專利名稱：藥物組合物、藥物篩選方法和用于治療瘧疾的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明適用于生產(chǎn)抗瘧疾劑的制藥領(lǐng)域。 現(xiàn)有技術(shù)瘧疾是嚴重的人類寄生蟲疾病，其致病因素是瘧原蟲屬(Plasmodium)的原生動物。每年有大約五億人被感染，每年引起接近二百萬至三百萬的的非洲兒童死亡。在巴西，自2002年以來，亞馬遜行政區(qū)(Legal Amazonia)的病例數(shù)量顯示了 25%的增長， 在2004年有大約46萬例，而由惡性瘧原蟲(P. falciparum)引起的瘧疾病例數(shù)的比例增長了 27%，惡性瘧原蟲是引起致死性最高的此類疾病的物種(Garcia CRS, Azevedo MF, Wunderlich G,Budu A,Young Jand Bannister L. G(2008)Plasmodium in the Post Genome Era :Newinsights into the molecular cell biology of the malaria parasites. International Review of Molecular and Cell Biology 266 :85-156)。雖然對控制瘧疾進行了無數(shù)的努力，但是病例數(shù)仍然持續(xù)增加，這是因為寄生蟲對多數(shù)可獲得的抗瘧疾劑產(chǎn)生了抗性，以及出現(xiàn)了殺蟲劑抗性的蚊子，這使得有必要開發(fā)替代性的策略以根除此疾病。在這個意義上，最大的障礙之一是瘧疾寄生蟲及其與人類宿主和載體昆蟲之間的相互作用的復雜性。
_4] 赫I 觸白姓■其月射^L -針航側(cè)惡性瘧原蟲的無性周期發(fā)生于人類宿主中，感染起始于雌性瘧蚊的叮咬，其通過唾液注入子孢子。最近證明，最先注入的子孢子穿過真皮，它們中僅有一少部分進入毛細血管，而其它子孢子進入淋巴管并且形成紅細胞外的形式，該形式在那之前是未知的，其可能對宿主免疫系統(tǒng)具有重要影響(Amino R，Thiberge S，Martin B, Celli S，Shorte S， Frischknecht F & Menard R(2006)Quantitative imaging ofPlasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med 12 :220-224)。一旦處于血流之中，子孢子會侵襲肝細胞并發(fā)育為紅細胞外的形式，其使細胞破裂并將裂殖子釋放到血液中(Mota MM, PradelG, Vanderberg JP, Hafalla JCR, Frevert U，Nussenzweig RS, Nussenzweig V & Rodriguez A(2001)Migration of Plasmodiumsporozoites through cells before infection)。裂殖子侵襲紅細胞并在含蟲空泡(parasitophorous vacuole)內(nèi)發(fā)育，經(jīng)歷數(shù)個生物化學和形態(tài)學變化，所述變化基本上可通過三個階段即環(huán)狀體、滋養(yǎng)體和裂殖體來鑒定。紅細胞破裂釋放裂殖子，這允許紅細胞內(nèi)的周期的持續(xù)性(Bmnister LH，Hopkins JM，F(xiàn)owler RE, Krishna S & Mitchell GH(2000)A brief illustrated guide to the ultrastucture of Plasmodiumfalciparum asexual blood stages. Parasitol Today 16 :427-433)0血流中的一些寄生蟲發(fā)育成配子體，其為針對載體蚊子的感染形式，在載體蚊子中發(fā)生有性周期。在蚊子的腸道中發(fā)生配子體的成熟，該過程被稱作配子形成，然后發(fā)生受精作用，即雄性和雌性配子結(jié)合而生成受精卵。該受精卵遷移并黏附至腸的上皮，在那里其發(fā)育成卵囊。當卵囊破裂時，其釋放子孢子，子孢子進入唾液腺并且在蚊子攝食時被釋放 (Ghosh A， Edwards MJ & Jacobs-Lorena M(2000)Thejourney of the malaria parasiteinto the mosquito :Hopes for the newcentury. Parasitol Today 16:196-201)。除了在宿主和載體蚊子中的寄生蟲形式的極大的多樣性之外，瘧原蟲屬的幾個物種的生命周期的一個重大特征是其同步性和周期性。從上世紀初開始，已經(jīng)觀察到在配子體形成(寄生蟲的有性形式)時具有此類獨特的周期性，以瘧原蟲屬的幾個物種進行的所有研究均顯示在午夜出現(xiàn)配子體生產(chǎn)高峰(每M小時)，其通常與蚊子攝食的時間相同。 通過這種方式，配子體的晝夜節(jié)律必然是對于載體蚊子中寄生蟲有性周期的維持的重要適應(yīng)性(Garcia CRS,Markus RP Madeira L(2001)Tertian and quartan fevers :temporal regulation inmalarial infection. J Biol Rhythms 16:436-443)。到目前為止，尚未鑒定出負責誘導脊椎動物宿主血流中形成配子體的信號。關(guān)于無性形式，紅細胞內(nèi)階段的高度同步性引起反復發(fā)燒和打冷顫，總是以M小時倍數(shù)的時間階段內(nèi)，這與實際中的數(shù)以十億的裂殖子同時釋放至血流中是一致的。這是侵襲宿主免疫系統(tǒng)的重要機制，其引起了研究人員的注意，已經(jīng)數(shù)十年了。在2000年，根據(jù)我們實驗室進行的一項研究，Hotta等人根據(jù)體外和體內(nèi)手術(shù)試驗(切除松果腺)以及藥理學上的(使用2-苯基-N-乙酰色胺(luzindole)，其為褪黑激素拮抗劑)松果體切除的小鼠報道褪黑激素使夏氏瘧原蟲(P. chabaudi)和惡性瘧原蟲的成熟期同步。還證明，該激素在體外引起從瘧原蟲細胞內(nèi)供應(yīng)中釋放Ca2+。褪黑激素對寄生蟲周期的效應(yīng)被磷酸脂酶C抑制劑(U73122)阻斷，這說明褪黑激素的作用機理可能是通過結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體，引起磷脂酶C的激活，并且通過IP3增加細胞內(nèi)Ca2+水平(Hotta CT, Gazarini M,Beraldo FH,Varotti FP,Lopes C, Markus RP,Pozzan T & GarciaCRS(2000) Calcium-dependent modulation by melatonin of thecircadian rhythm in malarial parasites. Nature Cell Biology 2 :466-468)。宿主產(chǎn)生的此類激素的濃度的周期性變化可能是該寄生蟲在體內(nèi)的成熟同步化控制的關(guān)鍵信號。瘧原蟲的細胞內(nèi)信號傳導瘧疾寄生蟲的復雜生命周期的特征在于連續(xù)的特化的發(fā)育階段，并且其中每個階段對于周期連續(xù)都是必不可少的。為了確定惡性瘧原蟲基因組表達圖譜所進行的數(shù)項微排列研究揭示寄生蟲的紅細胞內(nèi)階段具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的專門機制，其引起具有相關(guān)功能的基因表達的連續(xù)級聯(lián)(Bozdech Z, Llina M, Pulliam BL, Wong ED，Zhu J & DeRisijU2003) The Transcriptome of the Intraerythrocytic DevelopmentalCycle of Plasmodium falciparum. PLOS Biology 1 :1-16 ；Le Roch KG, Zhou Y, Blair PL, Grainger M, Moch JK, Haynes JD, De La Vega P, Holder AA, Batalov S, Carucci DJ & Winzeler EA (2003) Discovery ofgene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle. Science 301 :1503-1508)。此外已經(jīng)證明，瘧原蟲生命周期的一些階段能夠響應(yīng)于來自脊椎動物宿主或載體昆蟲的信號，從而其細胞分化過程與該寄生蟲所生存的環(huán)境同步 (Hotta CTiGazarini M，Beraldo FHiVarotti FP,Lopes C，Markus RPiPozzan T & Garcia CRS(2000) Calcium-dependent modulation by melatonin of the circadian rhythmin malarial parasites. Nature Cell Biology 2 :466-468. ；Beraldo FH, Almeida FM, da Silva AM & Garcia CRS(2005)Cyclic AMP andcalcium interplay as second messengers in melatonin—dependentregulation of Plasmodium falciparum cell cycle. J Cell Biol 170 :551-557 ；Garcia GE, Wirtz RA, Barr JR, Woolfitt & Rosenberg R(1998)Xanthurenic acid induces gametogenesis in Plasmodium,themalaria parasite. J Biol Chem 273(20) :12003-12005)。載體蚊子腸道中的配子形成可用作研究涉及環(huán)境感知和寄生蟲生理應(yīng)答(激活形態(tài)發(fā)生過程，其引起寄生蟲細胞周期朝著形成成熟配子以進行受精的方向進展)的信號傳導途徑的研究的重要性的實例。黃尿酸，一種通過色氨酸代謝而從蚊子唾液腺中產(chǎn)生的分子，被鑒定為源自載體昆蟲的因子，其能夠誘導雄性配子出絲(Billker 0，LindoV, Pmico MiEtienne AEiPaxton TiDell AiRogers MiSinden RE Morris HR(1998)Identification of xanthurenic acid as the putativeinducer of malaria development in the mosquito. Nature 392 :289-292. ；Garcia GE, Wirtz RA, Barr JR, Woolfitt & Rosenberg R(1998)Xanthurenic acid induces gametogenesis in Plasmodium，the malariaparasite. J Biol Chem 273(20) :12003-12005. ；Hirai M，Yoshida S，IshiiA & Matsuoka H(2001)Characterization and identification ofexfIageIlation-inducing factor in the salivary gland of Anophelesstephensi(Diptera :Culicidae). Biochem Biophys Res Comm 287:859-864)。XA誘導的作用機理之一是出絲過程中的膜磷脂水解，從而產(chǎn)生IP3和DAG，從寄生蟲的細胞內(nèi)供應(yīng)中釋放鈣，并增加GMPc的細胞內(nèi)水平(Kawamoto F， Alejo-Blanco R， Fleck SL， Kawamoto Y& Sinden RE(1990) Possible roles of Ca2+ and cGMP as mediators ofthe exflagellation of Plasmodium berghei and Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol 42 :101-108. ；Martin SK, Jett M & ScheneiderI(1994)Correlation of phosphoinositide hydrolysis with exflagellationin the malaria microgametocyte. J Parasitol 80 :371-378. Billker 0， Dechamps S， Tewari R， Wenig G， Franke-Fayard B & Brinkmann V(2004)Calcium and calcium-dependent protein kinase regulategamete formation and mosquito transmission in a malaria parasite. Cell 117 :503-514)。此外還證明，由于此類第二信使的產(chǎn)生而激活效應(yīng)酶，例如鳥苷酰環(huán)化酶和⑶PK4鈣依賴性激酶(Muhia DK，SwalesCA, Deng W，Kelly JM & Baker DA(2001)The gametocyte-activatingfactor xanthurenic acid stimulates an increase inmembrane-associated guanylyl cyclase activity in the human malariaparasite Plasmodium falciparum. Mol Microbiol 42 :553-60.； Billker 0，Dechamps S，Tewari R，Wenig G，F(xiàn)ranke-Fayard B & Brinkmann V(2004) Calcium and calcium-dependent protein kinase regulategamete formation and mosquito transmission in a malaria parasite. Cell 117:503-514)。CDPK4 丐依賴性蛋白激酶被鑒定為鈣分子靶標之一，其將XA信號轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌耘渥芋w中細胞周期進展的調(diào)節(jié)應(yīng)答。關(guān)于寄生蟲的無性周期，我們實驗室證明由脊椎動物宿主松果腺周期性產(chǎn)生的褪黑激素使夏氏瘧原蟲和惡性瘧原蟲的無性期同步(Hotta CT, Gazarini M，Beraldo FH, Varotti FP, Lopes C, Markus RP, Pozzan T & Garcia CRS(2000)Calcium-dependent modulation bymelatonin of the circadian rhythm in malarial parasites. Nature CellBiology 2 :466-468. ；Hotta CT, Markus RP & Garcia CRS(2003)Melatonin and N-acetyl-serotonin cross the red blood cell membraneand evoke calcium mobilization in malarial parasites. Braz J Med BiolRes 36:1583-7)。極黑激素是能夠穿過生物膜的親脂性分子，其穿過方式為與細胞外和細胞內(nèi)靶標相互作用。Hotta CT, Markus RP &Garcia CRS(2003)Melatonin and N-acetyl-serotonin cross the redblood cell membrane and evoke calcium mobilization in malarialparasites. Braz J Med Biol Res 36 :1583-7. Beraldo FH，Almeida FM,da Silva AM & Garcia CRS(2005)Cyclic AMP and calcium interplayas second messengers in melatonin—dependent regulation ofPlasmodium falciparum cell cycle. J Cell Biol 170 :551-557證明即使是在完整的感染的紅細胞中，褪黑激素也能夠引起夏氏瘧原蟲和惡性瘧原蟲細胞內(nèi)鈣供給的移動，這說明其一定能夠穿過紅細胞膜和含蟲空泡，然后激活寄生蟲膜受體。Gazarini ML，Thomas APiPozzan T &Garcia CRS(2003)Calcium signaling in a low calcium environment :how the intracellular malaria parasite solves the problem. J Cell Bioll61 :103-110證明含蟲空泡是富含鈣的微環(huán)境，其對于產(chǎn)生鈣介導的細胞內(nèi)信號傳導的條件是必不可少的。此外還證明，色氨酸分解代謝的其它產(chǎn)物例如N-乙酰5-羥色胺、5-羥色胺和色胺也能夠同步惡性瘧原蟲周期并使Ca2+移動(Beraldo，F(xiàn)H & Garcia CRS(2005)Products of tryptophan catabolism induce aCa2+ release and modulate the cell cycle of P. falciparum malariaparasites. J Pineal Res 39:224-230)。褪黑激素的分子內(nèi)靶標之一是 Ca2+-依賴性硫醇蛋白酶(Farias SL, Gazarini ML, Melo RL, HirataIY, Juliano MA, Juliano L & Garcia CRS(2005)Cysteine-proteaseactivity elicited by Ca(2+) stimulus in Plasmodium. Mol BiochemParasitol 141:71-79)。除了第二 Ca2+信使之外， Beraldo, FH & GarciaCRS(2005)Products of tryptophan catabolism induce a Ca2+ releaseand modulate the cell cycle of P. falciparum malaria parasites. JPineal Res 39 :224-230 ；Beraldo FH, Almeida FM, da Silva AM &Garcia CRS(2005)Cyclic AMP and calcium interplay as secondmessengers in melatonin-dependent regulation of Plasmodiumfalciparum cell cycle. J Cell Biol 170 :551-557 證明褪黑激素誘導 AMPc 的增加和PKA的激活，在此事件之前是細胞內(nèi)Ca2+的增加，其被磷脂酶C(U73122)抑制劑和細胞內(nèi)Ca2+螯合劑BAPTA-AM阻止。事實上還證明，響應(yīng)于褪黑激素而產(chǎn)生的AMPc也誘導Ca2+的釋放，這證明瘧疾寄生蟲中這兩個第二信使的途徑之間的復雜關(guān)系(Beraldo FH, Almeida FM, da Silva AM & Garcia CRS(2005)CyclicAMP and calcium interplay as second messengers inmelatonin—dependent regulation of Plasmodium falciparum cell cycle. J Cell Biol 170 :551-557)。因此，瘧原蟲中褪黑激素激活的信號傳導途徑表明了 G蛋白偶聯(lián)受體介導的信號傳導(GPCRs)，一旦其參與啟動磷脂酶C和腺苷酰環(huán)化酶的激活，則產(chǎn)生 Ca2+第二信使和 cAMP (Hotta CTiGazarini MiBeraldo FHiVarotti FPiLopes C，Markus RPiPozzan T & Garcia CRS(2000)Calcium-dependent modulation bymelatonin of the circadian rhythm in malarial parasites. Nature CellBiology 2:466—468.； Beraldo FH, Almeida FM, da Silva AM & GarciaCRS (2005)Cyclic AMP and calcium interplay as second messengersin melatonin-dependent regulation of Plasmodium falciparum cellcycle. J Cell Biol 170:551-557)。數(shù)項研究已經(jīng)鑒定了參與惡性瘧原蟲的細胞內(nèi)信號傳導級聯(lián)的蛋白，例如腺苷酰環(huán)化酶(AC)、鳥苷酰環(huán)化酶(GC)、PKA、PKG、RACK、Ca2+-ATPase、CDPKs,鈣調(diào)蛋白禾口 MAPKs(Aravind L， Iyer LM, Wellems TE & Miller LH(2003)Plasmodium biology genomicgleanings. Cell 115 :771-785. ；Baker DA & Kelly JM(2004)Purinenucleotide cyclases in the malaria parasite. TRENDS in Parasitol 20 :227-232. ；Madeira L， DeMarco R， Gazarini ML， Verjovski-Almeida S& Garcia CRS(2003)Human malaria parasites display a receptor foractivated C kinase ortholog. Biochem Biophys Res Comm 306 :995-1001. ；Ward PiEquinet LiPacker J and Doerig C (2004)Proteinkinases of the human malaria parasite Plasmodium falciparum :thekinome of a divergent eukaryote. BMC Genomics 5 79. ；Khan SM, Franke-Fayard B，Mair GR, Lasonder E， Janse CJ, Mann M &Waters AP (2005)Proteome analysis of separated male and femalegametocytes reveals novel sex-specific Plasmodium biology. Cell 121 675-687. ；Anamika，Srinivasan N & Krupa A (2005)A genomicperspective of protein kinases in Plasmodium falciparum. Proteins 58 :180-189)。然而，盡管惡性瘧原蟲基因組項目得出了結(jié)論(Gardner MJiHall NiFung EiWhite OiBerriman MiHyman RWiCarlton JM,PainA, Nelson KE，Bowman S，Paulsen IT，James K，Eisen JA，RutherfordK，Salzberg SL, Craig A，Kyes S，Chan MS，Nene V，Shallom SJ, SuhB, Peterson J，Angiuoli S， Pertea M，Allen JiSelengut JiHaft DiMather MWiVaidya ABiMartin DMiFairlamb AH, Fraunholz MJ，Roos DS，Ralph SA，McFadden GI，Cummings LM，Subramanian GM，Mungall C，Venter JCiCarucci DJiHoffman SLiNewbold C,DavisRW,Fraser CM & Barrell B (2002) Genome sequence of the humanmalaria parasite Plasmodium falciparum. Nature 419 498-511)，但是，尚未鑒定出作用于信號傳導級聯(lián)的初期的蛋白或細胞外信號的受體以及對它們及其效應(yīng)子之間進行調(diào)節(jié)的蛋白?？紤]到知曉瘧疾寄生蟲的來自宿主/載體的細胞外信號的重要性(它們的自身細胞周期根據(jù)它們所處的環(huán)境而被調(diào)節(jié))，鑒定信號傳導途徑蛋白對于解釋這種非常相關(guān)的寄生蟲-宿主關(guān)系的生物學機理是必不可少的，這可以對生產(chǎn)抗瘧疾劑作出貢獻。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含一種或多種與存在于瘧原蟲屬的寄生蟲中的蛇形受體(serpentine receptor)結(jié)合的化合物以及藥學上可接受的賦形劑。本發(fā)明還包括藥物篩選方法和用于治療瘧疾的方法。
具體實施例方式雖然蛇形受體是熟知的，但是對于惡性瘧原蟲而言，細胞外信號的膜受體仍然是未知的。蛇形受體是包含7個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白，其作用于分子識別中。G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，一般被稱作蛇形受體或七個螺旋的受體。蛇形受體是包含7個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白，其作用于分子識別中，此類受體介導對數(shù)種刺激因素例如光、氣味、信息素、激素、神經(jīng)傳遞素、小肽、蛋白、脂和離子的應(yīng)答(Hall RA, Premont RT &Lefkowitz RJ(1999)Heptahelical receptor signaling :beyond theG-protein paradigm. J Cell Biol 145:927-932)。
根據(jù)傳統(tǒng)觀點，GPCR經(jīng)由結(jié)合鳥嘌呤核苷酸的異三聚體蛋白(G蛋白)而與例如腺苷酰環(huán)化酶或鳥苷酰環(huán)化酶、A2或C磷脂酶和離子通道的效應(yīng)蛋白偶聯(lián)。然而，現(xiàn)在證明， 很多7個螺旋的受體介導的過程不依賴于G蛋白而進行(Hall RA,Premont RT & Lefkowitz RJ(1999)Heptahelical receptor signaling :beyond the G-proteinparadigm. J Cell Biol 145 :927-932. ；Brzostowski JA & Kimmel AR(2001)Signaling at zero G G-protein-independent functions for7-TM-receptors. TRENDS Biochem Sci 26 291-297.)。GPCR是最廣泛的膜受體類別，在細菌、真菌、植物和所有的后生動物生物體中都有其成員。雖然其具有包含7個跨膜結(jié)構(gòu)域(7-TM)的保守性結(jié)構(gòu)，但是GPCR是高度多樣化的，每個家族成員在保守性跨膜區(qū)內(nèi)的氨基酸水平僅有25%的同一性，在不同家族之間則有 艮{氐的才目 1以個生(Pierce KL, Premont RT & Lefkowitz RJ (2002) Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol 3:639-50·)。因此，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含一種或多種與存在于瘧原蟲屬的寄生蟲中的蛇形受體結(jié)合的化合物以及藥學上可接受的賦形劑。蛇形受體可以屬于以下家族視紫紅質(zhì)(家族A)、分泌素(家族B)和親代謝型谷氨酸受體(家族C)。此外，蛇形受體可以是 G蛋白依賴性的或非依賴性的。受體可以存在于瘧原蟲屬的以下種中惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)、 夏氏瘧原蟲(Plasmodium chabaudi)、約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelli)、間日瘧原蟲 (Plasmodium vivax)、三曰皰原蟲(Plasmodium malariae)、伯氏皰原蟲(Plasmodium berghei)?？梢酝ㄟ^口服、胃腸外、直腸或表面途徑使用藥物組合物。如果經(jīng)口服使用，則可以使用片劑、藥丸、粉末(明膠膠囊、扁囊劑)或小丸、溶液、懸浮液、乳液、糖漿和藥學上可接受的西也劑。對于胃腸外給藥，優(yōu)選水性或非水性溶液、懸浮液或乳液。直腸給藥的組合物為栓劑或直腸膠囊。對于表面給藥，可以使用例如霜、洗液、眼滴液、漱口液、鼻滴液或噴霧劑。本發(fā)明還描述了使用存在于瘧原蟲屬的寄生蟲中的蛇形受體的篩選方法和用于治療瘧疾的方法。蛇形受體可以分類為視紫紅質(zhì)(家族A)、分泌素(家族B)和親代謝型谷氨酸受體(家族C)。蛇形受體可以是G蛋白依賴性的或非依賴性的。與蛇形受體結(jié)合的化合物可以是信息素、激素、神經(jīng)傳遞素、小肽、蛋白、脂和離子。受體可以存在于瘧原蟲屬的以下種中惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)、 夏氏瘧原蟲(Plasmodium chabaudi)、約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelli)、間日瘧原蟲 (Plasmodium vivax)、三曰皰原蟲(Plasmodium malariae)、伯氏皰原蟲(Plasmodium berghei)。篩選方法使用哺乳動物細胞中的蛇形受體的基因轉(zhuǎn)染。在異源系統(tǒng)中表達此類基因之后，通過加入數(shù)種針對蛇形受體的潛在配體而測定細胞的鈣濃度變化。以下是實施例，其是為了更好地解釋本發(fā)明的范圍，不是作為本發(fā)明的限制性影響的基礎(chǔ)。實施例1 藥物篩選方法
Ca21功能測定以不含血清的200 μ L DMEM將細胞清洗3次，并以不含血清的DMEM中的Fluo_4 AM(5 μ Μ)在37°C標記1小時。標記之后，以含有2mM CaCl2的200 μ L HBSS緩沖液(5. 4mM KCUO. 3mMNa2HP04,0. 4mM KH2PO4,4. 2mM NaHCO3、0. 5mM MgCl2、0. 6mMMgS04、137mM NaCU 5.6mM葡萄糖)將細胞清洗3次。共聚焦顯微鏡用于成像獲取(激光掃描顯微鏡LSM 5IO-Carl Zeiss)，使用LSM510軟件，2. 5版。使用的物鏡是40倍的(油浸)。以氬激光在 488nm激發(fā)樣品，以505-530nm的帶通濾波器收集所產(chǎn)生的熒光。測定中包括加入想要測定其應(yīng)答的藥物。2-「@11-碘褪黑激素結(jié)合測定將使用針對蛇形受體的候選物轉(zhuǎn)染的C0S-7細胞在3000g離心5分鐘并儲存于-70°C直至使用。在結(jié)合緩沖液(IOmM Tris-HCl,ImMEDTA pH 7.5)中將細胞清洗2次。 將IxlO6個細胞在37°C與100pM2-[125I]-碘褪黑激素在200 μ L結(jié)合緩沖液(含有或不含 KTfiM的褪黑激素)中溫育2個小時，以檢測特異性結(jié)合。通過使用冰迅速冷卻樣品來終止反應(yīng)，然后加入溶解于冷的結(jié)合緩沖液中的0. 的綿羊γ-球蛋白和ImL 的PEG 8000。通過在4°C在1800g離心30分鐘回收與2-[1251]-碘褪黑激素結(jié)合的級份。棄上清， 將沉淀重懸于12%的PEG 8000和0.05% γ-球蛋白。通過再次離心回收沉淀物并在室溫干燥(Conway等人，1997)。通過閃爍計數(shù)器(Tri-Carb 2100 TRPackard)檢測放射活性?；蛎艽a子優(yōu)化通過商業(yè)途徑(DNA 2.0)進行推定的受體的完整ORF序列的密碼子優(yōu)化。為了增加在哺乳動物細胞中的表達，在構(gòu)建體的5’端加入Kozak共有序列(GCCGCC)，并且在3’端加入FLAG表位以監(jiān)視在異源系統(tǒng)中的表達。
權(quán)利要求
1.藥物組合物，其包含一種或多種與存在于瘧原蟲(Plasmodium)屬的寄生蟲中的蛇形受體結(jié)合的化合物以及藥學上可接受的賦形劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述受體可以屬于以下家族視紫紅質(zhì)(家族 A)、分泌素(家族B)和親代謝型谷氨酸受體(家族C)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述蛇形受體可以是G蛋白依賴性的或非依賴性的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述化合物可以是信息素、激素、神經(jīng)傳遞素、 小肽、蛋白、脂和離子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述受體可以存在于以下種中惡性瘧原蟲 (Plasmodium falciparum)、夏氏皰原蟲(Plasmodiumchabaudi)、約氏皰原蟲(Plasmodium yoelli)、間日皰原蟲(Plasmodiumvivax)、三日皰原蟲(Plasmodium malariae)、伯氏瘧原蟲(Plasmodiumberghei)。
6.藥物篩選方法，其中使用存在于瘧原蟲屬的寄生蟲中的蛇形受體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物篩選方法，其中該方法使用以下技術(shù)在以針對蛇形受體的基因候選物轉(zhuǎn)染的細胞中使用潛在配體篩選之后，測定鈣的增加或AMPC。
8.治療瘧疾的方法，包括一種或多種與存在于瘧原蟲屬的寄生蟲中的蛇形受體結(jié)合的化合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的治療瘧疾的方法，其中所述受體可以屬于以下家族視紫紅質(zhì) (家族A)、分泌素(家族B)和親代謝型谷氨酸受體(家族C)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的治療瘧疾的方法，其中所述受體可以是G蛋白依賴性的或非依賴性的。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的治療瘧疾的方法，其中所述化合物可以是信息素、激素、神經(jīng)傳遞素、小肽、蛋白、脂和離子。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的治療瘧疾的方法，其中所述受體可以存在于瘧原蟲屬的以下種中惡性皰原蟲(Plasmodium falciparum)、夏氏皰原蟲(Plasmodium chabaudi)、約氏皰 J^(Plasmodium yoelli) > fS] H^eJ^^, (Plasmodium vivax) >H H ^eJ^^, (Plasmodium malariae)、伯氏皰原蟲(Plasmodium berghei)。
全文摘要
本發(fā)明涉及存在于瘧原蟲屬的寄生蟲中的蛇形受體用于治療瘧疾的用途。
文檔編號G01N31/00GK102171564SQ200980139052
公開日2011年8月31日 申請日期2009年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月3日
發(fā)明者B·馬爾尼克, C·R·D·S·加西亞, L·M·D·席爾瓦, P·A·法沃雷托加蘭特 申請人:圣保羅國情研究援助基金會, 圣保羅大學