專利名稱：糖尿病自身抗體譜免疫印跡試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬糖尿病血清學(xué)診斷技術(shù)范疇，具體為1型糖尿病自身抗體譜血清學(xué)免疫印跡 試劑盒的研發(fā)，可用于1型糖尿病的診斷、療效和預(yù)后判斷及與其它類型糖尿病的鑒別診 斷的醫(yī)學(xué)臨床領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖尿病(DM)是以高血糖為特征的一組疾病的總稱。按病因和發(fā)病機(jī)理分為l型糖尿 病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM)及其它少見的類型。前者多年輕發(fā)病、胰島素(INS)分 泌絕對(duì)缺乏而需INS治療，臨床常以此作分型判斷。但多數(shù)2型糖尿病(T2DM)患者或早或 晚也會(huì)進(jìn)入INS分泌絕對(duì)缺乏階段，加之近年來(lái)T2DM有發(fā)病年輕化的趨勢(shì)，故兩型DM診斷 和鑒別診斷逐漸成為臨床較為困惑的問(wèn)題。有鑒于此，甚有學(xué)者提出取消兩型DM的鑒別診 斷。但由于兩型DM的病因?qū)W和遺傳背景區(qū)別甚大，臨床防治措施有所不同，故目前國(guó)際和 國(guó)內(nèi)糖尿病防治指南仍規(guī)定需予區(qū)分。
在病因上，TlDM是一種胰島e細(xì)胞特異性自身免疫病，血循環(huán)中存在有自身抗體。因 此探測(cè)這些自身抗體的存在與否，有可能使其血清學(xué)分型診斷成為可能。
事實(shí)上目前已有三種胰島自身抗體常規(guī)用于臨床T1DM的診斷——胰島細(xì)胞抗體 (ICA)、谷氨酸脫羧酶抗體(GDA)和胰島素自身抗體(IAA)。 ICA是應(yīng)用最早的T1DM免 疫學(xué)標(biāo)志(1974年)，隨病程延長(zhǎng)而診斷價(jià)值下降較快是其致命的缺陷(病程2-5年患者陽(yáng) 性率僅20%) ; GAD是TlDM自身免疫反應(yīng)的啟動(dòng)耙抗原，其陽(yáng)性在一定程度上反映e細(xì)胞損 害程度較重,它在體內(nèi)以穩(wěn)定的濃度維持較長(zhǎng)時(shí)間，甚至在診斷10 20年仍可檢出，但陽(yáng) 性率不高(54-68%) ; IAA不是T1DM的特異性抗體,在胰島素自身免疫綜合征、甲狀腺疾病 等也可重疊出現(xiàn)，甚至在正常人群中也有高達(dá)33%的陽(yáng)性率。顯然此三種自身抗體的檢測(cè) 缺陷是明顯的。由于聯(lián)合檢測(cè)可互補(bǔ)單獨(dú)檢測(cè)的優(yōu)缺點(diǎn)，故有人試圖聯(lián)合檢測(cè)三種抗體提 高檢測(cè)效能，3項(xiàng)標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的特異性性達(dá)90.9 % ,陽(yáng)性率為92.1 %。
為克服上述臨床問(wèn)題，科研上開始研究一些新的糖尿病自身抗體。如IA-2A (酪氨酸 磷酸酶抗體)，其屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族，與GAD相似，IA-2A見于神經(jīng)組織和其 它內(nèi)分泌組織包括垂體。在新發(fā)的1型糖尿病IA-2A陽(yáng)性率大于60%。 2006年Chimienti等首次研究出一種特異性胰島鋅轉(zhuǎn)運(yùn)子ZnT8的功能和特性胰島富含鋅，因其是胰島素結(jié) 晶過(guò)程所必需的，而ZnT8 (e-細(xì)胞特異性鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體8)可能是此過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，對(duì)胰 島素的分泌有調(diào)控作用。2007年Wenzlau等報(bào)道了利用研究中較為經(jīng)典的放免技術(shù)，對(duì)ZnT8 自身抗體血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果。223例新發(fā)T"M血清樣本檢測(cè)陽(yáng)性率為63M、特異性高達(dá)98%。更 難得的是ZnT8自身抗體在GADA、 IAA和IA-2陰性的T1DM樣本中有37. 5%陽(yáng)性率，在ICA陰性 的TlDM樣本中有26.3y。的陽(yáng)性率。聯(lián)合檢測(cè)的結(jié)果是陽(yáng)性率高達(dá)96%。 ZnT8早從2歲開始出 現(xiàn)，同時(shí)小樣本調(diào)査的情況表明，其陽(yáng)性率有隨年齡和病程增加而增加的趨勢(shì)。
單一抗體用于篩查1型糖尿病以ICAs敏感性最高，用于診斷則各抗體在不同人群 敏感性不同。目前國(guó)際上已逐漸達(dá)成一種共識(shí)，即聯(lián)合檢測(cè)多種抗體可提高l型糖尿病診 斷和篩查的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性。而胰島自身抗體陽(yáng)性的種類數(shù)對(duì)于預(yù)測(cè)發(fā)病較之單 一抗體的特異性更有意義。當(dāng)前胰島自身抗體的檢測(cè)方法極不統(tǒng)一 ，這種多樣性造成了統(tǒng) 一評(píng)價(jià)研究結(jié)果的困難性。如果所有這些抗體聯(lián)合檢測(cè)可能改進(jìn)這些問(wèn)題，但檢測(cè)技術(shù)方 法不一樣、無(wú)法同時(shí)、同一批檢測(cè)等不一致因素，造成的差異增加而無(wú)法到達(dá)聯(lián)合檢測(cè)優(yōu) 勢(shì)互補(bǔ)"譜"檢測(cè)的目的。
現(xiàn)有血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)中，最常采用的是ELISA法和放免法或免放法以及化學(xué)發(fā)光法。 ELISA法只能進(jìn)行單一自身抗體的檢測(cè)，而且操作過(guò)程復(fù)雜，單個(gè)指標(biāo)檢測(cè)需要4小時(shí)以上， 結(jié)果判斷利用酶促瀑布效應(yīng)間接判斷而正確性差，同時(shí)需要價(jià)格昂貴的酶標(biāo)儀等實(shí)驗(yàn)室非 通用設(shè)備。放免法同樣只能進(jìn)行單一自身抗體的檢測(cè)，單個(gè)指標(biāo)檢測(cè)也需要2-4小時(shí)，也 需要價(jià)格昂貴的R-計(jì)數(shù)器等專用設(shè)備，且存在放射性衰減和污染。前者導(dǎo)致需制備質(zhì)控曲 線而增加操作復(fù)雜性并影響檢測(cè)準(zhǔn)確，同時(shí)使試劑盒貨架時(shí)間短。后者是對(duì)人身安全和環(huán) 境的污染?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)時(shí)間短且靈敏度高，但與上述兩種方法一樣仍是標(biāo)記方法的間 接判讀結(jié)果，未引入分子量等更為客觀的結(jié)果判讀體系，檢測(cè)正確度不理想，對(duì)每種指標(biāo) 的檢測(cè)需專供設(shè)計(jì)，如多種抗體的檢測(cè)存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、成本較高的問(wèn)題，不利于基層臨 床開展。
因此，研究和開發(fā)高價(jià)值的T1DM血清學(xué)標(biāo)志和檢測(cè)手段是DM研究中迫切問(wèn)題。不但 可以準(zhǔn)確的區(qū)分出1型糖尿病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM)，緩解糖尿病分型診斷的窘 迫現(xiàn)狀；還便于在臨床工作中大力推廣，作為1型糖尿病高危人群中的篩査，及對(duì)1型 糖尿病的病情監(jiān)測(cè)及預(yù)后有一定指導(dǎo)意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，
本發(fā)明的目的在于提供一種一次同時(shí)檢測(cè)全部上述己知的糖尿病自身抗體，同時(shí)靈敏度特異性等檢測(cè)效能高，方法簡(jiǎn)便且費(fèi)用低廉而便于推廣， 可用于1型糖尿病的診斷、療效和預(yù)后判斷及與其它類型糖尿病的鑒別診斷的檢測(cè)手段， 并以"糖尿病自身抗體譜血清學(xué)免疫印跡試劑盒"實(shí)物形式來(lái)表述。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的 一種糖尿病自身抗體譜血清學(xué)免疫印跡試劑盒，將ICA、
IAA、 GAD、 IA-2A和ZnT8五種抗原用SDS-PAGE按分子量大小依次分開，再通過(guò)印跡技術(shù) 轉(zhuǎn)移至印跡膜上，其印跡膜上即含有按分子量大小不同的各種胰島細(xì)胞自身抗原成分。將 膜切成小條，配合顯色液等試劑制成試劑盒,按說(shuō)明書僅利用小型離心機(jī)這樣的基層實(shí)驗(yàn) 室通用設(shè)備即可進(jìn)行檢測(cè)。
檢測(cè)判斷如果被檢血清有相應(yīng)抗體，就會(huì)在抗原的相應(yīng)位置出現(xiàn)顯色區(qū)帶，與標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)照即可判斷其抗體種類和數(shù)量及強(qiáng)度。因引入分子量區(qū)分系統(tǒng)，且多種自身抗體檢測(cè)一 次完成，檢測(cè)效能提高。
相比現(xiàn)有糖尿病自身抗體檢測(cè)手段，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
1、 糖尿病的診斷和鑒別診斷五種抗體一次同時(shí)聯(lián)合檢測(cè)，達(dá)到"譜"檢測(cè)目的， 同時(shí)引入直接客觀的分子量區(qū)分檢測(cè)系統(tǒng)，從而使該試劑盒檢測(cè)效能大大提高。對(duì)1型糖
尿病診斷的陽(yáng)性率可高達(dá)98%;特異度高達(dá)98%以上，可望成為1型糖尿病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)
而準(zhǔn)確與其它類型糖尿病鑒別。
2、 預(yù)防、療效和預(yù)后評(píng)估胰島內(nèi)I3細(xì)胞的免疫性破壞是潛隱性過(guò)程，在出現(xiàn)臨床
癥狀前多年即可存在，對(duì)無(wú)臨床癥狀人群的糖尿病自身抗體聯(lián)合檢測(cè)，能夠?qū)型糖尿病 有很高的預(yù)測(cè)價(jià)值，同時(shí)可進(jìn)行免疫干預(yù)，從而達(dá)到治療和預(yù)防作用。對(duì)于已發(fā)癥狀的1 型糖尿病患者，可通過(guò)治療后自身抗體譜變化評(píng)估療效及預(yù)后。
3、 本發(fā)明試劑盒相比其他檢測(cè)技術(shù)，具有多種自身抗體檢測(cè)一次完成，操作簡(jiǎn)單， 耗時(shí)少(5種抗體可一次性全部檢測(cè)，只需2小時(shí)左右)等優(yōu)點(diǎn)。
4、 無(wú)半衰期的問(wèn)題，因而貨架時(shí)間長(zhǎng)而，安全性好。
5、 使用成本較低，病人費(fèi)用大大減少。
6、 對(duì)于其他自身免疫性疾病，有一定的診斷參考價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
一種糖尿病自身抗體譜免疫印跡試劑盒，將ICA、 IAA、 GAD、 IA-2A和ZnT8五種抗原 用SDS-PAGE按分子量大小依次分開，再通過(guò)印跡技術(shù)轉(zhuǎn)移至印跡膜上，其印跡膜上即含 有按分子量大小不同的各種胰島細(xì)胞自身抗原成分。將膜切成小條，配合酶標(biāo)抗體及顯色 液試劑(底物)制成試劑盒，可方便地在實(shí)驗(yàn)室中供檢測(cè)用。根據(jù)出現(xiàn)顯色線條的位置可判斷有無(wú)針對(duì)的特異性抗體。
本發(fā)明采用通用的基因工程方法制備抗原，采用二十世紀(jì)分子生物學(xué)領(lǐng)域的三大發(fā)現(xiàn)
之--免疫印跡技術(shù)，將ZnT8、 IA-2A、 ICA、 IAA和GAD五種抗原用SDS-PAGE (變性聚
丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳)方法，按分子量大小依次分開，再通過(guò)印跡技術(shù)轉(zhuǎn)移至印跡膜 上，其印跡膜上即含有按分子量大小不同的各種胰島細(xì)胞自身抗原成分。所述糖尿病自身 抗體免疫印跡試劑盒的制備方法采用現(xiàn)有技術(shù)，包括載體構(gòu)建、表達(dá)和抗原純化 SDS-PAGE檢測(cè)方法建立；以及試劑盒的制備。
檢測(cè)判斷如果被檢血清有相應(yīng)抗體，就會(huì)在抗原的相應(yīng)位置出現(xiàn)顯色區(qū)帶，與標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)照即可判斷其抗體種類和數(shù)量，從而可省去單抗制備、包板等繁雜過(guò)程，因引入分子量 區(qū)分機(jī)制，故可多種自身抗體檢測(cè)一次完成，檢測(cè)效能提高。
通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，該試劑盒檢測(cè)的檢測(cè)效能較其它方法好，同時(shí)在檢測(cè)簡(jiǎn)便程度、檢測(cè) 時(shí)間、貨架時(shí)間、制備成本等方面綜合優(yōu)勢(shì)明顯(參見下表)。
方法敏感性特異性單次檢測(cè) 血清抗體專用設(shè)備操作時(shí)間成本
免疫印跡法98%99.6%多種無(wú)需2小時(shí)(全 部指標(biāo))40元/指標(biāo)/ 人份
ELISA40%-90%95%_99%單一酶標(biāo)儀等2-4小時(shí)(單 個(gè)指標(biāo))56元/指標(biāo)/ 人份
放免法40%-90%90%-95%單一R-計(jì)數(shù)器等2-4小時(shí)(單 個(gè)指標(biāo))60元/指標(biāo)/ 人份
經(jīng)過(guò)臨床血清學(xué)標(biāo)本檢測(cè)、結(jié)果匯總和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該試劑盒在糖尿病診斷分型、
鑒別診斷、預(yù)警和病情監(jiān)測(cè)中有很好的應(yīng)用價(jià)值，為臨床T1DM診斷及鑒別診斷以及療效 預(yù)后判定提供一種新的高效血清學(xué)檢測(cè)手段。
本發(fā)明糖尿病自身抗體譜血清學(xué)免疫印跡試劑盒，包括印跡膜在內(nèi)的成套試劑及使用 規(guī)范。具有如下特點(diǎn)1.檢測(cè)對(duì)象涵蓋有ZnT8、 ICA、 IM、 GAD和IA-2A五種糖尿病自身 抗體；2.利用準(zhǔn)確度高的分子量大小的區(qū)分手段判讀結(jié)果；3.采用改良實(shí)用性的SDS-PAGE 技術(shù)；4.所有五種糖尿病自身抗體檢測(cè)一次同時(shí)完成，達(dá)到特有的"譜"檢測(cè)目的；6.檢
測(cè)效能指標(biāo)高于現(xiàn)有同類試劑盒。
權(quán)利要求
1、糖尿病自身抗體譜免疫印跡試劑盒，其特征在于，將ICA、IAA、GAD、IA-2A和ZnT8五種糖尿病抗原用SDS-PAGE按分子量大小依次分開，再通過(guò)印跡技術(shù)轉(zhuǎn)移至印跡膜上，其印跡膜上即含有按分子量大小不同的各種胰島細(xì)胞自身抗原成分；將膜切成小條，配合酶標(biāo)抗體及顯色液試劑制成。
全文摘要
本發(fā)明提供一種糖尿病自身抗體譜血清學(xué)免疫印跡試劑盒。將目前已知的糖尿病所有自身抗體如ICA、IAA、GAD、ZnT8和IA-2A的相應(yīng)抗原，采用SDS-PAGE技術(shù)按分子量大小依次分開轉(zhuǎn)移至印跡膜上，如果被檢血清有相應(yīng)的糖尿病自身抗體，即會(huì)在印跡膜相應(yīng)位置出現(xiàn)顯色區(qū)帶，與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照即可判斷出這些自身抗體的種類、數(shù)量和強(qiáng)度，使多種糖尿病自身抗體檢測(cè)同時(shí)一次完成。避免了現(xiàn)有的糖尿病自身抗體檢測(cè)試劑盒的缺點(diǎn)，如檢測(cè)抗體單一或不全面而不能達(dá)到“譜”的覆蓋，或方法繁雜費(fèi)時(shí)費(fèi)力和費(fèi)用增加，或試劑貯存及放射性安全性問(wèn)題，或手段及檢測(cè)時(shí)差的不一致造成的差異增加，使靈敏度、特異性等檢測(cè)指標(biāo)下降，而最終導(dǎo)致檢測(cè)效能不足而無(wú)法適應(yīng)臨床需求。
文檔編號(hào)G01N33/66GK101539579SQ200910103708
公開日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日
發(fā)明者玥 吳, 玲 張, 靜 徐, 兵 陳 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院