專利名稱：快速檢測豬流感病毒的膠體金測試試紙條的制作方法
技術領域：
本實用ffiMJl于M獸醫(yī)學快速檢測技術^Wr涉及檢 ^ 毒(含A/H1N1， H3N2)的膠體金測試試劑盒，更具體的說是一種快速檢測豬流感病毒(A型H1N1， H3N2 流感)的膠體金測試試紙條。
背景技術：
豬流感是由豬流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，但極少傳染給人。目前對豬 流感病毒的診斷方法，主要有病毒分離、血清學診斷以及分子生物學方法。但病毒分離 時間長，要求條件高，分離率低，而采集患者急性期與恢復期雙份血清進行抗體測定不 能及時進行診斷，因此，使這兩種方法在實際使用中受到很大的限制。 發(fā)明內容
本實用新型的目的是提供一種快速檢測豬流感病毒的膠體金測試試紙條。其采用兩 條帶顯色的膠體金層析法制備，顯帶顏色紅色線條，能準確快速檢測出樣品中豬流感病 毒的有無。為實現(xiàn)上述目的，本實用新型提供如下的技術方案
一種快速檢測豬流感病毒的膠體金測試試紙條，其特征在于該試紙條是在底襯(1) 上順次相互搭接地粘帖樣品墊(2)、玻璃纖維膜或聚酯膜(3)、包被膜(4)以及吸水紙 (5)組成；其中的包被膜(4)上印制有控制線(7)和檢測線(6);控制線(7)包被 抗鼠IgG抗體，檢測線(6)包被抗豬流感病毒的抗體；通過控制線(7)和檢測線(6) 的顯色來定性判斷。
本實用新型所述的快速檢測豬流感病毒的膠體金測試試紙條，其中底襯(1)為不吸 水的塑料硬紙板。所述包被膜為硝酰纖維素膜。所述的樣品墊為膠體金顆粒標記抗豬流 感病毒的單克隆抗體的硝酰纖維素膜。粘貼材料為雙面膠。
本實用新型所述的包被抗豬流感病毒的抗體為高純度的單克隆抗體和/或多克隆抗 體。優(yōu)選為高純度的單克隆抗體。
本實用新型所述的控制線(7)和檢測線(6)為上下排列，其間隔為3-5mm。優(yōu)選5mmc
本實用新型所述金標抗體包被的玻璃纖維膜寬度的確定:將膠體金玻璃纖維膜裁成4
毫米、5毫米、6毫米規(guī)格，與包被膜組成測試條，每條寬4毫米。選擇能檢出室內質控 樣本，無非特異性反應的金標玻璃纖維膜寬度定為使用寬度。
本實用新型所述的快速檢測豬流感病毒的膠體金測試試紙條，根據需要還可以將包 被膜、吸水紙、玻璃纖維膜或聚酯膜(3)粘貼在塑料底板上，組成大板?；驅份已切 好的試紙條與干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內，組成試劑盒。
本實用新型所述的快速檢測豬流感病毒的膠體金測試試紙條，是采用免疫親和技術、 印記技術、免疫標記技術和層析技術的組合制成。特點是將包被抗體，膠體金標記抗體 固相化，與樣本吸附材料等組合在一起，制備為免疫層析診斷試條/板，使用時只需要把 試紙條下插入樣本溶液，數分鐘就可以判斷結果。與免疫滲濾法比較，穩(wěn)定性好，操作 更簡便、快速，且由于為干試條/試板形式，無需低溫保存，儲運方便。
本實用新型所述的快速檢測豬流感病毒的膠體金測試試紙條的制備方法，包括以下
步驟
A. 包被膜的制備-
(l)檢測線的制備采用噴膜機，將包被緩沖液稀釋抗豬流感病毒的單克隆抗體，
噴涂在硝酰膜上，機器劃線，室溫晾干20分鐘。
(2) 控制線的制備采用噴膜機，將包被緩沖液稀釋抗鼠IgG多克隆抗體，噴涂
在硝酰膜上，機器劃線，兩線間隔5mm，應細致均勻，室溫晾干20分鐘。封袋備用。
(3) 金標抗體的制備用O. lM碳酸鉀調膠體金pH值至7.6,按10微克抗體/毫升 膠體金加入抗豬流感病毒的單克隆抗體，混勻，靜置30分鐘，12000rpm離心三十分鐘， 棄上清，沉淀用標記洗滌液洗滌兩次，最后一次棄去上清，將沉淀用十分之一初始膠體 金體積的金標抗體保存液溶解，置4'C備用。
B. 樣品墊制備將制備好的金標抗體涂覆在硝酰纖維素膜上。所述涂覆金標抗體的 硝酰纖維素膜可以用普通方法將金標抗體涂覆在硝酰纖維素膜上，也可以通過下述方法 得到將標記好的膠體金均勻地鋪在硝酰纖維素膜上，每毫升溶液鋪10平方厘米，冷凍 干燥，封袋，置4'C備用。
4C.在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊(硝酰纖維素膜)、玻璃纖維膜、包被膜以 及吸水紙，得到試紙板，按照要求切割成不同寬度的試紙條。
本實用新型所述的一種快速檢測豬流感病毒的膠體金測試試紙條，采用高純度的抗 豬流感病毒的單克隆抗體作為包被抗原進行特異的豬流感病毒檢査。其原理是試紙條中 含均勻分布的膠體金標記豬流感病毒的單克隆抗體，抗豬流感病毒的抗體及抗鼠IgG抗 體分別固定于硝酰膜上并呈兩條線上下排列，抗鼠IgG抗體在上方為陰性對照，抗豬流
感病毒的抗體在下方為檢測線。當被檢樣中含有豬流感病毒的抗原時，豬流感病毒先和
金標記的豬流感病毒的抗體進行特異性吸附，形成Ag-Abe復合物。由于微孔濾膜的毛細 管作用和層析作用，反應復合物沿硝酰膜向前移動，待行至抗a豬流感病毒的抗體線時， 形成Ab a -Ag-Ab P -Au復合物而富集在包被線上，最終形成一條紅色沉淀線，是為豬流 感病毒的陽性反應。而試紙條上無關的金標記鼠IgG隨尿液繼續(xù)上行至抗鼠IgG抗體處， 與之形成紅色標記的抗原抗體復合物是為陰性對照。
用于檢測時，觀察檢測線6和控制線7的顯色和形狀來判斷陽性還是陰性。如圖3 (al)所示，當檢測線6和控制線7均顯色時，結果為陽性；如圖3 (a2)所示，當控制 線7顯色而檢測線6不顯色時，結果為陰性。
本實用新型所述包被緩沖液和封閉液的配方及制備方法是本領域通用的技術。
本實用新型采用雙抗體夾心法，可用來檢測血液樣品或者棉拭子等處理樣品。與現(xiàn) 有檢測試劑盒比較，由于對檢測線(T線)和控制線(C線)進行了特殊的處理，使其能 夠產生特異條帶，從而滿足現(xiàn)地農戶、基層檢測的需求。
本實用新型利用現(xiàn)代國際最先進的膠體金免疫層析技術，提供一種用于現(xiàn)地農戶、 基層自測等檢測豬流感病毒的快速診斷測試試紙條。該測試試紙條具有高度特異性、靈 敏度、檢測速度等優(yōu)點，且不需使用儀器設備，成本低廉，操作簡便，能廣泛應用于現(xiàn) 地農戶、基層及個人對于豬流感病毒的檢測。該試紙條可以直接使用，也可以裝配在塑 料裝置中以檢測板形式使用。該檢測試紙條或檢測板形式使用。
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圖l為本實用新型所述試紙條的平面結構示意圖。其中(1)為底襯、(2)為樣品墊、(3)為玻璃纖維膜或聚酯膜、(4)為包被膜、以(5)為吸水紙、(6)為檢測線； (7)為控制線。
圖2為本實用新型所述試紙條的側面結構示意圖。其中(1)為底襯、(2)為樣品 墊、(3)為玻璃纖維膜或聚酯膜、(4)為包被膜、以(5)為吸水紙、(6)為檢測線； (7)為控制線。
圖3為試紙條檢測結果示意圖，其中圖3 (al)表示試紙條檢測為陽性，(a2)所示, 當控制線7顯色而檢測線6不顯色時，結果為陰性。圖3 (a3)無效。
具體實施方式
為了簡單和清楚的目的，下文恰當的省略了公知技術的描述，以免那些不必要的細 節(jié)影響對本技術方案的描述。
以下結合附圖1-3,對本發(fā)明做進一步的說明。 實施例1
(1) 包被膜的制備1)檢測線的制備采用噴膜機，將包被緩沖液稀釋抗豬流感 病毒的單克隆抗體，噴涂在硝酰膜上，噴液量為25微升/35厘米，機器劃線，室溫晾干 20分鐘。2)控制線的制備采用噴膜機，將包被緩沖液稀釋抗鼠IgG多克隆抗體，噴 涂在硝酰膜上，噴液量為25微升/35厘米，機器劃線，兩線間隔5mm，應細致均勻，室 溫晾干20分鐘。封袋備用。
(2) 金標抗體的制備用0.1M碳酸鉀調膠體金pH值至7.5，按15微克抗體/毫升 膠體金加入抗豬流感病毒的單克隆抗體，混勻，靜置30分鐘，12000rpm離心30分鐘， 棄上清，沉淀用標記洗滌液洗滌兩次，最后一次其去上清，將沉淀用十分之一初始膠體 金體積的金標抗體保存液溶解，置4"C備用，效期7天；
(3) 涂覆金標抗體的硝酰纖維素膜的制備將制備好的金標抗體涂覆在硝酰纖維素 膜上。也可以將標記好的膠體金均勻地鋪在硝酰纖維素膜上，每毫升溶液鋪10平方厘米， 冷凍干燥，封袋，置4'C備用。
然后按圖1所示，在底襯U)上順次相互搭接地粘帖樣品墊(2)、玻璃纖維膜(3)、 包被膜(4)以及吸水紙(5)得到試紙板，按照要求切割成不同寬度的試紙條。其中包被膜 (4)上有檢測線(6)和控制線(7),檢測線(6)包被豬流感病毒的抗單克隆抗體，控制線(7)包被抗鼠IgG抗體?？刂凭€(7)和檢測線(6)為上下排列，其間隔為5mm。 通過檢測線(6)和控制線(7)的顯色和形狀來判斷陽性還是陰性。 實施例2
包被膜、涂覆金標抗體的硝酰纖維素膜的制備過程同實施例1。
按圖l所示，在底襯(1)上順次相互搭接地粘帖樣品墊(2)、玻璃纖維膜(3)、
包被膜(4)以及吸水紙(5)得到試紙板，按照要求切割成不同寬度的試紙條。其中包被膜 (4)上有檢測線(6)和控制線(7)，檢測線(6)包被豬流感病毒的抗多克隆抗體，
控制線(7)包被抗鼠IgG抗體?？刂凭€(7)和檢測線(6)為上下排列，其間隔為3mm。
通過檢測線(6)和控制線(7)的顯色和形狀來判斷陽性還是陰性。
實施例3
(1) 大板的粘貼按要求把包被膜、吸水紙、凍干金標抗體、玻璃纖維膜粘貼在塑 料底板上，組成大板。組裝車間溫度控制在25。C，濕度20%-30%。
(2) 切條用切條機將大板切成單個人份，每人份寬度3毫米，隨機抽檢，靈敏度 能檢出室內質控，條帶顯色程度達到一個"+ "號，無非特異性條帶。
用于檢測時，觀察檢測線6和控制線7的顯色和形狀來判斷陽性還是陰性。如圖3 (al)所示，當檢測線6和控制線7均顯色時，結果為陽性；如圖3 (a2)所示，當控制 線7顯色而檢測線6不顯色時，結果為陰性。 實施例4
試劑盒將l份已切好的試紙條與一包干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內，放入試劑盒，
與4-2(TC避光保存。用于檢測時，觀察檢測線6和控制線7的顯色和形狀來判斷陽性還 是陰性。如圖3 (al)所示，當檢測線6和控制線7均顯色時，結果為陽性；如圖3 (a2) 所示，當控制線7顯色而檢測線6不顯色時，結果為陰性。如圖3 (a3)所示當控制線7 和檢測線6均不顯色時，結果無效。
權利要求1、一種快速檢測豬流感病毒的膠體金測試試紙條，其特征在于該試紙條是在底襯(1)上順次相互搭接地粘帖樣品墊(2)、玻璃纖維膜或聚酯膜(3)、包被膜(4)以及吸水紙(5)組成；其中的包被膜(4)上印制有控制線(7)和檢測線(6)；所述控制線(7)包被抗鼠IgG抗體，檢測線(6)包被抗豬流感病毒抗體；通過控制線(7)和檢測線(6)的顯色來定性判斷。
2、 根據權利要求1所述的測試試紙條，其中所述底襯(1)為不吸水的塑料硬紙板；樣品墊(2)為膠體金顆粒標記抗豬流感病毒的單克隆抗體的硝酰纖維素膜。
3、 根據權利要求1所述的測試試紙條，其中所述包被膜為硝酰纖維素膜。
4、 根據權利要求1所述的快速檢測豬流感病毒的膠體金測試試紙條，其中所述包被 的抗豬流感病毒的抗體為高純度的單克隆抗體和/或多克隆抗體。
5、 根據權利要求1所述的快速檢測豬流感病毒的膠體金測試試紙條，其中所述膠體 金顆粒標記抗豬流感病毒的單克隆抗體為高純度的單克隆抗體。
6、 根據權利要求1所述的快速檢測豬流感病毒的膠體金測試試紙條，其中所述的控 制線(7)與檢測線(6)上下排列，其間隔為3-5mm。
7、 根據權利要求1所述的快速檢測豬流感病毒的膠體金測試試紙條，其中可將包被 膜(4)、吸水紙(5)、玻璃纖維膜或聚酯膜(3)粘貼在塑料底板上，組成大板或將l份 已切好的試紙條與干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內，組成試劑盒。
專利摘要本實用新型涉及一種快速檢測豬流感病毒的膠體金測試試紙條。所述的試紙條是在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、涂覆金標抗體的玻璃纖維膜、包被膜以及吸水紙而形成，包被膜有檢測線和控制線，檢測線包被豬流感病毒的抗體，控制線包被抗鼠抗體；所述檢測線和控制線通過控制膠體金顆粒的大小與多少，得到顏色不同深淺的檢測線和控制線從而確定豬流感病毒的有無。該試紙條具有特異性強，敏感性高，操作簡便快速，檢測結果顯示直觀，準確，成本低，投資少，不需專用儀器設備及專業(yè)人員的特點，容易推廣實施，具有較高的社會價值和經濟價值。
文檔編號G01N33/569GK201397332SQ20092009666
公開日2010年2月3日 申請日期2009年5月8日 優(yōu)先權日2009年5月8日
發(fā)明者孫英峰, 崔尚金, 健 張, 莉 張, 張國偉, 李志榮, 李秀麗, 王英珍, 鄢明華 申請人:天津市畜牧獸醫(yī)研究所