專利名稱：：乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速檢測(cè)試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速4全測(cè)試紙條。
背景技術(shù)：
：乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種世界性疾病。發(fā)展中國家發(fā)病率高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界無癥狀乙肝病毒攜帶者(HBsAg攜帶者)超過2.8億,我國約占9300萬。多^t無癥狀，其中1/3出現(xiàn)肝損害的臨床表現(xiàn)。目前我國有乙肝患者3000萬。乙肝的特點(diǎn)為起病較緩，以亞臨床型及慢性型較常見。無黃疽型HBsAg持續(xù)陽性者易慢性化。本病主要通過血液、母嬰和性接觸進(jìn)行傳播。乙肝疫苗的應(yīng)用是預(yù)防和控制乙型肝炎的根本措施。中國是人口大國，同時(shí)也是"肝炎大國"。我國有40%左右的人感染過HBV,其中約有10。/。的人攜帶HBsAg,快速準(zhǔn)確地檢測(cè)和普查HBsAg，對(duì)于乙型肝炎的預(yù)防、診斷和治療，具有極大的實(shí)用價(jià)值。椐1992年全國病毒性肝炎流行病學(xué)調(diào)查，中國有6億人曾感染過乙型肝炎病毒，大部分已經(jīng)痊愈，但還有1.2億人攜帶乙型肝炎病毒。目前，檢測(cè)以上傳染病最常用的方法是免疫檢測(cè)，此方法以抗原-抗體的特異性識(shí)別為基礎(chǔ)，包括傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和近來興起的膠體金法兩種。膠體金法分為免疫層析和免疫滲濾兩種方式，其中以免疫層析法最為方便、快捷。免疫層析膠體金技術(shù)是新型的診斷技術(shù)，已得到較為廣泛的應(yīng)用，基本原理如下利用膠體金標(biāo)記一種抗原或抗體，在試紙條的硝酸纖維素膜上包被相應(yīng)的配對(duì)抗原或抗體，檢測(cè)時(shí)當(dāng)樣品中含有相應(yīng)的特異性抗體或抗原時(shí)，膠體金標(biāo)記顆粒和樣品中配體相結(jié)合形成復(fù)合物，然后在硝酸纖維素膜上層析，再被包被的抗原或抗體捕獲，形成肉眼可見的檢測(cè)線(T線)，通過檢測(cè)線的有無實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)果的判定。具有操作筒便、反應(yīng)快速、4敏感性高、特異性強(qiáng)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。但現(xiàn)有的試紙條大多以血液為樣品，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，4企測(cè)成本較高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速檢測(cè)試紙條，該試紙條可以用唾液作為樣品，解決了現(xiàn)有試紙條不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，檢測(cè)成本較高的問題。一種乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速檢測(cè)試紙條，包括底板，底板上依次粘貼有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊，所述的膠體金墊上附著有膠體金標(biāo)記的抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗體或第一單克隆抗體；所述的硝酸纖維素膜上包被有由抗乙型肝炎病毒表面抗原的第二單克隆抗體構(gòu)成的檢測(cè)線以及由抗所述的多克隆抗體或第一單克隆抗體的二抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線，所述的多克隆抗體或第一單克隆抗體與所述的第二單克隆抗體相配對(duì)。上述試紙條與傳統(tǒng)的免疫層析檢測(cè)試紙條的檢測(cè)原理相同，上述多克隆抗體與第二單克隆抗體配對(duì)是指多克隆抗體中的所有抗體和第二單克隆抗體與乙型肝炎病毒表面抗原的不同抗原決定簇結(jié)合，上述第一單克隆抗體與第二單克隆抗體相配對(duì)是指兩者與乙型肝炎病毒表面抗原的不同抗原決定簇結(jié)合。所述的膠體金墊上附著有0.15~0.45pg/cm2的膠體金標(biāo)記的抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗體或第一單克隆抗體，在該濃度范圍內(nèi)，可以和大多數(shù)患者唾液中的待測(cè)抗原含量相匹配。所述的膠體金墊通過如下方法制備取膠體直徑為15~35nm的膠體金溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.0~8.2，按每100ml膠體金溶液加入0.75~l.Omg的抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗體或第一單克隆抗體，攪拌后用牛血清蛋白封閉，離心去上清液，加入相同體積的膠體金溶液復(fù)溶，將每毫升溶液均勾鋪在22~50cm2玻璃纖維膜上，干燥后制得膠體金墊。所述的檢測(cè)線中抗乙型肝炎表面抗原的第二單克隆抗體含量為0.05~1.0pg/cm;所述的質(zhì)控線中抗所述的多克隆抗體或第一單克隆抗體的二抗抗體含量為0.05~1.0pg/cm。在該濃度下，正好可以和大多數(shù)唾液中的抗原相匹配。所述的檢測(cè)線和質(zhì)控線包被方法如下取濃度為0.01mol/L、pH為8.0的磷酸緩沖溶液，將第二抗乙型肝炎病毒表面抗原的單克隆抗體和抗所述的多克隆抗體或第一單克隆抗體的二抗抗體分別溶解磷酸緩沖溶液中制得濃度均為0.05-1.0mg/ml的兩種溶液，將該兩種溶液以1~1.5pl/cm的參數(shù)分別在硝酸纖維素膜兩端劃線，干燥后即得檢測(cè)線和質(zhì)控線。所述的試紙條的寬度為2.5~6mm。本發(fā)明還提供了一種上述試紙條的檢測(cè)方法，包括以下步驟取人唾液，用磷酸緩沖溶液稀釋，取50~IO(VI稀釋后的唾液滴在樣品墊上，根據(jù)檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)的顯色狀態(tài)，判斷檢測(cè)結(jié)果。如C、T線均出現(xiàn)，判定樣品為陽性；C線出現(xiàn)，T線不出現(xiàn)，判定樣品為陰性；C、T線都不出現(xiàn)或者C線不出現(xiàn)T線出現(xiàn)，均判定試紙無效。本發(fā)明試紙條采用膠體金標(biāo)記技術(shù)，檢測(cè)唾液中的乙型肝炎病毒表面抗原成分，從而判斷是否感染乙肝病毒，具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和自檢，具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施方式實(shí)施例1膠體金墊的制備以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑15nm的膠體金溶液，制備完成后取100ml膠體金溶液于燒杯內(nèi)，用O.IMK2C03調(diào)至pH8.0,按100ml膠體金溶液加入0.75mg相應(yīng)抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗體(上海領(lǐng)潮生物科技有限^^司)，室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入重量百分比為5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉1小時(shí)，12000rpm、4'C離心30分鐘，棄上清，用膠體金溶液復(fù)溶至100ml,按lml溶液鋪22cm2的比例，將溶液均勻地鋪在玻璃纖維膜上，37"C干燥30分鐘，制成膠體金墊。硝酸纖維素膜的包被將抗乙型肝炎病毒表面抗原的第二單克隆抗體(上海領(lǐng)潮生物科技有限公司)以及抗上述多克隆抗體的二抗抗體(羊抗鼠、上海領(lǐng)潮生物科技有限公司)溶解在0.01M、pH8.0磷酸緩沖液(PBS)配制成0.05mg/ml的溶液，用噴膜儀分別在硝酸纖維素膜兩端以1.5pl/cm的參數(shù)進(jìn)行劃線，包被T線和C線，劃線后將硝酸纖維素膜在室溫干燥8小時(shí)。上述抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗體與第二單克隆抗體相配對(duì)。檢測(cè)試紙的組裝在干燥室內(nèi)，溫度2025。C,濕度小于30%，將樣品墊(玻璃纖維膜)、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊(吸水試紙)粘貼在底板上，其中硝酸纖維素膜位于底板中部，硝酸纖維素膜包被有T線的一端與膠體金墊的1/3^荅接，包被有C線的一端與吸樣墊的1/10搭接，樣品墊與膠體金墊的l/5搭接。最后切成寬度為2.5mm的試紙條，也可將試紙條裝入一個(gè)塑料卡中制成檢測(cè)卡。實(shí)施例2膠體金墊的制備以氯金酸-種檬酸三鈉還原法制備直徑35nm的膠體金溶液，制備完成后取100ml膠體金溶液于燒杯內(nèi)，用0.1MK2C03調(diào)至pH8.2，向膠體金溶液加入lmg相應(yīng)抗乙型肝炎病毒表面抗原的第一單克隆抗體(上海領(lǐng)潮生物科技有限公司)，室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入重量百分比為5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉1小時(shí)，12000rpm、4。C離心30分鐘，棄上清，用膠體金稀釋液復(fù)溶至100ml，按lml溶液鋪50cm2的比例，將溶液均勻的鋪在玻璃纖維膜上，37。C干燥30分鐘，制成膠體金墊。硝酸纖維素膜的包被將抗乙型肝炎病毒表面抗原的第二單克隆抗體(上海領(lǐng)潮生物科技有限公司)以及抗上述第一單克隆抗體的二抗抗體(羊抗鼠、上海領(lǐng)潮生物科技有限公司)溶解在O.OIM、pH8.2磷酸緩沖液(PBS)配制成0.1mg/ml的溶液，用噴膜儀分別在硝酸纖維素膜兩端以lpl/cm的參數(shù)進(jìn)行劃線，包被T線和C線，劃線后將硝酸纖維素膜在室溫干燥8小時(shí)。上述抗乙型肝炎病毒表面抗原的第一單克隆抗體與第二單克隆抗體相配對(duì)。檢測(cè)試紙的組裝在干燥室內(nèi)，溫度20~25°C,濕度小于30%,將樣品墊(玻璃纖維膜)、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊(吸水試紙)依次粘貼在底板上，其中硝酸纖維素膜位于底板中部，硝酸纖維素膜包被有T線的一端與膠體金墊的1/3搭接，包被有C線的一端與吸樣墊的1/10搭接，樣品墊與膠體金墊的1/5搭接。最后切成寬度為6mm的試紙條，也可將試紙條裝入一個(gè)塑料卡中制成檢測(cè)卡。臨床樣品試驗(yàn)待檢人在采集唾液樣品前30分鐘禁食，取每位待檢人唾液0.5ml于紙杯中，用吸管取兩滴滴加到濃度0.02M、pH8.0的磷酸緩沖溶液中稀釋，取稀釋的唾液lOOpl加到樣品墊中，肉目艮觀測(cè)30分鐘，記錄T線和C線的顯色狀態(tài)。同時(shí)將唾液樣品用乙肝病毒表面抗原ELISA試劑盒檢測(cè)，若兩者檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果不一致，再以另外兩種乙肝病毒表面抗原ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，若兩種或以上的ELISA試劑盒為陽性，判定結(jié)果為陽性，兩種或以上的ELISA試劑盒為陰性，判定結(jié)果為陰性。收集唾液樣品150份，其中ELISA試劑盒檢測(cè)出陽性樣品34份，本發(fā)明試紙條(實(shí)施例1)檢測(cè)出陽性樣品35份，具體結(jié)果如下表1所示表1本發(fā)明試紙條對(duì)臨床樣品乙型肝炎病毒表面抗原的檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1、一種乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速檢測(cè)試紙條，包括底板，底板上依次粘貼有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊，其特征在于所述的膠體金墊上附著有膠體金標(biāo)記的抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗體或第一單克隆抗體；所述的硝酸纖維素膜上包被有由抗乙型肝炎病毒表面抗原的第二單克隆抗體構(gòu)成的檢測(cè)線以及由抗所述的多克隆抗體或第一單克隆抗體的二抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線，所述的多克隆抗體或第一單克隆抗體與所述的第二單克隆抗體相配對(duì)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速檢測(cè)試紙條，其特征在于所述的膠體金墊上附著有0.150.45ug/cn^的膠體金標(biāo)記的抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗體或第一單克隆抗體。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述的膠體金墊通過如下方法制備取膠體直徑為15~35nm的膠體金溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.0~8.2,按每100ml膠體金溶液加入0.75~l.Omg的抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗體或第一單克隆抗體，攪拌后用牛血清蛋白溶液封閉，離心去上清液，加入相同體積的膠體金溶液復(fù)溶，然后將每毫升溶液均勻鋪在22~50cm2玻璃纖維膜上，干燥后制得膠體金墊。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速檢測(cè)試紙條，其特征在于所述的檢測(cè)線中抗乙型肝炎表面抗原的第二單克隆抗體含量為0.05~lpg/cm;所述的質(zhì)控線中抗所述的多克隆抗體或第一單克隆抗體的二抗抗體含量為0.05~ljig/cm。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述的^r測(cè)線和質(zhì)控線包^f皮方法如下取濃度為0.01mol/L、pH為8.0~8.2的磷酸緩沖溶液，將抗乙型肝炎病毒表面抗原的第二單克隆抗體和抗所述的多克隆抗體或第一單克隆抗體的二抗抗體分別溶解磷酸緩沖溶液中制得濃度均為0.05~lmg/ml的兩種溶液，將該兩種溶液以l~1.5(al/cm的參數(shù)分別在硝酸纖維素膜兩端劃線，干燥后即得檢測(cè)線和質(zhì)控線。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速檢測(cè)試紙條，其特征在于所述的試紙條的寬度為2.5-6mm。7、一種權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)方法，包括以下步驟取人唾液，用磷酸緩沖溶液進(jìn)行稀釋，取50-100^1稀釋后的唾液滴在樣品墊上，根據(jù)檢測(cè)線和質(zhì)控線的顯色狀態(tài)，判斷檢測(cè)結(jié)果。全文摘要本發(fā)明公開了一種乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速檢測(cè)試紙條，包括底板，底板上依次粘貼有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊，所述的膠體金墊上附著有膠體金標(biāo)記的抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗體或第一單克隆抗體；所述的硝酸纖維素膜上包被有由抗乙型肝炎病毒表面抗原的第二單克隆抗體構(gòu)成的檢測(cè)線以及由抗所述的多克隆抗體或第一單克隆抗體的二抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線，所述的多克隆抗體或第一單克隆抗體與所述的第二單克隆抗體相配對(duì)。本發(fā)明試紙條采用膠體金標(biāo)記技術(shù)，檢測(cè)唾液中的乙型肝炎病毒表面抗原成分，從而判斷是否感染乙肝病毒，具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和自檢，具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N33/577GK101614743SQ20091010103公開日2009年12月30日申請(qǐng)日期2009年7月30日優(yōu)先權(quán)日2009年7月30日發(fā)明者李洪江,鄭隆泗申請(qǐng)人:杭州艾力康醫(yī)藥科技有限公司