一種快速檢測維生素d的試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測維生素D的試紙條，包括不吸水的支撐板，所述支撐板上依次設置有樣品墊、結(jié)合墊、層析膜和吸收墊，所述結(jié)合墊上包被有標記物標記的維生素D與載體蛋白的偶聯(lián)物，所述層析膜為硝酸纖維素膜，層析膜上設置有質(zhì)控C線和檢測T線，所述檢測T線位于結(jié)合墊和質(zhì)控C線之間，檢測T線上包被有維生素D特異性抗體，質(zhì)控C線上包被有能夠與載體蛋白結(jié)合的特異性抗體。本發(fā)明的試紙條使用方便，操作簡單，檢測速度快，容易普及到基層醫(yī)療單位使用，滿足市場需求，能夠填補國內(nèi)外市場空白，試紙條結(jié)果判斷容易，用符號表示，擺脫了維生素D檢測對設備、儀器以及人員的特殊要求。
【專利說明】-種快速檢測維生素 D的試紙條

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種快速檢測維生素 D的試紙條。

【背景技術(shù)】
[0002] 維生素 D在調(diào)節(jié)人體內(nèi)鈣代謝、維持肌肉骨骼和免疫系統(tǒng)的健康和穩(wěn)定、預防部 分惡性腫瘤發(fā)生有著不可或缺的作用。聯(lián)合國衛(wèi)生組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球大約90%人口 患有維生素 D不足之癥。由于維生素 D的分子特性（高度親脂性）使其分離提純難度增 力口，檢測條件要求高，限制了維生素 D檢測在臨床的推廣應用，也限制了我們獲得更多的有 關(guān)維生素 D的信息。到目前為止，已經(jīng)報道并被臨床接受的人血清維生素 D檢測方法有試 劑盒檢測以及儀器檢測兩類。
[0003] 一、儀器檢測。1)直接檢測法（Direct Detection Methodology)。這類方法中最 著名的是液相色譜分析法（HPLC)以及后來改進了的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法（LC/MS)。 2)自動分析檢測儀（Automated Instrumentation Methodology)。儀器檢測其優(yōu)點是精確 度高，缺點是儀器投資大，樣品必須有機溶劑提取并純化，分析人員需要經(jīng)過專業(yè)培訓，并 且分析過程中有機溶劑消耗大，不利于環(huán)境保護。目前直接分析法多局限于研究型實驗室 使用。
[0004] 美國的 Nichols Institute Diagnostics 公司，DiaSorin 公司以及德國 Roche Diagnostics公司分別宣布其研發(fā)出血清維生素 D自動檢測儀器。應用此類自動分析儀， 血清樣品不需要任何前期處理即可直接進行檢測。此類儀器檢測的原理是化學熒光分析技 術(shù)。其優(yōu)點是儀器自動完成樣品的分離，提取，檢測，數(shù)據(jù)整理，結(jié)果判斷等步驟。樣品的檢 測周期約一個半小時。其缺點是自動分析儀價格尤其昂貴，限制了其的推廣使用。
[0005] 二、試劑盒檢測，按作用原理又分為以下幾種：
[0006] 1)競爭性蛋白結(jié)合分析法（CPBA)
[0007] 2)放射免疫分析法（RIA)
[0008] 3)酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)
[0009] 目前已有的試劑盒檢測分析方法基本上均使用免疫反應板，通過直接或間接酶聯(lián) 免疫反應檢測樣品中維生素 D含量。在這些檢測方法中，絕大多數(shù)需要進行樣品的有機溶 劑提取，一些方法中反應物有同位素標記，易造成環(huán)境有機溶劑以及放射性物質(zhì)污染，且檢 測必須由專業(yè)人員在實驗室通過儀器操作完成。平均檢測過程在100分鐘左右。
[0010] 由上述分析可以看出，目前已有的維生素 D檢測方法，無論儀器檢測或酶聯(lián)免疫 反應板檢測，其均存在著儀器設備投資高，檢測人員要求高，檢測過程中有機溶劑或放射性 物質(zhì)污染等問題，使得維生素 D檢測普及受到限制，這也造成臨床用藥缺少檢驗指標支持， 用藥帶有極大的盲目性，甚至給患者身體帶來更多的危害。為此，開發(fā)一種操作簡便、快速、 價格低、適合基層推廣使用的血清維生素 D檢測方法是未來的發(fā)展趨勢，也是臨床工作者 和廣大患者的迫切要求。
[0011] 側(cè)向?qū)恿髅庖叻治黾夹g(shù)興起在上世紀90年代，在近10年有了長足的發(fā)展，已經(jīng)被 廣泛應用于快速檢測診斷領(lǐng)域。而維生素 D的檢測由于樣品提純過程復雜，樣品不穩(wěn)定，標 準參照物難得等等原因，一直未能在臨床廣泛開展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速檢測維 生素 D的試紙條。該試紙條是基于競爭性免疫結(jié)合原理，采用側(cè)向?qū)游龇z測維生素 D濃 度，其檢測方法簡單、結(jié)果易于判斷、檢測成本低廉，適合在基層醫(yī)院、診所以及體檢中心等 單位使用，對于降低維生素 D檢測成本、普及人體維生素 D檢測、減少臨床盲目用藥具有重 要意義。
[0013] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種快速檢測維生素 D的試紙 條，包括不吸水的支撐板，所述支撐板上依次設置有樣品墊、結(jié)合墊、層析膜和吸收墊，其特 征在于，所述結(jié)合墊上包被有標記物標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物，所述層析膜為 硝酸纖維素膜，層析膜上設置有質(zhì)控C線和檢測T線，所述檢測T線位于結(jié)合墊和質(zhì)控C線 之間，檢測T線上包被有維生素 D特異性抗體，質(zhì)控C線上包被有能夠與載體蛋白結(jié)合的特 異性抗體。
[0014] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，所述標記物為膠體金顆粒。
[0015] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，所述載體蛋白為牛血清白蛋白，能夠與 載體蛋白結(jié)合的特異性抗體為BSA免疫球蛋白。
[0016] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，所述載體蛋白為雞卵清白蛋白，能夠與 載體蛋白結(jié)合的特異性抗體為兔抗雞卵清白蛋白。
[0017] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，所述維生素 D為25-羥基維生素 D3或 25-羥基維生素 D2。
[0018] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，所述檢測T線和質(zhì)控C線之間的距離為 lcm〇
[0019] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，所述維生素 D特異性抗體為鼠抗維生素 D單克隆抗體，維生素 D特異性抗體的包被量為2 μ L，包被濃度為0. 25mg/mL?5mg/mL。
[0020] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，所述能夠與載體蛋白結(jié)合的特異性抗體 的包被量為2 μ L，包被濃度為0· lmg/mL?1. Omg/mL。
[0021] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，所述標記物標記的維生素 D與載體蛋白 的偶聯(lián)物的制備方法包括以下步驟：
[0022] 步驟一、將lmg?10mg維生素 D溶解于100 μ L有機溶劑中，然后在攪拌條件下 向10mL濃度為0. lmg/mL?5mg/mL的載體蛋白溶液中逐滴加入溶解后的維生素 D，再逐滴 加入體積百分比濃度為50%的戊二醛水溶液至溶液中戊二醛的體積百分比濃度為1 %? 3%，攪拌5min?20min后移至4°C下攪拌反應16h?18h，反應后的反應液用PBS緩沖溶 液在4°C下透析8h，透析過程中換液2?3次，透析物離心后取上清液，最后將上清液用 0. 45 μ m濾膜過濾，得到維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物，-20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0023] 步驟二、向標記物溶液中加入步驟一中所述維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物至溶液 中維生素 D的終濃度為10 μ g/mL?1000 μ g/mL，攪拌5min后加入BSA溶液至BSA的質(zhì)量 體積百分濃度為〇. 1 %?1 %，在4°C下避光攪拌反應30min后加入聚乙二醇溶液至聚乙二 醇的質(zhì)量體積百分濃度為0. 1 %?1 %，繼續(xù)反應5min后離心，棄去上清，將沉淀復溶后得 到標記物標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物。
[0024] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，步驟一中所述有機溶劑為正己烷、乙腈、 二甲基亞砜或1，4-二氧六環(huán)。
[0025] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：
[0026] 1、本發(fā)明的快速檢測維生素 D的試紙條是基于競爭性免疫結(jié)合原理，采用側(cè)向?qū)?析法檢測維生素 D濃度，其檢測方法簡單、結(jié)果易于判斷、檢測成本低廉，適合在基層醫(yī)院、 診所以及體檢中心等單位使用，對于降低維生素 D檢測成本、普及人體維生素 D檢測、減少 臨床盲目用藥具有重要意義。
[0027] 2、本發(fā)明的試紙條使用方便，操作簡單，檢測速度快，容易普及到基層醫(yī)療單位使 用，滿足市場需求，能夠填補國內(nèi)外市場空白。
[0028] 3、本發(fā)明的試紙條結(jié)果判斷容易，用符號表示，擺脫了維生素 D檢測對設備、儀器 以及人員的特殊要求。
[0029] 4、本發(fā)明的試紙條不僅可采用膠體金顆粒作為標記物，還可采用熒光化學物質(zhì)、 染色劑、乳膠顆粒、酶或磁性顆粒作為標記物，按照常規(guī)方法進行維生素 D與載體蛋白的偶 聯(lián)物的標記。
[0030] 下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的詳細描述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1為本發(fā)明試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0032] 附圖標記說明：
[0033] 1-支撐板；2-樣品墊；3-結(jié)合墊；
[0034] 4一層析膜；5-檢測T線；6-質(zhì)控C線；
[0035] 7-吸收墊。

【具體實施方式】
[0036] 實施例1標記物標記的維生素 D (25-羥基維生素 D3)與載體蛋白的偶聯(lián)物的制備
[0037] 步驟一、將 lmg 維生素 D (25〇HD33_HS，購于 Toronto Research Chemicals 公司）溶 解于100 μ L有機溶劑（正己烷、乙腈、二甲基亞砜或1，4-二氧六環(huán)）中，然后在攪拌條件 下向10mL濃度為0. lmg/mL的載體蛋白（牛血清白蛋白BSA，或雞卵清白蛋白0VA)溶液中 逐滴加入溶解后的維生素 D，再逐滴加入體積百分比濃度為50%的戊二醛水溶液至溶液中 戊二醛的體積百分比濃度為1%，攪拌5min后移至4°C下攪拌反應16h，反應后的反應液用 PBS緩沖溶液在4°C下透析8h，透析過程中換液2?3次，透析物離心后取上清液，最后將上 清液用〇. 45 μ m濾膜過濾，得到維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物，-20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0038] 步驟二、向40nm膠體金溶液（0D1. 0,購于上海杰一生物公司）中加入步驟一中所 述維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物至溶液中維生素 D的終濃度為10 μ g/mL，攪拌5min后加入 BSA溶液至BSA的終濃度（質(zhì)量體積百分濃度）為0· 1 % (即100mL溶液中含0· lg BSA)， 在4°C下避光攪拌反應30min后加入聚乙二醇溶液至聚乙二醇的終濃度（質(zhì)量體積百分濃 度）為0. 1% (S卩100mL溶液中含0. lg聚乙二醇），繼續(xù)反應5min后離心，棄去上清，將沉 淀復溶后得到標記物膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物（含維生素 D30ng/mL? 40ng/mL)〇
[0039] 實施例2標記物標記的維生素 D (25-羥基維生素 D2)與載體蛋白的偶聯(lián)物的制備
[0040] 步驟一、將 5mg 維生素 D (25〇HD2,購于 Toronto Research Chemicals 公司）溶解 于100 μ L有機溶劑（正己烷、乙腈、二甲基亞砜或1，4-二氧六環(huán)）中，然后在攪拌條件下 向10mL濃度為2mg/mL的載體蛋白（牛血清白蛋白BSA，或雞卵清白蛋白0VA)溶液中逐滴 加入溶解后的維生素 D，再逐滴加入體積百分比濃度為50%的戊二醛水溶液至溶液中戊二 醛的體積百分比濃度為2%，攪拌10min后移至4°C下攪拌反應17h，反應后的反應液用PBS 緩沖溶液在4°C下透析8h，透析過程中換液2?3次，透析物離心后取上清液，最后將上清 液用0. 45 μ m濾膜過濾，得到維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物，-20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0041] 步驟二、向40nm膠體金溶液（0D1. 0,購于上海杰一生物公司）中加入步驟一中所 述維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物至溶液中維生素 D的終濃度為100 μ g/mL，攪拌5min后加 入BSA溶液至BSA的終濃度（質(zhì)量體積百分濃度）為0. 5%，在4°C下避光攪拌反應30min 后加入聚乙二醇溶液至聚乙二醇的終濃度（質(zhì)量體積百分濃度）為0. 5%，繼續(xù)反應5min 后離心，棄去上清，將沉淀復溶后得到標記物膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物 (含維生素 D30ng/mL ?40ng/mL)。
[0042] 實施例3標記物標記的維生素 D (25-羥基維生素 D3)與載體蛋白的偶聯(lián)物的制備
[0043] 步驟一、將 10mg 維生素 D (25〇HD3,購于 Toronto Research Chemicals 公司）溶解 于100 μ L有機溶劑（正己烷、乙腈、二甲基亞砜或1，4-二氧六環(huán)）中，然后在攪拌條件下 向10mL濃度為5mg/mL的載體蛋白（牛血清白蛋白BSA，或雞卵清白蛋白0VA)溶液中逐滴 加入溶解后的維生素 D，再逐滴加入體積百分比濃度為50%的戊二醛水溶液至溶液中戊二 醛的體積百分比濃度為3%，攪拌20min后移至4°C下攪拌反應18h，反應后的反應液用PBS 緩沖溶液在4°C下透析8h，透析過程中換液2?3次，透析物離心后取上清液，最后將上清 液用0. 45 μ m濾膜過濾，得到維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物，-20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0044] 步驟二、向40nm膠體金溶液（購于上海杰一生物公司）中加入步驟一中所述維 生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物至溶液中維生素 D的終濃度為1000 μ g/mL，攪拌5min后加入 BSA溶液至BSA的終濃度（質(zhì)量體積百分濃度）為1. 0%，在4°C下避光攪拌反應30min后 加入聚乙二醇溶液至聚乙二醇的終濃度（質(zhì)量體積百分濃度）為1. 0%，繼續(xù)反應5min后 離心，棄去上清，將沉淀復溶后得到膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物（含維生素 D30ng/mL ?40ng/mL)。
[0045] 實施例4維生素 D單克隆抗體的制備
[0046] 以實施例1、實施例2或?qū)嵤├?的步驟一中制備的維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物 作為免疫原，按50 μ g/只?200 μ g/只的劑量免疫Balb/c小鼠，使其產(chǎn)生抗血清；約6-8 周后取小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合得到雜交瘤細胞；所得雜交瘤細胞應用25-輕 基維生素 D3包被的免疫反應板，經(jīng)過酶聯(lián)免疫反應篩選得到穩(wěn)定分泌抗25-羥基維生素 D3的單克隆抗體的細胞株，篩選得到的細胞株經(jīng)過克隆復選，復選采用25-羥基維生素 D2 包被的免疫反應板，得到穩(wěn)定分泌抗25-羥基維生素 D的單克隆抗體的細胞株；在DMEM 培養(yǎng)液中擴增培養(yǎng)細胞，細胞培養(yǎng)上清液經(jīng)過離心，濃縮，經(jīng)G蛋白（GE Healthcare Life Sciences)層析柱純化，得到純化后的鼠抗維生素 D單克隆抗體，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0047] 實施例5膠體金標記維生素 D結(jié)合墊的制備
[0048] 將玻纖膜（Ahlstrom8964)剪成5mm寬的長條，將剪好的玻纖膜置于平坦干凈的玻 璃板上，將實施例1、實施例2或?qū)嵤├?制備的膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián) 物用稀釋液稀釋1. 5倍，然后按每試紙條20 μ L?50 μ L的量均勻地加在玻纖膜上，使玻纖 膜均勻浸透，在37°C烘干（60分鐘），防潮避光保存?zhèn)溆?，所述稀釋液為含有蔗糖、Tween-20 和PEG20000的四硼酸鈉溶液，稀釋液中四硼酸鈉的濃度為2mM?20mM，每100mL稀釋液中 含有 0· 5g ?10g 蔗糖，0· lmL ?lmL Tween-20 和 0· 5g ?5g PEG20000。
[0049] 實施例6層析膜的制備
[0050] 層析膜選醋酸纖維素膜（millipore HF13502)，裁成30mm寬的條形；檢測T線5上 包被鼠抗維生素 D單克隆抗體，包被濃度0· 25mg/mL?5mg/mL(優(yōu)選0· 25mg/mL、0. 5mg/mL、 lmg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL或5mg/mL)，按2 μ L/試紙條抗體量制備，當采用的載體蛋 白為牛血清白蛋白時，質(zhì)控C線6上包被BSA免疫球蛋白（購于上海瑞齊生物技術(shù)有限公 司），包被濃度為 〇· lmg/mL ?1. Omg/mL (優(yōu)選 0· lmg/mL、0. 3mg/mL、0. 5mg/mL、0. 8mg/mL 或 1. Omg/mL)，按2 μ L/試紙條的抗體量制備，當采用的載體蛋白為雞卵清白蛋白時，質(zhì)控C線 6 上包被兔抗 0VA，包被濃度為 0. lmg/mL ?1. 0mg/mL (優(yōu)選 0. lmg/mL、0. 3mg/mL、0. 5mg/mL、 0. 8mg/mL或1. Omg/mL)，按2 μ L/試紙條的抗體量制備，將裁好的醋酸纖維素膜固定于干凈 的有機玻璃板上，應用劃膜儀（上海杰一生物科技公司）制備檢測T線5以及質(zhì)控C線6, 檢測T線5與質(zhì)控C線6間距l(xiāng)cm ;將制備好的層析膜在室溫下真空干燥1小時，密封避光 防潮保存。
[0051] 實施例7組裝試紙條
[0052] 試紙條支撐板1購于上海杰一生物科技公司，支撐板1長7. 8cm，寬5mm ;將實施例 6制備的層析膜裁成寬5mm，長3cm的層析膜4,使檢測T線位于層析膜4的中央；樣品墊2 尺寸5mmX2. 3cm，吸收墊7尺寸5mmX2. 0cm ;按圖1所示，將樣品墊2、結(jié)合墊3、層析膜4 和吸收墊7依次粘貼于支撐板1上，樣品墊2和結(jié)合墊3之間、結(jié)合墊3和層析膜4之間以 及層析膜4和吸收墊7之間均有1_?2_的重疊，得到快速檢測維生素 D的試紙條，2°C? 8°C的環(huán)境中避光防潮儲存，有效期12個月。
[0053] 實施例8試紙條的應用
[0054] 標準濃度樣品制備：按照實施例1、實施例2或?qū)嵤├?中步驟一的方法制備 25-羥基維生素 D與BSA的偶聯(lián)物；HPLC檢測偶聯(lián)物中25-羥基維生素 D的濃度；通過離 心濃縮（Millipore Amicon centrifugal filter)得到標準樣品，并使用BSA濃度為lmg/mL 的PBS溶液稀釋標準樣品，得到維生素 D濃度分別為：0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、 30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、60ng/mL 和 80ng/mL 的標準濃度樣品，其中 0ng/mL 樣品為 BSA 濃度lmg/mL的PBS溶液。
[0055] 標準濃度樣品檢測：取20 μ L的標準濃度樣品加入樣品墊靠近結(jié)合墊的區(qū)域；將 150 μ L檢測劑逐滴加入樣品墊靠近試紙條末端的部位，10?15分鐘后觀察結(jié)果；所述檢 測試劑為含有蔗糖、Tween-20和PEG20000的四硼酸鈉溶液，檢測試劑中四硼酸鈉的濃度為 2mM?20mM,每100mL檢測試劑中含有0. 5g?10g鹿糖，0. lmL?lmL Tween-20和0. 5g? 5gPEG20000〇
[0056] 本發(fā)明試紙條的檢測原理為：待檢測樣品與檢測試劑混合液由毛細管引力引導沿 試紙條向反應膜擴散，混合液經(jīng)過結(jié)合墊時，結(jié)合墊所包被的膠體金標記的維生素 D與載 體蛋白的偶聯(lián)物被釋放并隨混合液沿反應膜擴散；待檢測樣品中的維生素 D與結(jié)合墊釋放 的膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物競爭與檢測T線包被的維生素 D單克隆抗體 結(jié)合；若待檢樣品中維生素 D的含量高于所設定的檢測閾值，則檢測T線包被的抗體的結(jié)合 位點由樣品維生素 D完全封閉，阻止膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物與之結(jié)合， 檢測T線不顯色，而膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物可與質(zhì)控C線包被的能夠 與載體蛋白結(jié)合的特異性抗體相結(jié)合，質(zhì)控C線顯色；若待檢測樣品液中維生素 D含量低于 所設檢測閾值，則檢測T線包被的抗體的結(jié)合位點不能被完全封閉，進而膠體金標記的維 生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物與層析膜上維生素 D抗體結(jié)合，檢測T線顯色，同時質(zhì)控C線抗 體也可與膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物結(jié)合，質(zhì)控C線顯色；若質(zhì)控區(qū)不顯 不，則試紙條失效。
[0057] 結(jié)果判斷：
[0058] 陰性：檢測T線不顯色，質(zhì)控C線顯出條帶，判斷為陰性，用表示，代表所檢樣 品維生素 D含量超過所設檢測閾值（維生素 D含量充足）；
[0059] 陽性：檢測T線和質(zhì)控C線均顯示出條帶，判斷為陽性，用" + "表示，代表所檢樣品 中維生素 D含量低于所設檢測閾值（維生素 D含量不足）；
[0060] 無效：當質(zhì)控C線不顯色，則判斷為無效試紙條。
[0061] 標準濃度樣品檢測結(jié)果見表1。
[0062] 表1標準濃度維生素 D樣品檢測結(jié)果
[0063]

【權(quán)利要求】
1. 一種快速檢測維生素 D的試紙條，包括不吸水的支撐板（1)，所述支撐板⑴上依次 設置有樣品墊（2)、結(jié)合墊（3)、層析膜（4)和吸收墊（7)，其特征在于，所述結(jié)合墊（3)上包 被有標記物標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物，所述層析膜（4)為硝酸纖維素膜，層析膜 (4) 上設置有質(zhì)控C線（6)和檢測T線（5)，所述檢測T線（5)位于結(jié)合墊（3)和質(zhì)控C線 (6)之間，檢測T線（5)上包被有維生素 D特異性抗體，質(zhì)控C線（6)上包被有能夠與載體 蛋白結(jié)合的特異性抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，所述標記物為 膠體金顆粒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，所述載體蛋白 為牛血清白蛋白，能夠與載體蛋白結(jié)合的特異性抗體為BSA免疫球蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，所述載體蛋白 為雞卵清白蛋白，能夠與載體蛋白結(jié)合的特異性抗體為兔抗雞卵清白蛋白。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，所述維生素 D 為25-輕基維生素 D3或25-輕基維生素 D2。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，所述檢測T線 (5) 和質(zhì)控C線（6)之間的距離為lcm。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，所述維生素 D 特異性抗體為鼠抗維生素 D單克隆抗體，維生素 D特異性抗體的包被量為2 μ L，包被濃度為 0· 25mg/mL ?5mg/mL〇
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，所述能夠與載 體蛋白結(jié)合的特異性抗體的包被量為2 μ L，包被濃度為0. lmg/mL?1. Omg/mL。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，所述標記物標 記的維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物的制備方法包括以下步驟： 步驟一、將lmg?10mg維生素 D溶解于100 μ L有機溶劑中，然后在攪拌條件下向10mL 濃度為〇. lmg/mL?5mg/mL的載體蛋白溶液中逐滴加入溶解后的維生素 D，再逐滴加入體積 百分比濃度為50%的戊二醛水溶液至溶液中戊二醛的體積百分比濃度為1%?3%，攪拌 5min?20min后移至4°C下攪拌反應16h?18h，反應后的反應液用PBS緩沖溶液在4°C下 透析8h，透析過程中換液2?3次，透析物離心后取上清液，最后將上清液用0. 45 μ m濾膜 過濾，得到維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物，-20°C保存?zhèn)溆茫? 步驟二、向標記物溶液中加入步驟一中所述維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物至溶液中維 生素 D的終濃度為10 μ g/mL?1000 μ g/mL，攪拌5min后加入BSA溶液至BSA的質(zhì)量體積 百分濃度為〇. 1%?1%，在4°C下避光攪拌反應30min后加入聚乙二醇溶液至聚乙二醇的 質(zhì)量體積百分濃度為〇. 1 %?1 %，繼續(xù)反應5min后離心，棄去上清，將沉淀復溶后得到標 記物標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯(lián)物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，步驟一中所 述有機溶劑為正己烷、乙腈、二甲基亞砜或1，4-二氧六環(huán)。
【文檔編號】G01N33/531GK104062440SQ201410308883
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】韓雅君 申請人:韓雅君