專利名稱：同時對人21及18號染色體數(shù)目進行檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及檢測染色體數(shù)目的方法，尤其涉及應(yīng)用多重實 時熒光PCR相對定量法在同一反應(yīng)管中同時檢測人21及18號染色體數(shù)目的方法。
背景技術(shù)：
21及18三體綜合征是胎兒出生缺陷最常見的兩種染色體病，發(fā)病率分別為 1/600 1/800和1/6000，表現(xiàn)為21或18號染色體數(shù)目的異常，即患者在正常兩條的基 礎(chǔ)上多了一條(或多了部分21/18號易位染色體)。此兩種病患者有嚴重的智力發(fā)育遲 緩和多發(fā)畸形，患兒早期死亡率高，給家庭和社會帶來沉重負擔(dān)。此兩種疾病尚無有效治 療，主要通過產(chǎn)前診斷來避免缺陷兒的出生。目前主要依靠傳統(tǒng)的細胞遺傳學(xué)方法來檢測， 該方法所需培養(yǎng)時間長，出結(jié)果慢，費時費力，增加了患者等待結(jié)果的焦慮。熒光原位雜交 (FISH)技術(shù)費用昂貴、操作技術(shù)要求高、存在一定的漏診率等。近年，分子生物技術(shù)的發(fā)展 突飛猛進，如短串聯(lián)重復(fù)數(shù)目多態(tài)性(STR)分析、多重連接探針擴增(MLPA)及比較基因組 雜交(Array-based CGH)技術(shù)都有應(yīng)用于產(chǎn)前診斷遺傳疾病的報道，但這些技術(shù)由于費用、 設(shè)備等局限性，難以普及應(yīng)用。因此，臨床急需準確、快速、高通量、無污染、能大規(guī)模應(yīng)用的 分子檢測技術(shù)。最近發(fā)展而來的實時熒光PCR(Real-time PCR)技術(shù)，是在PCR反應(yīng)體系中加入引 物和相對應(yīng)的熒光標記的探針.它融匯了 PCR高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù) 的高精確定量等優(yōu)點，直接監(jiān)測PCR過程中熒光信號的累積量。在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光 的水平不能與背景明顯地區(qū)別，可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點上來檢測PCR產(chǎn)物的 量，并由此來推斷模板分子最初的拷貝數(shù)。首先需設(shè)定一定熒光信號的閾值，一般閾值設(shè)在 擴增對數(shù)期并超過無規(guī)則噪音線的最高處。如果檢測到熒光信號超過閾值被認為是真正的 信號，它可以定義樣本的閾值循環(huán)數(shù)(CT)。CT的含義是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè) 定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。21、18三體綜合征的21、18號染色體原始拷貝數(shù)是其他正常染 色體數(shù)目的1. 5倍，因此21、18號染色體基因上的擴增產(chǎn)物量更早到達閾值，Ct值更小，利 用原始拷貝數(shù)量上相對定量法，即ACT值法，便可對三體做出檢測。Real-time PCR技術(shù)已經(jīng)成為準確檢測模板拷貝數(shù)、體液游離DNA及腫瘤研究中 基因重復(fù)或缺失的一項有力工具。國內(nèi)也有研究者(廖燦，黃以寧等，實時熒光定量PCR快 速分子診斷唐氏綜合征.現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)生物工程雜志，2004，1(K4) :310-312.)通過分管擴 增目的基因及內(nèi)參基因部分片段，采用實時熒光PCR的方法對21三體的分子診斷進行了初 步探索。但分管實驗中的一些因素，如孔間差異、模板加樣差異等，都可以導(dǎo)致結(jié)果完全不 同，造成錯誤的判斷。此外，呂時銘等在申請?zhí)枮?00510049601. 2、發(fā)明名稱為〃實時定量 PCR技術(shù)來檢測人21號染色體的數(shù)目的方法"的專利申請中公開了應(yīng)用實時定量PCR技術(shù) 來檢測人21號染色體的數(shù)目的方法，但是該研究是選擇21號染色體上的DSCR4作為目的 基因，1號染色體上的RABIF基因作為參照基因，只能對21號染色體的數(shù)目做出檢測，且該 研究選擇的Taqman探針是3'端采用熒光物質(zhì)的TAMRA淬滅基因標記，增加了本底信號的干擾，影響結(jié)果的正確性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種同時對人21及18號染色體數(shù)目進行檢測的方法，應(yīng) 用多重實時熒光PCR相對定量法在同一反應(yīng)管中同時檢測人21及18號染色體數(shù)目。本發(fā)明所述的一種同時對人21及18號染色體數(shù)目進行檢測的方法，包括以下步 驟A.樣品DNA提取按常規(guī)苯酚-氯仿法提取樣本的DNA，檢測DNA濃度及純度；B.引物設(shè)計和合成選擇21號染色體21q21. 3上的淀粉樣前蛋白基因(APP基因MIM =188350 ；GeneID 7298)部分片段和18號染色體18pll. 32上的胸苷酸合成酶基因(TYMS基因MIM :104760 ； GeneID :351)部分片段，設(shè)計相應(yīng)引物，使得兩基因部分片段在同一管中相互作為內(nèi)參照 同時擴增；并設(shè)計相應(yīng)的iTaqman探針，探針3'端標記非熒光性的淬滅基因Eclipse，5‘端 標記FAM或HEX熒光基團；其中，針對21號染色體設(shè)計的上游引物序列為SEQ ID NO. 1，下游引物序列為SEQ ID NO. 2，相應(yīng)的Taqman探針序列為SEQ ID NO. 3 ；針對18號染色體設(shè)計的上游引物序列 為SEQ ID NO. 4，下游引物序列為SEQ IDN0. 5，相應(yīng)的Taqman探針序列為SEQ ID NO. 6 ；C.多重實時熒光PCR擴增反應(yīng)采用25ul反應(yīng)體系，包含模板DNA 2ul (60ng)，兩對引物各300nmol/L，相應(yīng) TaqMan熒光探針各200nmol/L，1 X TaqMan通用PCR混合試劑12. 5ul ；該混合試劑中含有熱 啟動DNA聚合酶、dNTP、MgC12、熒光染料ROX ；每個DNA標本進行3個平行管的擴增；熱循環(huán)條件為50°C 2分鐘，95°C 10分鐘，然后95°C 15秒，60°C 1分鐘，循環(huán)40 次；D.相對定量分析方法采用ABI7500型PCR儀隨機附帶軟件進行熒光相對定量分析；分析參數(shù)設(shè)定閾值線設(shè)在對數(shù)期并超過無規(guī)則噪音線的最高處，不同批次采用 同一閾值分析，將閾值設(shè)定為0. 2 ；基線范圍起點為第3個循環(huán)，終點為第19個循環(huán)；儀器附帶軟件根據(jù)設(shè)定參數(shù)自動計算出CT值，APP基因部分片段擴增產(chǎn)物與TYMS 基因部分片段擴增產(chǎn)物CT值之差為相對定量指標ACT值，取3個平行管ACT值的平均值； 通過Δ CT值來確定21及18號染色體的數(shù)目。本發(fā)明還提供了一種同時對人21及18號染色體數(shù)目進行檢測的試劑盒。本發(fā)明所述的一種同時對人21及18號染色體數(shù)目進行檢測的試劑盒，包括多 重?zé)晒釶CR反應(yīng)液、熱啟動DNA聚合酶、dNTP、MgC12、熒光染料R0X，其特征在于，還包括 兩對引物和相應(yīng)的Taqman熒光探針；所述第一對引物和相應(yīng)的探針是針對21號染色體 21q21. 3上的淀粉樣前蛋白基因設(shè)計的，包括序列為SEQ ID NO. 1的上游引物，序列為SEQ ID N0. 2的下游引物；以及序列為SEQ ID N0. 3的相應(yīng)Taqman探針；所述第二對引物和相 應(yīng)的探針是針對18號染色體18pll. 32上的胸苷酸合成酶基因設(shè)計的，包括序列為SEQ IDNO. 4的上游引物，序列為SEQ ID NO. 5的下游引物，以及序列為SEQ ID NO. 6的相應(yīng)Taqman 探針；探針3'端標記非熒光性的淬滅基因EclipSe，5'端標記FAM或HEX熒光基團。目前尚未見到應(yīng)用多重實時熒光PCR技術(shù)同時對人21及18號染色體數(shù)目進行檢 測的報道。本發(fā)明利用多重實時熒光PCR技術(shù)比較CT值的相對定量法(八(^值法)，建立 了一種在同一反應(yīng)管中同時對人21及18號染色體數(shù)目進行檢測的方法，且Taqman探針的 設(shè)計是在3'端采用非熒光性的淬滅基因Eclipse標記，淬滅基團吸收報告基團的能量后 并不發(fā)光，大大降低了本底信號的干擾，結(jié)果更客觀準確。
具體實施例方式本發(fā)明所述的一種多重實時熒光PCR相對定量法在同一反應(yīng)管中同時檢測人21 及18號染色體數(shù)目的方法，包括以下步驟(I)DNA 提取按常規(guī)苯酚-氯仿法提取樣本的DNA，例如，采用QIAamp DNA BloodMini Kit 試劑盒(德國Qiagen公司)，按說明書要求提取DNA，用微量核酸蛋白檢測儀(NanoDrop ND-1000)檢測DNA濃度及純度，所需DNA純度要求0D26(1/0D28(1的值為1. 8 2. O ；(2)引物、探針的設(shè)計和合成選擇21號染色體21q21. 3上的淀粉樣前蛋白基因(amyloid precursorprotein gene，APP)部分片段設(shè)計的引物序列分別為上游引物5'-CCCAGGAAGGAAGTCTGTACCC-3‘ SEQ ID NO. 1 ；下游引物5'-CCCTTGCTCATTGCGCTG-3‘ SEQ ID N0. 2 ；相應(yīng)Taqman 探針SEQ ID NO. 35' -(FAM)AGCCATCCTTCCCGGGCCTAGG(Eelipse)-3‘。選擇18號染色體18pll. 32上的胸苷酸合成酶基因(thymidylatesynthetase gene, TYMS)部分片段設(shè)計的引物序列分別為上游引物5'-TGACAACCAAACGTGTGTTCTG-3‘ SEQ ID N0. 4 ；下游引物5'-AGCAGCGACTTCTTTACCTTGATAA-3‘ SEQ ID N0. 5 ；相應(yīng)Taqman 探針SEQ ID NO. 65' (HEX)-AAGGGTGTTTTGGAGGAGTTGCTGTGG(Eclipse)-3'。以上引物和探針均由寶生物工程(大連)有限公司合成。(3) PCR 擴增反應(yīng)APP及TYMS兩基因的部分片段在同一反應(yīng)管中進行擴增，每個標本的DNA進行3 個平行管的擴增，PCR擴增體系如下DNA 模板60ng引物300nmol/L探針200nmol/L1X TaqMan Universal PCR MasterMix(美國 ABI 公司 Cat 4304437) 12. 5uL加水至總體積25 μ 1ΑΒΙ7500 型定量 PCR 儀，熱循環(huán)條件為50°C 2min,95°C lOmin，然后 95°C 15S,60 0C Imin，循環(huán) 40 次。(4)相對定量分析方法采用ABI7500型PCR儀(美國ABI公司)隨機附帶軟件進行熒光相對定量分析。分析參數(shù)設(shè)定閾值線設(shè)在對數(shù)期并超過無規(guī)則噪音線的最高處，不同批次采用 同一閾值分析，將閾值設(shè)定為0. 2 ；基線范圍起點為第3個循環(huán)，終點為第19個循環(huán)；儀器附帶軟件根據(jù)設(shè)定參數(shù)自動計算出CT值，APP基因部分片段與TYMS基因部 分片段的擴增產(chǎn)物CT值之差為相對定量指標Δ CT值，取3個平行管Δ CT值的平均值；通 過Δ CT值來確定21及18號染色體的數(shù)目。(5) APP基因部分片段和TYMS基因部分片段擴增效率的檢測以2倍系列稀釋6個濃度梯度的正常核型DNA為模板進行該多重實時熒光定量 PCR擴增檢測。ΑΒΙ7500軟件根據(jù)設(shè)定自動生成APP基因部分片段和TYMS基因部分片段擴 增產(chǎn)物的標準曲線，該曲線以模板相對濃度的對數(shù)為橫坐標，CT值為縱坐標，并自動計算出 標準曲線的斜率和相關(guān)系數(shù)。根據(jù)標準曲線的斜率和相關(guān)系數(shù)來評價兩片段的擴增效率。 儀器附帶軟件計算得出，兩條標準曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)分別是0. 997566和0. 994185，均大 于0. 99，表明可信度好，曲線的斜率(slope)分別是-3. 377818和-3. 235760，換算成擴增 效率分別是97.7%和103.7%，均接近100%的PCR擴增效率。因此，兩基因部分片段的擴 增效率基本一致，滿足采用△ CT值法進行相對定量分析的要求。(6)結(jié)果分析APP基因部分片段及TYMS基因部分片段在同一管中進行擴增，按以上參數(shù)設(shè)置， 軟件自動計算兩基因部分片段擴增產(chǎn)物的ACT值A(chǔ)CT 值=CTapp-CTtyms用此方法檢測三組標本51例正常核型的DNA (A組)，21例21三體綜合征的DNA (B 組)和6例18三體綜合征的DNA (C組)。結(jié)果見表一。A、B、C三組標本Δ CT (Mean士SD)均值分別 為-0. 48 士 0. 14，-1. 26 士 0. 17 和 0. 25 士 0. 12。統(tǒng)計學(xué)T-test =B組與A組、C組與A組間均有顯著差異(P < 0. 001)，且無交叉重疊。正常核型DNAACT均值(Mean士2SD)范圍為-0. 76 -0. 20，該數(shù)值在使用同 一試劑盒的條件下是固定的，但在使用不同試劑盒時可以有所不同。當待測標本ACT值 < -0. 76時，判斷該標本21號染色體數(shù)目為3條；當待測標本ACT值處于-0. 76 -0. 20 之間，判斷該標本為正常核型；當待測標本八(^值> -0. 20時，判斷該標本18號染色體數(shù) 目為3條。本發(fā)明的多重實時熒光PCR相對定量法在同一反應(yīng)管中同時檢測人21及18號染 色體數(shù)目的方法，驗證上述臨床標本檢測結(jié)果的敏感性、特異性、準確率均達百分之百，尚 需進一步擴大樣本量。表1.正常核型DNA、21及18號染色體數(shù)目為3條的DNA的Δ CT值
權(quán)利要求
1.一種同時對人21及18號染色體數(shù)目進行檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟A.樣品DNA提取按常規(guī)苯酚-氯仿法提取樣本的DNA，檢測DNA濃度及純度；B.引物設(shè)計和合成選擇21號染色體21q21. 3上的淀粉樣前蛋白基因部分片段和18號染色體18pll. 32 上的胸苷酸合成酶基因部分片段，設(shè)計相應(yīng)引物，使得兩基因部分片段在同一管中相互 作為內(nèi)參照同時擴增；并設(shè)計相應(yīng)的Taqman探針，探針3'端標記非熒光性的淬滅基因 Eclipse, 5'端標記FAM或HEX熒光基團；其中，針對21號染色體設(shè)計的上游引物序列為SEQ ID NO. 1，下游引物序列為SEQ ID NO. 2，相應(yīng)的Taqman探針序列為SEQ ID NO. 3 ；針對18號染色體設(shè)計的上游引物序列為SEQ ID NO. 4，下游引物序列為SEQ IDN0. 5，相應(yīng)的Taqman探針序列為SEQ ID NO. 6 ；C.多重實時熒光PCR擴增反應(yīng)采用25ul反應(yīng)體系，包含模板DNA 2ul(60ng)，兩對引物各300nmol/L JgSTaqMan 熒光探針各200nmol/L，IXTaqMan通用PCR混合試劑12. 5ul ；該混合試劑中含有熱啟動 DNA聚合酶、dNTP、MgC12、熒光染料ROX ；每個DNA標本進行3個平行管的擴增；熱循環(huán)條件為50°C 2分鐘，95°C 10分鐘，然后95°C 15秒，60°C 1分鐘，循環(huán)40次；D.相對定量分析方法采用ABI7500型PCR儀隨機附帶軟件進行熒光相對定量分析；分析參數(shù)設(shè)定閾值線設(shè)在對數(shù)期并超過無規(guī)則噪音線的最高處，不同批次采用同一 閾值分析，將閾值設(shè)定為0. 2 ；基線范圍起點為第3個循環(huán)，終點為第19個循環(huán)；儀器附帶軟件根據(jù)設(shè)定參數(shù)自動計算出CT值，APP基因部分片段的擴增產(chǎn)物與TYMS 基因部分片段的擴增產(chǎn)物CT值之差為相對定量指標ACT值，取3個平行管ACT值的平均 值；通過Δ CT值來確定21及18號染色體的數(shù)目。
2.一種同時對人21及18號染色體數(shù)目進行檢測的試劑盒，包括多重?zé)晒釶CR反應(yīng) 液、熱啟動DNA聚合酶、dNTP、MgC12、熒光染料R0X，其特征在于，還包括兩對引物和相應(yīng)的 Taqman熒光探針；所述第一對引物和相應(yīng)的探針是針對21號染色體21q21. 3上的淀粉樣前蛋白基因部 分片段設(shè)計的，包括序列為SEQ ID NO. 1的上游引物，序列為SEQ ID N0.2的下游引物；以 及序列為SEQ ID N0. 3的相應(yīng)Taqman探針；所述第二對引物和相應(yīng)的探針是針對18號染色體18pll. 32上的胸苷酸合成酶基因部 分片段設(shè)計的，包括序列為SEQ ID N0. 4的上游引物，序列為SEQ ID N0. 5的下游引物，以 及序列為SEQ ID N0. 6的相應(yīng)Taqman探針；探針3'端標記非熒光性的淬滅基因EclipSe，5'端標記FAM或HEX熒光基團。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多重實時熒光PCR相對定量法在同一反應(yīng)管中同時檢測人21及18號染色體數(shù)目的方法。采用實時熒光PCR技術(shù)比較CT值的相對定量法，即ΔCT值法，對人21及18號染色體上的APP及TYMS基因部分片段在同一管中相互作為內(nèi)參照同時擴增，計算兩擴增產(chǎn)物的ΔCT值，對其相對模板量做出判斷，通過ΔCT值來確定人21及18號染色體的數(shù)目。其優(yōu)點自動化閉管操作，簡單、快速、成本低、無污染、通量大；檢測特異性高，靈敏度高，準確可靠，并可同時對人21及18號染色體的數(shù)目做出檢測。
文檔編號G01N21/64GK102086469SQ20091019436
公開日2011年6月8日 申請日期2009年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月3日
發(fā)明者孫筱放, 眭建忠 申請人:廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院