專利名稱：一種檢測青霉素的免疫膠體金試劑板的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測乳制品中抗生素殘留試劑板的制備方法，具體涉及一種檢測
青霉素藥物殘留的免疫膠體金試劑板的制備方法。
背景技術(shù)：
青霉素類抗生素是|3 -內(nèi)酰胺類中一大類抗生素的總稱，因為價廉、方便、低毒、 高效等特點，被廣泛應(yīng)用于實際生產(chǎn)。青霉素廣泛應(yīng)用于治療奶牛疾病、促進奶牛生長、降 低發(fā)病率、提高飼料利用率，帶來乳業(yè)增產(chǎn)的同時，也不可避免的造成了原料奶抗生素殘留 問題，最終導(dǎo)致青霉素在人體內(nèi)的殘留。由此可引起過敏反應(yīng)，造成人體內(nèi)環(huán)境平衡的紊亂 和菌群失調(diào)，同時在進行藥物治療時會產(chǎn)生耐藥性，另外青霉素殘留會導(dǎo)致牛乳的發(fā)酵不 能正常完成，對乳品生產(chǎn)企業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，對進出口貿(mào)易造成一定影響。我國農(nóng)業(yè)部 第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定青霉素G和普魯卡因青霉素在奶 類中殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為4ng/mL。 目前，對于青霉素類藥物殘留的檢測方法主要有理化分析法和免疫分析法。理化 分析法，如HPLC及LC-MS，具有特異性好、準(zhǔn)確率高的特點，是各大檢測機構(gòu)對檢測樣本進 行確證的首選方法，但存在對設(shè)備、環(huán)境、操作技能等要求，不利于大規(guī)模樣本篩選，因而不 適合廣大基層部門。免疫分析法，如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，具有檢測量大，操作相對簡單 等優(yōu)點，越來越多地被用于動物性食品中抗生素殘留的檢測，但是ELISA法整個操作時間 仍需要l-2h，且需用到特殊儀器設(shè)備，具有一定局限性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對上述方法的不足，提供一種靈敏度高、操作簡單、檢測時間
短、不需要特殊儀器設(shè)備、生產(chǎn)成本低的原奶中青霉素免疫膠體金快速檢測試劑板。 本發(fā)明試劑板由上下兩塊塑料模板、背襯及粘附在背襯上依次緊密相連的樣品
墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊組成。 其中樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰各部分間有l(wèi)-2mm的重 疊，其目的一方面是保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位順利進行，另一方面是為了使樣 品溶液與樣品墊有充分反應(yīng)時間，樣品墊上的緩沖體系可以中和樣品溶液的酸堿度，保證 樣品溶液中的有效成分與膠體金結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體順利發(fā)生反應(yīng)。 膠體金結(jié)合墊上包被有抗青霉素單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物；硝酸纖維素膜上 從樣品墊到吸水墊方向依次包被有青霉素G-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測 線和質(zhì)控線。偶聯(lián)青霉素G的載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(0VA)、血藍(lán)蛋 白(KLH)等?？骨嗝顾貑慰寺】贵w為可以識別青霉素G、氨芐青霉素和羥氨芐青霉素的免疫 球蛋白或其片段。 本發(fā)明試劑板的各部分組成成分與功能如下 塑料模板，起固定試紙條及標(biāo)示功能區(qū)(加樣孔、檢測區(qū)、控制區(qū))的作用。
背襯為一面涂有不干膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組
成部分的作用。 樣品墊由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液與緩沖樣品溶液pH值的作用。 膠體金結(jié)合墊由聚酯膜制成，其上標(biāo)記有抗青霉素單克隆抗體與膠體金的結(jié)合
物，是樣品溶液中的有效成分與金標(biāo)抗體發(fā)生反應(yīng)的場所。 硝酸纖維素膜部分主要作用是將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。
吸水墊為濾紙，作為吸水部分其作用是將移動上來的多余的溶液吸收。
本發(fā)明試劑板具有如下有益效果 (1)特異性好。本發(fā)明試劑板對青霉素類藥物中的青霉素G、氨芐青霉素及羥氨芐 青霉素的交叉反應(yīng)率分別為100%、70%及60%，對其他種類的抗生素包括氯霉素、喹諾酮 類、四環(huán)素類、慶大霉素、鏈霉素、磺胺類藥物等無交叉反應(yīng)，可見，本發(fā)明對青霉素類藥物 反應(yīng)均有高度專一性。 (2)靈敏度高。本發(fā)明試劑板對原奶中青霉素G的檢出限為4ng/mL，可以滿足我 國農(nóng)業(yè)部第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中對青霉素G和普魯卡因青霉 素在奶類中最高殘留限量4ng/mL的規(guī)定要求。 (3)操作簡單快捷，不依賴任何實驗設(shè)備，不需任何專業(yè)培訓(xùn)。本發(fā)明試劑板將反 應(yīng)所需的大部分原料整合到試劑條中，滴樣后抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進行，大大縮 短了檢樣時間，且樣品無需特殊處理，滴樣后3-5分鐘內(nèi)即可用肉眼通過判斷硝酸纖維素 膜上的檢測線和質(zhì)控線的顏色深淺讀取結(jié)果，檢測過程無需特殊儀器輔助，普通人員均可 操作，不需要專業(yè)培訓(xùn)，極易推廣使用。 (4)成本低，效益好。本發(fā)明試劑板生產(chǎn)工藝成熟、流程簡單，生產(chǎn)成本低廉，投資 少，收效快。


圖1為青霉素免疫膠體金快速檢測試劑板結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為樣品墊，2為膠體 金結(jié)合墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測線，5為控制線，6為吸水墊，7為不干膠，8為PVC板。
圖2為青霉素免疫膠體金快速檢測試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔，C為控制 區(qū)，T為檢測區(qū)。 圖3為青霉素免疫膠體金快速檢測試劑板結(jié)果判定示意圖，其中C為控制區(qū)，T為 檢測區(qū)。
具體實施例方式
本發(fā)明試劑板的制備包括青霉素-BSA偶聯(lián)物的制備，抗青霉素單克隆抗體的制 備，膠體金溶液的制備，膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體的制備和青霉素免疫膠體金快速 檢測試劑板的組裝。 1.青霉素G與載體蛋白的偶聯(lián) 采用戊二醛法將青霉素G鈉鹽與載體蛋白偶聯(lián)制備免疫抗原和包被抗原。稱取 48mg青霉素G鈉鹽溶于2mL水中，用10mL PB緩沖液(0. lmol/L PH 6.0)溶解50mg牛血清 白蛋白，加入到上述溶液中，再緩慢加入lmL 10X戊二醛溶液，將混合溶液室溫下攪拌2h，雙蒸水透析5天，濾膜過濾后，收集。
2.抗青霉素單克隆抗體的制備 取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的青霉素G-載體蛋白偶聯(lián)物與等 體積的弗氏完全佐劑乳化，按100 ii g/只劑量皮下注射，之后每隔3周加強免疫1次，用不 完全佐劑腹腔注射。融合前3d強化免疫l次，不用佐劑，劑量加倍。細(xì)胞融合按常規(guī)方法 進行將Sp2/0多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1 : 10的比例混合，在50XPEG作用下 融合，HAT培養(yǎng)基懸浮，分種于96孔培養(yǎng)板中，371\5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
融合后，待細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔面積的1/4時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初 篩選擇10mg/L青霉素載體蛋白偶聯(lián)物(此處載體蛋白與作為免疫原的載體蛋白應(yīng)為不同 種類)包被酶聯(lián)板，被測孔加培養(yǎng)上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRP(1 : 1000) ，OPD 顯色。篩選出的陽性孔再用青霉素G-載體蛋白偶聯(lián)物(同初篩)包被的酶聯(lián)板進行阻斷 間接ELISA。將細(xì)胞培養(yǎng)上清與2X10—^01/L青霉素溶液等量混合，37t:感作lh，加入已包 被的酶標(biāo)板中。另外用PBS(0.01mol/L、pH7.4)替代青霉素溶液作對照，其余步驟同上。若 青霉素阻斷后的0D值降至對照孔的50%以下，則判為陽性孔。經(jīng)2 3次檢測都呈陽性的 孔，立即用有限稀釋法進行克隆化。 體外培養(yǎng)將克隆化的細(xì)胞株擴大培養(yǎng)，細(xì)胞濃度達(dá)5X10SmL—1時停止換液，細(xì)胞 全部死亡后收集培養(yǎng)液。體內(nèi)誘生腹水給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克隆 化細(xì)胞株107個細(xì)胞，7天后抽取腹水。
3.膠體金溶液的制備膠體金顆粒的平均大小為30nm，其制備方法為在lOOmL去離子水中加入lmL 1% 檸檬酸三鈉，煮沸后迅速加入lmL 1%氯金酸，繼續(xù)煮沸10min，冷卻后，4t:下保存?zhèn)溆谩?
4.膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體的制備 取已制備好的100mL膠體金溶液，用0. lmol/L碳酸鉀溶液調(diào)pH到8. 0。邊攪拌 邊加入1. 5mg抗青霉素單抗，攪拌20min，再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000 (PEG 20000)，攪拌15min。 20， OOOrpm離心15min，棄上清液，加入10mL pH 7. 4PBS緩沖液(含 0. 4mol/LPEG)清洗2次。將沉淀用5mL含2% BSA的PBS緩沖液(pH 7. 4)溶解，用0. 22 y m 無菌過濾器過濾后，fC保存?zhèn)溆谩?
5.青霉素免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝 參照圖l，用點膜機把適當(dāng)濃度的青霉素G-載體蛋白偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝 酸纖維素膜上，分別作為檢測線和控制線，37t:烘箱干燥8h。以同樣方法，將制備好的金標(biāo) 記青霉素單克隆抗體包被在膠體金結(jié)合墊上。 檢測試劑組成為一個PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖 維素膜和吸水墊。用切割機將貼好的大卡切割成4mm寬的條，裝入塑料模板中制成檢測試 劑板，再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。
6.青霉素免疫膠體金快速檢測試劑板檢測原理 當(dāng)待檢樣品溶液滴入試劑板加樣孔后，樣品溶液因硝酸纖維素膜載體的毛細(xì)管作 用向另一端擴散。在移動的過程中，會發(fā)生相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)，并通過免疫膠體金的顏色 顯示出來。如果樣品溶液含有青霉素類藥物殘留，青霉素類藥物先和膠體金顆粒上的抗體 反應(yīng)，因此當(dāng)膠體金顆粒隨樣品溶液擴散至檢測線時，膠體金顆粒上抗體的活性位點因被樣品溶液中的青霉素類藥物占據(jù)而無法與檢測線上青霉素G特異性抗原結(jié)合；當(dāng)樣品中的 青霉素類藥物含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測線顯色較控制線淺甚至無顯色， 判定為陽性。反之，當(dāng)樣品中青霉素類藥物含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上 的檢測線顯色與控制線相近或偏深，判定為陰性。 7.青霉素免疫膠體金快速檢測試劑板檢測實施例操作方法
7. 1樣品制備取2mL原奶加入5mL離心管中，再加入60iiL 3mol/L HC1溶液，振蕩30秒。加入 4mL乙酸丁酯，劇烈振蕩1分鐘，靜置分層。取3mL上層溶液到另一離心管中，加入250 y L PB緩沖液(0. lmol/L PH 7. 4)，振蕩1分鐘，靜置分層。吸取至少100 y L下層溶液滴板。
7. 2檢測步驟 從包裝袋中取出試劑板，用滴管吸取待檢溶液，在加樣孔中滴入3滴(約100 ii L)， 加樣后開始計時，結(jié)果應(yīng)在3 5分鐘讀取，其他時間判讀無效。
7. 3結(jié)果判斷 讀取結(jié)果時，將試劑板水平置于觀察者正面，如圖2右側(cè)所示。 陰性(-):T線顯色比C線深或一樣深，表明樣品中青霉素類藥物濃度低于4ng/mL
或無青霉素類藥物殘留。如圖3.a所示。 陽性(+) :T線顯色比C線淺，或T線無顯色，表明樣品中青霉素類藥物濃度高于 4ng/mL ;T線比C線越淺，表明樣品中青霉素類藥物濃度越高。如圖3. b所示。
無效未出現(xiàn)C線，可能操作不當(dāng)或試劑板已失效。應(yīng)再次閱讀說明書，并用新試 劑板重新測試。如圖3.c所示。
權(quán)利要求
一種青霉素免疫膠體金試劑板的制備方法，其特征在于醋酸纖維膜上的膠體金結(jié)合墊上包被有抗青霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，從樣品墊到吸水墊方向依次是檢測線和質(zhì)控線，包被有青霉素-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG。
2. 如權(quán)利要求1所說的標(biāo)記物，其特征在于將膠體金與抗青霉素單克隆抗體按一定比例混勻，使膠體金與抗青霉素單克隆抗體形成穩(wěn)定的膠體金顆粒，通過濃縮形成抗青霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。
3. 如權(quán)利要求書l所說的檢測線，其特征在于偶聯(lián)青霉素的載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(0VA)、血藍(lán)蛋白(KLH)等。
4. 如權(quán)利要求1所說的制備方法，其特征在于樣品中的青霉素含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測線顯色較控制線淺甚至無顯色，判定為陽性；反之，當(dāng)樣品中青霉素含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測線顯色與控制線相近或偏深，判定為陰性。
5. 如權(quán)利要求1所說的制備方法，其特征在于工藝流程包括制備青霉素-BSA偶聯(lián)物、制備抗青霉素單克隆抗體、制備膠體金溶液、制備膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體和組裝青霉素免疫膠體金快速檢測試劑板。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測青霉素藥物殘留的免疫膠體金試劑板的制備方法。該試劑板由上下兩塊塑料模板和試紙條組成。在試紙條背襯上依次緊密粘貼有樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，相鄰各部分間有1-2mm的重疊。膠體金結(jié)合墊上包被有抗青霉素單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物，硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有青霉素G-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和質(zhì)控線。該試劑可半定量直觀檢測樣品中的青霉素G、氨芐青霉素和羥氨芐青霉素殘留，整個檢測過程僅需5分鐘左右，且無需任何實驗設(shè)備，利于大規(guī)模樣本篩選，適合于廣大基層部門對乳制品中的青霉素進行大規(guī)?？焖贆z測。
文檔編號G01N33/558GK101710121SQ20091015420
公開日2010年5月19日 申請日期2009年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月6日
發(fā)明者卜令杰, 張少恩, 桑麗雅, 邵偉 申請人:杭州南開日新生物技術(shù)有限公司