計算方法為計算未與C02發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的相同的堿液與酸中和產(chǎn)生的熱量值，計算與C02發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的剩余堿液與酸中和產(chǎn)生的熱量值，計算兩者之間的熱量差值，算出被消耗的堿的量。全文摘要適用于快速檢測食品中微生物總數(shù)狀況的微量熱法，將微生物生長放熱轉(zhuǎn)化為酸堿反應(yīng)放熱，其方法步驟為1)用檢測菌體生長放出的CO₂替代直接檢測菌體生長熱，利用CO₂與堿液發(fā)生酸堿化學(xué)反應(yīng)放熱；2)用酸去同時中和MicroDSCIII樣品池和參比池中的剩余堿液，參比池內(nèi)的堿液由于未被CO₂中和，釋放的熱量必然會大于樣品池的熱量，這兩個熱值的差即為被消耗的堿的量，從而可以推算出這部分堿消耗掉的CO₂的量，據(jù)測定細(xì)菌總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出樣品中含有的微生物的量。由本檢測方法進(jìn)行微生物總數(shù)檢測大大提高了檢測靈敏度、縮短了檢測時間，適用于量熱法檢測微生物總數(shù)。文檔編號G01N25/20GK101592624SQ200910053379公開日2009年12月2日申請日期2009年6月19日優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日發(fā)明者斐徐,李學(xué)輝,李思超,章海鵬申請人:上海理工大學(xué)