專利名稱：用于polyq蛋白的生物測定試驗(yàn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于與疾病相關(guān)的突變POLYQ蛋白的生物測定試驗(yàn)，以及其作為診斷工具用于監(jiān)測疾病進(jìn)展或用于監(jiān)測治療疾病的效力的用途。
背景技術(shù)：
許多疾病與具有多谷氨酰胺重復(fù)序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)有關(guān)，例如亨廷頓病(HD)、脊延髓肌萎縮癥、數(shù)種脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)和齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥 (dentatorubral-pallidoluysian atrophy)。這些病癥被共同地稱作‘多聚谷氨酰胺病，。 HD是最常見的遺傳性神經(jīng)變性疾病，流行率為5 8/100，OOO0其主要臨床表現(xiàn)包括運(yùn)動(dòng)功能障礙、精神病學(xué)障礙和癡呆。已經(jīng)嘗試了很多HD的對(duì)癥治療，但沒有任何實(shí)質(zhì)性成功 (Bonelli和Wenning, 2006)，也沒有經(jīng)批準(zhǔn)的HD療法存在(Bates, 2003)。HD是由九種常染色體顯性遺傳疾病組成的多聚谷氨酰胺(polyQ)疾病家族的創(chuàng)建成員，這些疾病的共同特征是在不同遍在表達(dá)的蛋白質(zhì)中polyQ-重復(fù)序列的擴(kuò)展(Ross，200 。引起HD的遺傳突變是在亨廷頓蛋白(himtingtin protein)中的多谷氨酰胺擴(kuò)展。超過36個(gè)谷氨酰胺的擴(kuò)展變?yōu)橹虏⌒缘?，似乎影響蛋白質(zhì)折疊和毒性胞內(nèi)片段與聚集體的后續(xù)形成。亨廷頓蛋白基因(Htt)中擴(kuò)展的polyQ重復(fù)序列位于外顯子1中，引起突變型polyQ-Htt蛋白的表達(dá)(Gusella等人，198；3)。polyQ-重復(fù)序列擴(kuò)展可促使從天然無規(guī)卷曲構(gòu)象轉(zhuǎn)化成由多谷氨酰胺鏈之間的氫鍵限定的圓柱狀平行折疊構(gòu)象(Perutz等人，1994)。與具有蛋白質(zhì)錯(cuò)折疊特征的其它神經(jīng)變性疾病(如阿爾茨海默病或帕金森病)類似，具有螺旋折疊構(gòu)象的這些蛋白質(zhì)傾向于形成不可溶蛋白聚集體(Benzinger等人，2000)。當(dāng)通過RNA干擾(DiFiglia等人，2007)或通過四環(huán)素調(diào)節(jié)的條件表達(dá)(Yamamoto 等人，2000)使HD小鼠模型的腦中突變型Htt的表達(dá)下調(diào)時(shí)，HD樣癥狀逆轉(zhuǎn)。有意思的是， 突變型polyQ-Htt和野生型-Htt被細(xì)胞有差異地代謝，并顯示不同模式的翻譯后修飾(磷酸化(Warby 等人，2005)、蛋白水解斷裂(Gafni 等人，2004 ；Graham 等人，2006 ；Wellington 等人，2002)、細(xì)胞定位(Davies 等人，1997 ;van Roon-Mom 等人，2002)和降解(Ravikumar 等人，2002)。這些發(fā)現(xiàn)激勵(lì)了對(duì)如下HD療法的研發(fā)工作，所述HD療法目的在于例如通過分子伴侶系統(tǒng)的上調(diào)或自體吞噬降解途徑的誘導(dǎo)而影響突變型Htt的錯(cuò)折疊或清除 (Yamamoto等人，2006)。這些方法可以在由蛋白錯(cuò)折疊引起的其它神經(jīng)變性疾病中應(yīng)用。目前，尚沒有可用的生物測定試驗(yàn)可以在例如臨床試驗(yàn)或治療中評(píng)價(jià)此類療法對(duì)突變型多谷氨酰胺蛋白質(zhì)，例如突變型Htt水平的影響。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于與疾病相關(guān)的可溶性突變POLYQ蛋白的生物測定試驗(yàn)，以及其作為診斷工具用于監(jiān)測疾病進(jìn)展或用于監(jiān)測治療疾病的效力的用途。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的生物測定試驗(yàn)是一種用于Htt檢測的新的均相時(shí)間分辨Fiirster共振能量轉(zhuǎn)移法，該方法適宜在神經(jīng)元細(xì)胞系中的高通量篩選。我們證實(shí)， 可以修改這種“時(shí)間分辨Fiirster共振能量轉(zhuǎn)移免疫測定試驗(yàn)”(在下面稱作“生物測定試驗(yàn)”)，以定量細(xì)胞、動(dòng)物和人樣品中的內(nèi)源性全長可溶性polyQ-Htt。該生物測定試驗(yàn)的應(yīng)用使得可以在臨床前和臨床試驗(yàn)以及在治療性處理中將可溶性突變型Htt用作疾病進(jìn)展的標(biāo)志或用于監(jiān)測藥物處理的效力。由于本方法的設(shè)計(jì)具有高靈活性，所以其適用于于在其它疾病中使用，尤其是與PolyQ-家族的其它成員相關(guān)的疾病。這些蛋白質(zhì)通常被胞內(nèi)表達(dá)，迄今還沒有對(duì)診斷和/或監(jiān)測疾病進(jìn)展/治療有用的測定法。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該生物測定試驗(yàn)測量POLYQ蛋白，例如polyQ 亨廷頓蛋白的可溶性形式。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該生物測定試驗(yàn)測量 POLYQ蛋白，例如polyQ亨廷頓蛋白的聚集形式。在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該生物測定試驗(yàn)既測量可溶性形式的POLYQ蛋白(例如polyQ亨廷頓蛋白)，又測量聚集形式的POLYQ蛋白(例如polyQ亨廷頓蛋白)。因此，一方面，本發(fā)明提供了用于測量生物樣品中突變形式(polyQ形式)的蛋白質(zhì)的量的免疫測定試驗(yàn)，其中該蛋白質(zhì)選自亨廷頓蛋白、雄激素受體、萎縮蛋白 (atrophin) 1、共濟(jì)失調(diào)蛋白(ataxin) 1、共濟(jì)失調(diào)蛋白2、共濟(jì)失調(diào)蛋白3、共濟(jì)失調(diào)蛋白7、 TATA盒結(jié)合蛋白或α Ia電壓依賴性鈣通道亞基。在根據(jù)本發(fā)明的免疫測定試驗(yàn)的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在該免疫測定試驗(yàn)中還測量樣品中相應(yīng)野生型蛋白的絕對(duì)量或相對(duì)量。在根據(jù)本發(fā)明的免疫測定試驗(yàn)的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，還測量突變蛋白的翻譯后修飾的程度，例如表達(dá)蛋白的細(xì)胞修飾，例如通過例如蛋白水解斷裂的片段化、磷酸化、乙?；⒎核鼗?、SUMO化、脂質(zhì)修飾或多肽主鏈的其它共價(jià)修飾。在根據(jù)本發(fā)明的免疫測定試驗(yàn)的再一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該免疫測定試驗(yàn)是單步驟測定試驗(yàn)，即，其中無需分離或洗滌且可以優(yōu)選地在單個(gè)生物化學(xué)操作后運(yùn)行的免疫測定試驗(yàn)。在根據(jù)本發(fā)明的免疫測定試驗(yàn)的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該免疫測定試驗(yàn)的檢測技術(shù)以時(shí)間分辨Fiirster共振能量轉(zhuǎn)移或電化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)。在根據(jù)本發(fā)明的免疫測定試驗(yàn)的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該免疫測定試驗(yàn)的檢測技術(shù)是時(shí)間分辨Fiirster共振能量轉(zhuǎn)移。在根據(jù)本發(fā)明的免疫測定試驗(yàn)的再一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該免疫測定試驗(yàn)包括下列步驟a)將生物樣品與用鑭系元素離子穴狀化合物(例如銪或鋱穴狀化合物)標(biāo)記的第一抗體和用適于檢測鑭系元素發(fā)射的信號(hào)的熒光團(tuán)標(biāo)記的第二抗體接觸，其中一種抗體對(duì)突變型蛋白的polyQ部分具有特異性，而另一抗體對(duì)該突變型亨廷頓蛋白的不同部分具有特異性，和b)通過時(shí)間分辨FSrster共振能量轉(zhuǎn)移，測量來自熒光團(tuán)的熒光，而定量樣品中突變型POLYQ蛋白的量。在根據(jù)本發(fā)明的免疫測定試驗(yàn)的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，還通過將樣品與對(duì)該蛋白質(zhì)的野生型形式具有特異性且用適于檢測鑭系元素發(fā)射的信號(hào)的不同熒光團(tuán)標(biāo)記的第三抗體接觸，在生物樣品中另外測量樣品中相應(yīng)野生型蛋白的絕對(duì)量或相對(duì)量。在根據(jù)本發(fā)明的免疫測定試驗(yàn)的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，polyQ-蛋白質(zhì)是 polyQ-亨廷頓蛋白。在根據(jù)本發(fā)明的免疫測定試驗(yàn)的再一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物樣品源自腦、血、肌肉或心，或源自任何其它的外周組織，例如皮膚或毛發(fā)。在本發(fā)明的另一方面，免疫測定試驗(yàn)用于測量生物樣品中蛋白質(zhì)的突變POLYQ形式的量，其中該蛋白質(zhì)選自亨廷頓蛋白、雄激素受體、萎縮蛋白1、共濟(jì)失調(diào)蛋白1、共濟(jì)失調(diào)蛋白2、共濟(jì)失調(diào)蛋白3、共濟(jì)失調(diào)蛋白7、TATA盒結(jié)合蛋白或α Ia電壓依賴性鈣通道亞基；作為診斷工具，用于監(jiān)測疾病進(jìn)展或用于監(jiān)測與蛋白質(zhì)的突變POLYQ形式有關(guān)的疾病的治療效力。該免疫測定試驗(yàn)優(yōu)選是如本申請(qǐng)中所述的免疫測定試驗(yàn)。附圖簡述

圖1 優(yōu)化檢測尾(detection tag)、cDNA構(gòu)建體和分析原理A.示出了用抗體對(duì)β 1和25Η10進(jìn)行分析的肽的氨基酸序列，各表位以粗字體表示。Β.Α.中所示的肽的時(shí)間分辨FRET分析(3ng/孔，一式兩份)。選擇Hl序列用于加尾突變型Htt，選擇16序列用于加尾野生型Htt。C.在可誘導(dǎo)的HNlO細(xì)胞系中表達(dá)的cDNA 構(gòu)建體的示意圖，還示出25H10、32A7和β 1在C端尾上的抗體結(jié)合位點(diǎn)。2Β7對(duì)Htt的內(nèi)源性氨基端表位具有特異性。D.用于基于細(xì)胞的時(shí)間分辨FRET測定法的方案的示意圖。圖2 通過時(shí)間分辨FSrster共振能量轉(zhuǎn)移檢測突變型和野生型HttA.蛋白質(zhì)印跡分析，相比于內(nèi)源性全長Htt，野生型(573-Q25)和突變型(573-Q72)Htt在HNlO細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)。B.誘導(dǎo)3天后，被突變型和野生型Htt轉(zhuǎn)染的HNlO細(xì)胞系顯示跨時(shí)間和多個(gè)細(xì)胞代的穩(wěn)定Htt表達(dá)。C. 3天誘導(dǎo)后，用所示抗體組合，通過時(shí)間分辨FRET對(duì)野生型或突變型Htt進(jìn)行的靈敏且特異的檢測(平均值，η = 3，標(biāo)準(zhǔn)差)。D.利用2Β7和β 1抗體對(duì)在誘導(dǎo)3天的細(xì)胞中檢測突變型Htt573-Q72的細(xì)胞裂解條件的優(yōu)化(時(shí)間分辨FRET在加入抗體后50min測量，11 = 6，標(biāo)準(zhǔn)差)。E.細(xì)胞裂解和加入檢測抗體后Z，-因子在35_1 IOmin 之間保持穩(wěn)定，但絕對(duì)時(shí)間分辨FRET信號(hào)隨時(shí)間而增加(未顯示)，573-Q72HN10細(xì)胞誘導(dǎo) 3天(n = 6，標(biāo)準(zhǔn)差)。F.在用不同誘導(dǎo)劑濃度處理的細(xì)胞中突變型Htt573-Q72表達(dá)的劑量依賴性增加(n = 6，標(biāo)準(zhǔn)差，EC50 250nM)。A_C.這些數(shù)據(jù)在96孔板格式中產(chǎn)生。D-F. 這些數(shù)據(jù)在1536孔板格式中產(chǎn)生。圖3 =Htt生物測定試驗(yàn)所用方案的示意圖通過單個(gè)移液步驟將被標(biāo)記用于時(shí)間分辨FRET的單克隆抗體加至細(xì)胞裂解物或組織勻漿物中。與Htt的同時(shí)結(jié)合使兩種抗體靠近，由此使得能量可以從銪穴狀化合物轉(zhuǎn)移至D2-熒光團(tuán)。由鑭系元素穴狀化合物發(fā)射的獨(dú)特長壽命熒光允許時(shí)間分辨測量，并由此允許在時(shí)間上區(qū)別于干擾性的短壽命背景熒光。因而，在具有強(qiáng)色彩和自體熒光的生物樣品(如血液)中可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的Htt測量。B.人Htt(加尾的Htt573片段)上的抗體結(jié)合位點(diǎn)的圖示。2B7和MWl分別對(duì)位于Htt的氨基端和polyQ重復(fù)序列上的Htt表位具有特異性。三種單克隆抗體β1、32Α7和25H10對(duì)加在該加尾的Htt573片段的羧基端上的表位具有特異性。MWl與PolyQ-重復(fù)序列的結(jié)合隨著polyQ-長度的變化而導(dǎo)致與Htt的更強(qiáng)的和增加的結(jié)合(由在圖中顯示的兩個(gè)抗體表示)。圖4 亨廷頓病的細(xì)胞模型中突變型亨廷頓蛋白的檢測A 使用Htt抗體對(duì)2B7和麗1，在誘導(dǎo)的HNlO細(xì)胞的裂解物中，對(duì)加尾的野生型 (25Q)和突變型(72Q)Htt 573片段進(jìn)行時(shí)間分辨FRET檢測。由未誘導(dǎo)的細(xì)胞制備的裂解物用作陰性對(duì)照。B 用2B7和麗1通過時(shí)間分辨FRET對(duì)HNlO細(xì)胞中誘導(dǎo)的未加尾的Htt 外顯子1片段進(jìn)行特異性檢測。C 用2B7和麗1通過時(shí)間分辨FRET對(duì)標(biāo)準(zhǔn)量的經(jīng)純化的重組野生型05Q)或突變型G6Q)Htt 573蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。D.用2B7和麗1通過時(shí)間分辨FRET分析ESC衍生神經(jīng)元中慢病毒介導(dǎo)的未加尾野生型(25Q)和突變型(72Q)Htt 548 片段的表達(dá)，表明Htt信號(hào)作為polyQ-長度的函數(shù)而增加，但是用2B7進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡顯示相似的Htt表達(dá)水平。模擬感染的細(xì)胞中未檢測出Htt片段。微管蛋白為上樣參照。 E 特異性檢測140Q-敲入(knock-in)ESC中的內(nèi)源性Htt。Htt敲除ESC(KO)用作陰性對(duì)照。2B7和麗1未檢測出具有7Q的鼠野生型Htt。F:從表達(dá)具有增加的polyQ長度的內(nèi)源性Htt的敲入ESC衍生神經(jīng)元獲得細(xì)胞裂解物，分析該裂解物證實(shí)了 Htt的該時(shí)間分辨 FRET測定對(duì)polyQ的依賴性。圖中所示的細(xì)胞裂解物中的Htt表達(dá)均獨(dú)立地通過蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)行了確認(rèn)(未示出)。所有圖均顯示η = 3的平均值，其中誤差柱指示標(biāo)準(zhǔn)差值。圖5 通過雙重時(shí)間分辨FSrster共振能量轉(zhuǎn)移，同時(shí)測定野生型和突變型Htt對(duì)同一樣品中加尾的野牛型和突變型Htt573的表達(dá)水平進(jìn)行測定。HNlO細(xì)胞表達(dá)在氨基酸573截短的且分別用β 1和32Α7抗原或用β 1和25Η10抗原加尾的野生型 Htt (25Q)和突變型Htt (72Q)兩者。β 1攜帶鋱穴狀化合物部分，將熒光能量轉(zhuǎn)移至D2標(biāo)記的25Η10和Alexa488標(biāo)記的32A7。在兩個(gè)不同波長通道中測量了 D2和Alexa488信號(hào)。圖6 純的重組Htt蛋白的生產(chǎn)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳在細(xì)菌中產(chǎn)生的純化的野生型(Htt573Q20和突變型 (Htt573Q46)蛋白。規(guī)定量的牛血清白蛋白(BSA)被上樣用作對(duì)照以評(píng)估在所用的純化方法中獲得的純化Htt的量。圖7 用抗體對(duì)2B7和麗ι以及2B7和4C9通過雙重時(shí)間分辨Fiirster共振能量
轉(zhuǎn)移對(duì)重組野生型和突變型Htt進(jìn)行測定使用所示抗體對(duì)，通過雙重時(shí)間分辨Fiirster共振能量轉(zhuǎn)移，對(duì)確定量的重組野生型Htt (25Q)和突變型Htt (46)進(jìn)行分析。盡管2B7和MWl (Alexa488通道)以polyQ-依賴性方式更好地識(shí)別突變型Htt，但是2B7和4C9 (D2通道)導(dǎo)致對(duì)野生型Htt比對(duì)具有延長PolyQ的突變型Htt蛋白更強(qiáng)的信號(hào)。圖8 用抗體對(duì)2B7和MWl以及2B7和2166通過雙重時(shí)間分辨FSrster共振能量
轉(zhuǎn)移對(duì)重組野生型和突變型Htt進(jìn)行測定使用所示抗體對(duì)，通過雙重時(shí)間分辨Fiirster共振能量轉(zhuǎn)移，對(duì)確定量的重組野生型Htt (25Q)和突變型Htt (46)進(jìn)行分析。盡管2B7和MWl (Alexa488通道)以polyQ-依賴性方式更好地識(shí)別突變型Htt，但是2B7和2166 (D2通道)導(dǎo)致對(duì)野生型Htt比對(duì)具有延長polyQ的突變型Htt蛋白更強(qiáng)的信號(hào)。圖9 用抗體對(duì)4C9和2166通過時(shí)間分辨Fiirster共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)重組野生型和突變型Htt進(jìn)行測定使用抗體對(duì)4C9和2166，通過時(shí)間分辨Fiirster共振能量轉(zhuǎn)移，對(duì)確定量的重組野生型Htt(25Q)和突變型Htt (46)進(jìn)行分析，兩個(gè)抗體對(duì)同等良好地識(shí)別突變型Htt和野生型Htt。圖10 對(duì)小鼠HD模型中可溶性突變型亨廷頓蛋白的檢測A 對(duì)在R6/2小鼠的腦中具有200Q的Htt外顯子1進(jìn)行時(shí)間分辨FRET檢測。野生型小鼠用作陰性對(duì)照。相比于癥狀發(fā)生前的4周齡小鼠，具有癥狀的12周齡小鼠中用2B7 和麗1抗體對(duì)測量到的Htt的相對(duì)濃度顯著下降。B 通過AGERA測定R6/2小鼠中的腦Htt聚集物(在A中所分析的相同樣品)。正如預(yù)期的那樣，在年長的小鼠組中發(fā)現(xiàn)了聚集物載荷顯著增加。C:用2B7和MWl抗體對(duì)，特異性檢測可溶性Htt。通過超速離心將R6/2腦勻漿物分離成可溶性物質(zhì)和不可溶性物質(zhì)。沉淀物中回收了通過AGERA測量的不可溶性Htt 聚集物的主要部分。相反，時(shí)間分辨FRET主要顯示上清液中的可溶性Htt。D 對(duì)R6/2組織中Htt的檢測。相比于野生型同胞，來自6周齡R6/2小鼠的皮層和肌肉樣品含有顯著量 Htt (n = 3)。相比于野生型小鼠(n = 4)，還在9-12周齡R6/2小鼠(n = 9)的血漿和CSF 中檢測出突變型Htt。E 以內(nèi)源性水平表達(dá)具有140Q的Htt的敲入Hdhl40小鼠(n = 3) 的不同腦區(qū)中全長Htt的檢測。野生型同胞(n = 3)用作陰性對(duì)照。所有數(shù)據(jù)為平均值加標(biāo)準(zhǔn)差。圖11 對(duì)小鼠腦中Htt聚集物的分析A 4周齡和12周齡的R6/2或野生型(WT)小鼠的腦樣品的AGERA印跡的代表性實(shí)例。Htt聚集物載荷的年齡依賴性增加在R6A小鼠腦中是明顯的。B:在通過超速離心分離為可溶性物質(zhì)(上清液)和不可溶性物質(zhì)(沉淀)之前(開始)和之后，4周齡和12 周齡動(dòng)物的R6/2腦勻漿物用AGERA分析。聚集物有效地回收在不可溶性級(jí)份中。在上清液級(jí)份中未檢測出聚集物。圖12 對(duì)人組織中Htt的檢測A 用2Β7和麗1通過時(shí)間分辨FRET對(duì)三個(gè)死后的人HD皮質(zhì)勻漿物(HD)進(jìn)行了分析，顯示出與三個(gè)對(duì)照(HV)相比更高的polyQ-依賴性Htt信號(hào)；技術(shù)性一式三份加標(biāo)準(zhǔn)差(HV與HD之間ρ < 0. 001)。B 在分離自HD(n = 5)以及對(duì)照(HV，η = 4)個(gè)體的速凍人全血樣品、用EDTA處理的紅細(xì)胞和血沉棕黃層中，用時(shí)間分辨FRET測量(技術(shù)性一式三份)的ζ-轉(zhuǎn)換的Htt相對(duì)量的箱式圖。箱顯示50%值的分布范圍，直條顯示所有值的分布，水平條顯示中位值。圖13 =A 時(shí)間分辨Fiirster共振能量轉(zhuǎn)移的原理。銪-穴狀化合物在320nm的激發(fā)導(dǎo)致D2-熒光團(tuán)在665nm處的接近度依賴性的、時(shí)間延遲的FRET發(fā)射。B =Tb2+-穴狀化合物的發(fā)射不同于Eu3+-穴狀化合物，因此除紅色D2受體之外，還可以使用綠色受體 (Alexa488,熒光素)。C 我們將兩種捕獲抗體A β 42 (抗相應(yīng)加尾的野生型25Q-亨廷頓蛋白)和Αβ40(針對(duì)突變型72Q-亨廷頓蛋白)點(diǎn)在4點(diǎn)/孔板上。當(dāng)分析抗_Αβ42點(diǎn)時(shí)， 僅有這樣的樣品產(chǎn)生信號(hào)該樣品含有誘導(dǎo)表達(dá)了野生型25Q-亨廷頓蛋白的細(xì)胞的裂解物。相反，含有誘導(dǎo)表達(dá)了突變型72Q-亨廷頓蛋白的細(xì)胞的裂解物的樣品在抗-A β 40點(diǎn)中呈陽性。用生物素化Novl抗體檢測與板結(jié)合的Htt。圖14 使用測定試驗(yàn)分析了一大組來自健康志愿者和HD患者的血沉棕黃層PBMC 樣品(由Sarah Tabrizi友情提供)100位個(gè)體，每位個(gè)體兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)。在此項(xiàng)雙盲研究中，當(dāng)應(yīng)用通過早期實(shí)驗(yàn)(使用Meven Hersch提供的樣品)建立的信號(hào)閾值時(shí)，我們正確地將44個(gè)樣品中的43個(gè)分配至屬于健康對(duì)照。因此，該測定試驗(yàn)可以異常良好地使用血液級(jí)份作為起始材料將健康者與HD分開。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及與疾病相關(guān)的POLYQ蛋白的生物測定試驗(yàn)，以及其作為診斷工具用于監(jiān)測疾病進(jìn)展或用于監(jiān)測疾病的治療效力的用途。為了可以更容易地理解本發(fā)明，首先定義了某些術(shù)語。其它定義在整個(gè)詳述中給出。
術(shù)語“突變POLYQ蛋白”或“P0LYQ蛋白，，是指含有多谷氨酰胺擴(kuò)展的與疾病發(fā)展有關(guān)的POLYQ蛋白的形式。例如“突變POLYQ亨廷頓蛋白”是指具有超過36個(gè)谷氨酰胺的多谷氨酰胺擴(kuò)展且與亨廷頓病有關(guān)的亨廷頓蛋白。術(shù)語“單步驟測定試驗(yàn)”是指其中無需分離或洗滌且通?？梢栽趩蝹€(gè)生物化學(xué)操作后運(yùn)行的免疫測定。術(shù)語“翻譯后修飾”是指表達(dá)蛋白的細(xì)胞修飾，例如蛋白水解斷裂、磷酸化、乙?；?、泛素化、SUMO化或多肽主鏈的其它共價(jià)修飾。本發(fā)明的生物測定試驗(yàn)可以用于的多聚谷氨酰胺疾病在下表中列出。
權(quán)利要求
1.用于測量生物樣品中可溶性形式的突變POLYQ蛋白的量的免疫測定試驗(yàn)的用途，其中該蛋白質(zhì)選自亨廷頓蛋白、雄激素受體、萎縮蛋白1、共濟(jì)失調(diào)蛋白1、共濟(jì)失調(diào)蛋白2、共濟(jì)失調(diào)蛋白3、共濟(jì)失調(diào)蛋白7、TATA盒結(jié)合蛋白或α Ia電壓依賴性鈣通道亞基；作為診斷工具，用于監(jiān)測治療與該蛋白質(zhì)的突變POLYQ形式有關(guān)的疾病的效力或用于監(jiān)測疾病進(jìn)展。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中在所述免疫測定試驗(yàn)中還測量樣品中相應(yīng)野生型蛋白的絕對(duì)量或相對(duì)量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中還測量所述突變蛋白的翻譯后修飾的程度，例如表達(dá)蛋白的細(xì)胞修飾，例如通過例如蛋白水解斷裂的片段化、磷酸化、乙?；⒎核鼗?、SUMO 化、脂質(zhì)修飾或多肽主鏈的其它共價(jià)修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的用途，其中所述免疫測定試驗(yàn)是單步驟測定試驗(yàn)，即其中不需要分離或洗滌且可優(yōu)選地在單個(gè)生物化學(xué)操作后運(yùn)行的免疫測定試驗(yàn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的用途，其中所述免疫測定試驗(yàn)檢測技術(shù)以時(shí)間分辨 Fiirster共振能量轉(zhuǎn)移或電化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中所述免疫測定試驗(yàn)檢測技術(shù)是時(shí)間分辨Fiirster共振能量轉(zhuǎn)移。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中所述免疫測定試驗(yàn)包括下列步驟a)將所述生物樣品與用鑭系元素離子穴狀化合物(例如銪或鋱穴狀化合物)標(biāo)記的第一抗體和用適于檢測鑭系元素發(fā)射的信號(hào)的熒光團(tuán)標(biāo)記的第二抗體接觸，其中抗體之一對(duì)突變型蛋白的PolyQ部分具有特異性，而另一個(gè)抗體對(duì)該突變型亨廷頓蛋白蛋白的不同部分具有特異性，和b)通過用時(shí)間分辨FSrster共振能量轉(zhuǎn)移測量來自熒光團(tuán)的熒光而定量樣品中突變型POLYQ蛋白的量。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中通過另外將所述樣品與對(duì)所述蛋白質(zhì)的野生型形式具有特異性且用適于檢測鑭系元素發(fā)射的信號(hào)的不同熒光團(tuán)標(biāo)記的第三抗體接觸，還在所述生物樣品中測量該樣品中的相應(yīng)野生型蛋白的(相對(duì))量。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述polyQ-蛋白是polyQ-亨廷頓蛋白。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述生物樣品源自腦、血、肌肉或心，或源自外周組織例如皮膚或毛發(fā)。
11.用于測量生物樣品中可溶性形式的突變(擴(kuò)展POlyQ)蛋白質(zhì)的量的免疫測定試驗(yàn)，其中所述蛋白質(zhì)選自亨廷頓蛋白、雄激素受體、萎縮蛋白1、共濟(jì)失調(diào)蛋白1、共濟(jì)失調(diào)蛋白2、共濟(jì)失調(diào)蛋白3、共濟(jì)失調(diào)蛋白7、TATA盒結(jié)合蛋白或α Ia電壓依賴性鈣通道亞基。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的免疫測定試驗(yàn)，其中在所述免疫測定試驗(yàn)中還測量所述樣品中相應(yīng)野生型蛋白的絕對(duì)量或相對(duì)量。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的免疫測定試驗(yàn)，其中還測量所述突變蛋白的翻譯后修飾的程度，例如表達(dá)蛋白的細(xì)胞修飾，例如通過例如蛋白水解斷裂的片段化、磷酸化、乙酰化、泛素化、SUMO化、脂質(zhì)修飾或多肽主鏈的其它共價(jià)修飾。
14.根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的免疫測定試驗(yàn)，其中所述免疫測定試驗(yàn)是單步驟測定試驗(yàn)，即其中不需要分離或洗滌且可優(yōu)選地在單個(gè)生物化學(xué)操作后運(yùn)行的免疫測定試
15.根據(jù)權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)的免疫測定試驗(yàn)，其中所述免疫測定試驗(yàn)檢測技術(shù)以時(shí)間分辨Fiirster共振能量轉(zhuǎn)移或電化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的免疫測定試驗(yàn)，其中所述免疫測定試驗(yàn)檢測技術(shù)是時(shí)間分辨 Fiirster共振能量轉(zhuǎn)移。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的免疫測定試驗(yàn)，其中所述免疫測定試驗(yàn)包括下列步驟a)將所述生物樣品與用鑭系元素離子穴狀化合物(例如銪或鋱穴狀化合物)標(biāo)記的第一抗體和用適于檢測鑭系元素發(fā)射的信號(hào)的熒光團(tuán)標(biāo)記的第二抗體接觸，其中抗體之一對(duì)突變型蛋白的POlyQ部分具有特異性，而另一個(gè)抗體對(duì)該突變型亨廷頓蛋白蛋白的不同部分具有特異性，和b)通過用時(shí)間分辨FSrster共振能量轉(zhuǎn)移測量來自熒光團(tuán)的熒光而定量樣品中突變型POLYQ蛋白的量。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的免疫測定試驗(yàn)，其中通過另外將所述樣品與對(duì)所述蛋白質(zhì)的野生型形式具有特異性且用適于檢測鑭系元素發(fā)射的信號(hào)的不同熒光團(tuán)標(biāo)記的第三抗體接觸，在所述生物樣品中還測量該樣品中相應(yīng)野生型蛋白的(相對(duì))量。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫測定試驗(yàn)，其中所述polyQ-蛋白是polyQ-亨廷頓蛋白。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫測定試驗(yàn)，其中所述生物樣品源自腦、血、肌肉或心，或源自外周組織例如皮膚或毛發(fā)。
全文摘要
本發(fā)明涉及與疾病相關(guān)的突變POLYQ蛋白的生物測定試驗(yàn)，以及其作為診斷工具用于監(jiān)測疾病進(jìn)展或用于監(jiān)測治療疾病的效力的用途。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該polyQ-蛋白是polyQ-亨廷頓蛋白。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102171573SQ200980139060
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2009年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月4日
發(fā)明者P·帕加內(nèi)蒂 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司