專利名稱：用于治療傳染病和腫瘤的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及拮抗劑的應(yīng)用，具體的說(shuō)，涉及用于治療持續(xù)感染和腫瘤的PD-I拮抗物的應(yīng)用，本發(fā)明還涉及用于確定PD-I拮抗劑有效劑量的方法。
背景技術(shù)：
宿主免疫應(yīng)答的免疫抑制在持續(xù)感染和腫瘤免疫抑制過(guò)程中起著重要的作用。持續(xù)感染是一種傳染病，這種傳染病的病毒不明確，但是一直存在于受感染個(gè)體的特定細(xì)胞中。持續(xù)感染通常包括潛伏階段和生產(chǎn)性感染階段，在生產(chǎn)性感染階段不會(huì)快速的致死訴諸細(xì)胞或者對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)度損害。這里有三種持久性病毒-宿主相互作用潛伏期、 慢性感染和慢感染。潛伏性感染的特點(diǎn)在于初次感染之后持續(xù)存在的感染性病毒，并且可能包括慢性或者循環(huán)性疾病。慢感染的特點(diǎn)在于進(jìn)行性疾病之后漫長(zhǎng)的潛伏期。與潛伏的和慢性感染不同，慢感染可能不會(huì)從機(jī)型的病毒復(fù)制開(kāi)始。在持續(xù)感染期間，病毒基因組或者被穩(wěn)定的整合到細(xì)胞DNA中，或者被維持在附加體上。某些病毒會(huì)產(chǎn)生持續(xù)感染，所述病毒例如人類T細(xì)胞白血病病毒、埃-巴二氏病毒、細(xì)胞肥大病毒、皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、家畜囊蟲(chóng)病、乳多空病毒、嗜異性鼠白血病病毒相關(guān)病毒(Xenotropic murine leukemia virus-related virus, XMRV)、朊病毒、肝炎病毒、腺病毒、微細(xì)小病毒和乳頭狀瘤病毒。用于維持持續(xù)感染的機(jī)制包括病毒和細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)節(jié)以及宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)的修飾。通過(guò)各式各樣的刺激可以使?jié)摲愿腥驹偌せ?。所述刺激包括?xì)胞生理學(xué)方面得變化、另一種病毒的過(guò)度感染和身體緊張或外傷。宿主免疫抑制反映常常與許多持續(xù)性病毒感染的再活化有關(guān)。許多研究表明在診斷出癌癥的病人體內(nèi)缺乏免疫反應(yīng)。已經(jīng)識(shí)別出許多與具體的癌癥相關(guān)的腫瘤抗原。根據(jù)多重的實(shí)體腫瘤已經(jīng)定義了許多腫瘤抗原通過(guò)免疫性定義的 MAGE 1、2、3 ；MART-I/ 黑素-A、gplOO、癌胚抗原(CEA)、HER_2、粘蛋白(即，MUC-1)、前列腺-特異性抗原(PSA)、和前列腺酸性磷酸酶(PAP)。此外，病毒蛋白質(zhì)，例如乙型肝炎病毒 (HBV)、埃-巴二氏病毒蛋白(EBV)和人類乳頭瘤(HPV)病毒蛋白已經(jīng)被證明分別在肝細(xì)胞性肝癌、淋巴腺瘤、和頸部癌的發(fā)展過(guò)程中是十分重要的。然而，由于診斷出患有癌癥的病人的免疫抑制作用，這些病人天生的免疫系統(tǒng)通常不能應(yīng)答腫瘤抗原。被動(dòng)免疫療法和主動(dòng)免疫療法都已經(jīng)被建議用于腫瘤的治療過(guò)程中。被動(dòng)免疫性向所關(guān)心的主體提供了免疫反應(yīng)的一種組分，例如抗體或細(xì)胞毒性T細(xì)胞。自動(dòng)免疫療法利用一種治療劑來(lái)活化內(nèi)源性免疫反應(yīng)，所述治療劑例如細(xì)胞因子、抗體或化合物，其中， 所述免疫系統(tǒng)開(kāi)始將腫瘤識(shí)別為外源物質(zhì)。被動(dòng)免疫療法和主動(dòng)免疫療法二者的引入已經(jīng)在特定的癌癥類型的治療方面取得了成功。總的來(lái)說(shuō)，這里存在一種需要，來(lái)提供安全并且有效的治療疾病的治療方法，所述疾病例如，自身免疫性疾病、炎癥性紊亂、變應(yīng)性、移植排異反應(yīng)、癌癥、免疫缺陷、及其他與免疫系統(tǒng)有關(guān)的紊亂。這里還存在一種需要，來(lái)提供確定一種治療劑的某一特定劑量是否能夠有效治療主體的方法，所述治療劑例如，PD-I拮抗劑。

發(fā)明內(nèi)容
PD-I拮抗劑降低了 PD-I的表達(dá)和/或活性?；加袀魅静〉幕颊撸缁加谐掷m(xù)感染的患者可以使用程序性死亡-1多肽(PD-I)拮抗劑來(lái)治療。患有腫瘤的患者也可以使用程序性死亡-1多肽(PD-I)拮抗劑來(lái)治療。另外，該患者可以通過(guò)移植治療有效量的活化的T細(xì)胞來(lái)治療，所述活化的T細(xì)胞能夠識(shí)別與治療有效量的程序性死亡-1多肽(PD-I) 拮抗劑結(jié)合的所關(guān)心的抗原。免疫反應(yīng)可以在哺乳動(dòng)物中測(cè)定。在幾個(gè)實(shí)施方案中，這里公開(kāi)的治療方法包括B 細(xì)胞的測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，該方法包括測(cè)定來(lái)自主體的樣品中記憶B細(xì)胞的增殖作用。在一些實(shí)施方案中，這里公開(kāi)了用于測(cè)定PD-I拮抗劑在給藥PD-I拮抗劑的主體體內(nèi)功效的方法。這些方法包括測(cè)定來(lái)自給藥PD-I拮抗劑的主體的樣品中記憶B細(xì)胞的增殖作用，其中，與參照相比，來(lái)自樣品中的記憶B細(xì)胞增殖作用的增加表示PD-I拮抗劑能夠有效的治療主體。這里還公開(kāi)了用于確定對(duì)治療主體有效的PD-I拮抗劑劑量的方法。這些方法包括對(duì)主體給藥第一劑量的PD-I拮抗劑；確定來(lái)自主體的第一樣品中記憶B細(xì)胞的增殖作用。與參照相比，來(lái)自第一樣品的記憶B細(xì)胞增殖作用的增加表示第一劑量的PD-I拮抗劑能夠有效的治療主體。與參照相比，記憶B細(xì)胞增殖作用不存在顯著的改變表示第一劑量的PD-I拮抗劑不足以治療主體。根據(jù)下面對(duì)幾個(gè)實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明，并參考附圖，前述的和其他的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)會(huì)變得更加顯而易見(jiàn)。


圖IA是一種條形圖，顯示了程序性死亡-1 (PD-I) mRNA在DbGP33_41和/或 DbGP276-286特異性T細(xì)胞中的水平，所述DbGP33_41和/或DbGP276_286特異性T細(xì)胞來(lái)自未實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因老鼠，淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)阿姆斯特朗免疫(感染后大約30天)感染的老鼠或⑶4-衰竭的LCMV-C1-13感染的老鼠(感染后大約30天)，通過(guò)基因矩陣分析來(lái)調(diào)節(jié)。圖IB是一系列流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)實(shí)驗(yàn)圖，顯示了在LCMV阿姆斯特朗免疫和CD4衰竭LCMV-C1-13感染的老鼠體內(nèi)感染大約60天之后在⑶8+四聚體T細(xì)胞上程序性死亡多肽PD-I表面表達(dá)。在用LCMV-C1-13病毒進(jìn)行慢性感染(標(biāo)記為〃慢性的〃)大約60天之后，無(wú)反應(yīng)性的CD8+T細(xì)胞在該細(xì)胞表面表達(dá)高水平的程序性死亡多肽(PD-I)，但是在清除急性LCMV阿姆斯特朗感染之后(標(biāo)記為“免疫”)，病毒-特異性⑶8+T細(xì)胞不表達(dá)程序性死亡多肽(PD-I)。圖IC是一系列流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)實(shí)驗(yàn)圖，顯示了來(lái)自長(zhǎng)期感染和未感染的老鼠體內(nèi)的脾細(xì)胞中PD-Ll的存在。這一結(jié)果證明PD-Ll在被病毒感染的脾細(xì)胞上表達(dá)量是最高的。圖2A是一系列散布圖，顯示了與未治療的參照相比，當(dāng)從感染后第23-37天開(kāi)始對(duì)C1-13感染的老鼠進(jìn)行治療時(shí)，DbNP396-404特異性和DbGP33_41特異性CD8+T細(xì)胞存在大約2倍的增加。為了確定在功能方面的變化，作為對(duì)8種不同的LCMV抗原決定簇的響應(yīng)，測(cè)定IFN-Y和TNF-α的產(chǎn)量。圖2Β是一種散布圖，顯示了當(dāng)測(cè)定所有已知的⑶8+Τ 細(xì)胞特異性時(shí)，LCMV特異性CD8+T細(xì)胞的總數(shù)存在2. 3倍的增加。圖2C是一系列流式細(xì)胞計(jì)圖，顯示了響應(yīng)于8種不同的LCMV抗原決定簇時(shí)IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)量。圖2D是一種散布圖，顯示了受治療的小鼠體內(nèi)更多的病毒特異性CD8+T細(xì)胞能夠生產(chǎn)TNF-α。圖 2E是一系列直方圖，顯示了 PD-Ll阻斷劑也會(huì)在脾、肝、肺和血清中導(dǎo)致增加的病毒控制。圖3A顯示，相對(duì)于參照(標(biāo)記為“untx”)，從感染后第46天到60天，在⑶4_衰竭C1-13感染的老鼠體內(nèi)，DbGP276-286特異性CD8+T細(xì)胞(標(biāo)記為GP33和GP276)的數(shù)目增加。所述老鼠用抗-PD-L1(標(biāo)記為“PD-L1")處理。這一結(jié)果說(shuō)明，用抗-PD-Ll (標(biāo)記為〃 PD-L1")處理后的老鼠比未被處理的老鼠多大約7倍的DbGP276-286特異性脾 ⑶8+T細(xì)胞和大約4倍的DbGP33-41特異性脾⑶8+T細(xì)胞。圖是一系列流式細(xì)胞計(jì)實(shí)驗(yàn)圖像，顯示了與未被處理的參照(標(biāo)記為“untx”)相比，從感染后第46天到60天，在用抗-PD-L1(標(biāo)記為“PD-L1")處理過(guò)的⑶4-衰竭的C1-13感染后的老鼠的脾臟中， DbGP33-41和DbGP276-286特異性CD8+T細(xì)胞出現(xiàn)的頻率增加。圖3C是一系列流式細(xì)胞計(jì)實(shí)驗(yàn)圖像，顯示了通過(guò)5-溴脫氧尿核苷結(jié)合和Ki67表達(dá)測(cè)定的抗PD-Ll-處理后的小鼠體內(nèi)DbGP276-286特異性⑶8+T細(xì)胞增加的增殖。圖3D顯示了具有高⑶8+T細(xì)胞擴(kuò)張水平的小鼠，通過(guò)比較外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)中DbGP276特異性⑶8+T細(xì)胞和脾中的 DbGP276-286特異性⑶8+T細(xì)胞顯示了在外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)中可評(píng)估的反應(yīng)。圖4A是一系列圖表顯示了與參照相比，在抗-PD-Ll-治療后的老鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生 IFN- γ的DbGP276486和DbGP33_41特異性CD8+T細(xì)胞的增加。在抗-PD-Ll-治療后的老鼠體內(nèi)還檢測(cè)出較高出現(xiàn)頻度的DbNP396-404、KbNP205-212、DbNP166-175和DbGP92_101特異性CD8+T細(xì)胞。圖4B表明了在抗-PD-Ll-治療后的老鼠體內(nèi)，50%的DbGP276486特異性 ⑶8+T細(xì)胞能夠產(chǎn)生IFN-γ，與此相比，在參照老鼠體內(nèi)只有20%的DbGP276-286特異性 ⑶8+T細(xì)胞能夠產(chǎn)生IFN- γ。圖4C是一系列流式細(xì)胞計(jì)實(shí)驗(yàn)圖像，表明了相對(duì)于未處理過(guò)的慢性感染后的老鼠，抗-PD-Ll-處理的慢性感染后的老鼠能夠產(chǎn)生較高水平的TNF-α， 但是相對(duì)于用LCMV阿姆斯特朗病毒感染后的免疫老鼠，抗-PD-Ll-處理的慢性感染后的老鼠只能產(chǎn)生的較低水平的TNF-α。圖4D是使用51Cr釋放試驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果，顯示了與未處理的感染的老鼠相比，用抗-PD-Ll處理LCMV-C1-13感染的老鼠后，能夠更新病毒特異性T 細(xì)胞的體外溶解活性。圖4E是一系列圖標(biāo)，表明在經(jīng)過(guò)抗-PD-Ll-處理的LCMV-C1-13感染老鼠的各個(gè)器官中病毒滴定度的減少。與未經(jīng)處理的老鼠相比，在用抗-PD-Ll治療兩星期后，在脾臟中，病毒滴定度減少了大約3倍，在肝臟中，病毒滴定度減少了 4倍，在肺中，病毒滴定度減少了 2倍，在血清中，病毒滴定度減少了 2倍。圖5A是一系列流式細(xì)胞計(jì)實(shí)驗(yàn)圖像，顯示了使用10種艾滋病病毒四聚物進(jìn)行的 PD-I表面表達(dá)，所述艾滋病病毒四聚物對(duì)起支配作用的抗原決定簇具有特異性，所述起支配作用的抗原決定簇靶向慢性分化體C艾滋病病毒感染。所述百分比表示的是PD-I+四聚體細(xì)胞百分比。圖5B是一系列圖表顯示了在未經(jīng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的個(gè)體中，與總CD8+T 細(xì)胞群體相比，艾滋病病毒-特異性⑶8+T細(xì)胞上PD-I的百分比和MFI被顯著的上調(diào)了 (P < 0. 0001)，并且，相對(duì)于艾滋病病毒-血清反應(yīng)陰性的對(duì)照物，艾滋病病毒-感染的總 CD8+T細(xì)胞群種上的PD-I增加(ρ分別為p = 0. 0033和ρ < 0. 0001)。從65個(gè)艾滋病病毒-感染的個(gè)體和11個(gè)艾滋病病毒血清反應(yīng)陰性對(duì)照物處獲得120種艾滋病病毒四聚物著色體，對(duì)這些著色體進(jìn)校分析。圖5C顯示了四聚體+細(xì)胞上PD-I+表達(dá)的中值百分比和 MFL·圖5D描繪了進(jìn)行多重可檢測(cè)反應(yīng)的個(gè)體內(nèi)不同抗原決定簇特異性群體上PD-I+細(xì)胞百分比的變化。橫條信號(hào)表明各個(gè)個(gè)體內(nèi)PD-I+艾滋病病毒四聚體細(xì)胞的中值百分比。圖6Α是一系列圖表，表明在通過(guò)四聚體染色劑測(cè)定之后，艾滋病病毒-特異性 CD8+T細(xì)胞的數(shù)目和血漿病毒負(fù)載量之間沒(méi)有關(guān)系，而在四聚體細(xì)胞上PD-I的百分比和 MFI都與血漿病毒負(fù)載量成正比(ρ分別為ρ = 0. 0013和ρ < 0. 0001)。圖6Β是一系列圖表，表示艾滋病病毒四聚體細(xì)胞和CD4計(jì)數(shù)之間沒(méi)有關(guān)系，而四聚體細(xì)胞上PD-I的百分比和MFI都與CD4計(jì)數(shù)成反比(ρ分別為ρ = 0. 0046和ρ = 0. 0150)。圖6C表明在總CD8+T 細(xì)胞群種上PD-I的百分比和MFI與血漿病毒負(fù)載量正向相關(guān)(ρ分別為ρ = 0. 0021和ρ < 0. 0001)。圖6D描述了在總⑶8+Τ細(xì)胞群種上PD-I的百分比和MFI與⑶4計(jì)數(shù)反向相關(guān)(P 分別為 ρ = 0. 0049 和 ρ = 0. 0006)。圖7Α是一系列流式細(xì)胞計(jì)實(shí)驗(yàn)圖像，顯示了從主體SK222獲得的B*4201TL9_特異性⑶8+T細(xì)胞的代表性的表型染色，在所述主體SK222中，98%的B*4201 TL9-特異性 ⑶8+T細(xì)胞是PD-1+。圖7B表示了人的表型數(shù)據(jù)概要，在這些人中，95%以上的艾滋病病毒-特異性⑶8+T細(xì)胞是PD-1+。對(duì)于每個(gè)指定的表型標(biāo)記物，分析7到19個(gè)樣品。所述橫條表明四聚體+PD-I+細(xì)胞的中值百分比，所述細(xì)胞對(duì)指定的標(biāo)記物是陽(yáng)性的。圖8A是一系列流式細(xì)胞計(jì)實(shí)驗(yàn)圖像，表示了 a B*4201陽(yáng)性主體的代表性的增值實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在用肽刺激6天之后，在有抗-PD-Ll阻斷抗體參與的情況下，B*4201 TL9-特異性⑶8+T細(xì)胞的百分比從5. 7%增加到12. 4%。圖8B是一種線狀圖，描述了概括性的增殖試驗(yàn)數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)顯示在有抗-PD-Ll阻斷抗體參與的情況下，艾滋病病毒-特異性CD8+T 細(xì)胞的增值作用有顯著的增加(n = 28，ρ = 0.0006，對(duì)偶T檢驗(yàn))。圖8C是一種條形圖， 顯示了各個(gè)病人身上PD-1/PD-L1阻斷劑對(duì)艾滋病病毒-特異性CD8+T細(xì)胞增殖作用的區(qū)別效應(yīng)。白色信號(hào)棒顯示了在肽單獨(dú)存在的情況下四聚體+細(xì)胞的成倍增加，黑色信號(hào)棒顯示了在肽和抗-PD-Ll阻斷抗體存在的情況下四聚體+細(xì)胞的成倍增加。對(duì)一個(gè)以上抗原決定簇進(jìn)行CFSE試驗(yàn)的個(gè)體分別用星號(hào)、正方形或三角形符號(hào)表示。圖9A-9D是一系列圖和圖表顯示了在慢性感染的老鼠體內(nèi)，與PD-Ll阻斷劑結(jié)合的治療性疫苗對(duì)抗原-特異性CD8-T細(xì)胞出現(xiàn)率和病毒滴定度的協(xié)同效應(yīng)。圖9Α是實(shí)驗(yàn)方案的示意圖顯示了在感染后第4周對(duì)LCMV克隆-13 (CL-13)-感染的老鼠接種野生型牛痘病毒疫苗(VV/WT)或表達(dá)LCMV GP33-41單抗原決定簇的牛痘病毒疫苗(VV/GP33)。同時(shí)，每隔兩天用或者不用抗PD-Ll處理老鼠5次。圖9Β是一系列流式細(xì)胞計(jì)實(shí)驗(yàn)圖像，顯示了治療后1星期GP33-特異性⑶8-T細(xì)胞和GP276-特異性⑶8-T細(xì)胞在PBMC中的頻率。 數(shù)目代表每個(gè)CD8-T細(xì)胞中四聚體-陽(yáng)性細(xì)胞的頻率。數(shù)據(jù)顯示的是三個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。圖 9C-9D顯示了治療之后GP33-特異性CD8-T細(xì)胞和GP276-特異性CD8-T細(xì)胞在血液中的出現(xiàn)頻率(圖9C)和病毒滴定度(圖9D)。在指定的時(shí)間點(diǎn)，分別用四聚體染色劑和噬菌斑試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)血液中四聚體-陽(yáng)性CD8-T細(xì)胞數(shù)目和病毒滴定度的變化。同時(shí)顯示了用VV/WT 或VV/GP33(直線)感染并用抗-PD-Ll處理(陰影區(qū))之后，個(gè)體老鼠(上面的四組)和多種老鼠(下面一組)中四聚體-陽(yáng)性CD8-T細(xì)胞的數(shù)目和病毒滴定度。虛線表示了病毒檢測(cè)限制，從三組實(shí)驗(yàn)中取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖10A-10D是一種圖表和數(shù)字圖像，顯示了小鼠不同的組織中增加的抗原特異性 CD8-T細(xì)胞和提高的病毒控制，所述小鼠用結(jié)合有PD-Ll阻斷劑的治療性疫苗處理。圖IOA 是一系列流式細(xì)胞計(jì)實(shí)驗(yàn)圖像顯示了治療4星期后GP33-特異性⑶8-T細(xì)胞在不同的組織中的出現(xiàn)率。數(shù)字代表了每CD8-T細(xì)胞中GP33四聚體-陽(yáng)性細(xì)胞的出現(xiàn)率。所述數(shù)據(jù)代表了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。圖IOB顯示了治療4星期后GP33-特異性CD8-T細(xì)胞在不同的組織中的數(shù)目。圖IOC是一系列條形圖顯示了治療后2周(黑色柱)和4周(空白柱)后在指定的組織中的病毒滴定度。虛線表示病毒檢測(cè)限制。每組的老鼠數(shù)η = 6。從兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中取平均值作為結(jié)果。圖IOD是治療兩周后，帶有LCMV抗原(紅色)的脾免疫著色劑數(shù)字圖像。放大倍數(shù)，X20。圖11A-11D表示了通過(guò)治療性疫苗結(jié)合PD-Ll阻斷劑造成的耗盡⑶8_Τ細(xì)胞的提高的功能恢復(fù)。圖IlA是一系列流式細(xì)胞計(jì)試驗(yàn)圖像，顯示了接種疫苗的老鼠在治療4星期后皮細(xì)胞中IFN-γ的產(chǎn)生和脫粒。使用指定的多肽，在α CD107/ab抗體存在的情況下刺激脾細(xì)胞，然后為了 IFN-Y進(jìn)行共染色。所示附圖針對(duì)CD8-T細(xì)胞，并且代表了兩個(gè)相互獨(dú)立的試驗(yàn)。圖IlB顯示了每個(gè)⑶8-T細(xì)胞中IFN-Y+⑶107+細(xì)胞的百分比，這里的⑶-8細(xì)胞對(duì)圖IlA中所示的LCMV肽具有特異性，所述IFN-ZCD107+細(xì)胞的百分比是從多個(gè)小鼠 (對(duì)于每個(gè)反應(yīng)η = 6)中概況所得的。所得結(jié)果為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)所共有。圖IlC顯示了 CD8-T 細(xì)胞中TNF-α的生產(chǎn)，其中，所述⑶8-T細(xì)胞能夠在接種疫苗的老鼠體內(nèi)產(chǎn)生IFN-Y。在用 GP33-41或者GP276-286肽刺激脾細(xì)胞之后，產(chǎn)生IFN- γ的⑶8-Τ細(xì)胞是門控的，并且使用 IFN-y (X軸)對(duì)TNF-a (Y軸)繪制曲線。在曲線上較高或者較低的數(shù)值分別表示TNF-α + 細(xì)胞相對(duì)于IFN- y +細(xì)胞的頻率和IFN- y +的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。數(shù)據(jù)代表了兩個(gè)相互獨(dú)立的試驗(yàn)。圖IlD顯示了用于圖11(所示6 33-41或者6 276-286肽的每個(gè)0^-^ +細(xì)胞中TNF-α +細(xì)胞的百分比，該百分比是從多個(gè)小鼠(對(duì)于每個(gè)反應(yīng)n = 6)中概況得到的。圖12Α-12Β顯示了與PD-Ll阻斷劑結(jié)合的治療性疫苗的作用能夠改變慢性感染的老鼠體內(nèi)抗原特異性CD8-T細(xì)胞表型。圖12Α表示了 GP33四聚體特異性CD8-T細(xì)胞在PBMC 中治療后指定的時(shí)間點(diǎn)的表型。針對(duì)GP33+CD8-T細(xì)胞繪制柱狀圖。圖中的百分?jǐn)?shù)表示了能夠高水平的表達(dá)CD27或者CD127的群體的出現(xiàn)頻率。絲氨酸蛋白酶B在柱狀圖上的數(shù)值代表了表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。這些數(shù)據(jù)代表了三個(gè)不同的試驗(yàn)。圖12Β顯示了在治療四周之后不同組織中GP33四聚體特異性⑶8-Τ細(xì)胞的表型改變。針對(duì)GP33+⑶8-Τ細(xì)胞繪制柱狀圖。圖中的百分?jǐn)?shù)表示了能夠高水平的表達(dá)CD127或者PD-I的群體的出現(xiàn)頻率。 絲氨酸蛋白酶B和Bcl-2在柱狀圖上的數(shù)值代表了表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。這些數(shù)據(jù)代表了兩個(gè)不同的試驗(yàn)。
圖13A-13E顯示了與PD-Ll阻斷劑相結(jié)合的治療性疫苗在恢復(fù)“無(wú)幫助性”耗盡的CD8 T細(xì)胞功能恢復(fù)方面的協(xié)同效應(yīng)。圖13A是方案的示意圖。使小鼠的CD4 T細(xì)胞衰竭，然后用LCMV克隆-13感染。在感染七星期后，一些老鼠用野生型的疫苗性病毒(VV/WT) 或者LCMV GP33-41抗原決定簇表達(dá)性疫苗病毒(VV/GP33)接種疫苗。同時(shí)，使用α PD-Ll 或其同型體每三天治療小鼠5次。在最初的抗體治療5周之后，殺死老鼠進(jìn)行分析。圖13Β 是一系列流式細(xì)胞計(jì)圖和一種柱狀圖，表示了治療四星期后GP33-特異性CD8-T細(xì)胞在指定的組織中的出現(xiàn)頻率。數(shù)值代表了每個(gè)CD-T細(xì)胞中GP33四聚體-陽(yáng)性細(xì)胞的出現(xiàn)頻率。另外還概括了治療兩星期之后在不同組織的CD8-T細(xì)胞中GP33-特異性細(xì)胞的出現(xiàn)頻率。圖13C是一系列流式細(xì)胞計(jì)圖，表示了試驗(yàn)所得結(jié)果。其中在aCD107a/b抗體存在的情況下用GP33肽刺激脾細(xì)胞，并隨后為了 IFN-Y進(jìn)行共染色。針對(duì)CD8-T細(xì)胞繪圖。概括多個(gè)小鼠的對(duì)GP33肽具有特異性的⑶8-T細(xì)胞中IFN- Y+⑶107+細(xì)胞的百分率。圖13D 顯示了在用GP33肽刺激之后每個(gè)Db-限制性GP33-41四聚體陽(yáng)性細(xì)胞中IFN-Y +細(xì)胞的百分比，該百分比從多個(gè)老鼠中概括得出。圖13E表示了在治療兩星期后在指定的組織中的病毒滴定度柱狀圖。所有的制圖都代表了兩個(gè)試驗(yàn)并且所概括的結(jié)果味兩個(gè)實(shí)現(xiàn)所共有 (n = 6只老鼠/組)。圖14Α-14Β顯示了在轉(zhuǎn)移到天然攜帶的老鼠體內(nèi)之后，PD1/PD-L1信號(hào)途徑阻斷劑能夠增加抗原特異性T細(xì)胞的總數(shù)。全脾細(xì)胞被用于轉(zhuǎn)移到經(jīng)過(guò)或者沒(méi)有經(jīng)過(guò)抗PD-Ll 治療的天然攜帶的老鼠體內(nèi)。圖14Α代表了⑶8+Τ細(xì)胞特點(diǎn)的時(shí)間-點(diǎn)中建立的一組獨(dú)立的流式細(xì)胞計(jì)圖形，圖14Β表示了兩個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)中，Db GP33-特異性CD8 T細(xì)胞在外周血液中擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)(n = 4只動(dòng)物每組)。圖15Α-15Ε顯示了在經(jīng)過(guò)可應(yīng)用的T細(xì)胞免疫治療之后，PD1/PD-L1信號(hào)途徑阻斷劑能夠提高抗原特異性CD8 T細(xì)胞中細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在轉(zhuǎn)移后第17天分離脾細(xì)胞并分析使用抗原性肽刺激后的細(xì)胞因子表達(dá)作用。圖15Α顯示了在用定義的CD8抗原決定簇或者無(wú)肽參照物刺激5小時(shí)之后通過(guò)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色評(píng)價(jià)的IFNy的表達(dá)作用。圖15Β 和圖15D分別顯示了 TNFa或者107ab和IFNy的二重表達(dá)作用(四角星代表⑶8門百分比)。圖15C和圖15E顯示了生產(chǎn)IFNy同時(shí)生產(chǎn)TNF α或者107ab的細(xì)胞的百分比(η = 3只動(dòng)物/組)。圖16Α-圖16Β顯示了在LCMV克隆-13感染的小鼠體內(nèi)抗體分泌細(xì)胞增加的水平。 通過(guò)ELISP0T和⑶138染色對(duì)患有慢性LCMV感染的小鼠進(jìn)行a PD-Ll治療，之后測(cè)定總抗體分泌細(xì)胞的水平。圖16A顯示了脾抗體分泌細(xì)胞總量，這是從三個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)中概括所得的。圖16B顯示了脾臟中抗體分泌細(xì)胞(ASC)的增加可以通過(guò)標(biāo)記物⑶138來(lái)測(cè)定。如一個(gè)代表性的圖中所示，抗體分泌細(xì)胞是CD138+和B220低/中值(淋巴細(xì)胞上的門閥)。圖17顯示，用抗-PD-Ll治療慢性LCMV感染的老鼠不會(huì)導(dǎo)致骨髓抗體分泌細(xì)胞水平的提高。在用ELISP0T計(jì)算在進(jìn)行(a )PD-Ll治療14天之后，患有慢性LCMV感染的小鼠體內(nèi)脾臟和骨髓中抗原分泌細(xì)胞的總數(shù)。線條表示了試驗(yàn)組的幾何平均數(shù)。圖18顯示了共同給藥a PD-Ll和a CTLA-4會(huì)導(dǎo)致脾細(xì)胞中抗體分泌細(xì)胞的協(xié)同增加。對(duì)慢性LCMV感染的小鼠給藥aPD-Ll、a CTLA-4、或者二者一起給藥14天，通過(guò) ELISP0T計(jì)算脾細(xì)胞中抗體分泌細(xì)胞的總數(shù)。線條表示了治療組的幾何平均數(shù)。圖19A-19B顯示了提高的B細(xì)胞和⑶4 T細(xì)胞增殖作用和a PD-Ll治療的小鼠體內(nèi)生發(fā)中心活性。圖19A是⑶4 T細(xì)胞和B細(xì)胞的流式細(xì)胞分析圖，顯示了 aPD-Ll治療之后提高的Ki-67水平。如上面各欄所述，結(jié)果真對(duì)⑶4或B細(xì)胞。圖19B顯示了表達(dá)PNA 的B增加的出現(xiàn)頻率和高水平的FAS，這一結(jié)果表明α PD-Ll治療的小鼠體內(nèi)生發(fā)中心活性被提高。制圖是概括了兩個(gè)分別的試驗(yàn)結(jié)果的圖像。圖20A-20C表示了⑶8和⑶4細(xì)胞子集中的PD-I表達(dá)。圖20Α是一系列流式細(xì)胞計(jì)實(shí)驗(yàn)圖，顯示了血液中CD8+/CD3+淋巴細(xì)胞之間PD-I和各種表型的標(biāo)記物之間的共表達(dá)。圖20Β顯示了各種表達(dá)PD-I的⑶8+/⑶3+和(D)⑶4+/⑶3+細(xì)胞子集的百分比。柱狀圖表示了 PD-I在含有陽(yáng)性(空心圓)和陰性(實(shí)心三角形)指定的標(biāo)記物中的平均百分比。圖20C代表了來(lái)自一個(gè)子集的表達(dá)PD-I的⑶4+Τ細(xì)胞的表型試驗(yàn)數(shù)據(jù)。圖21Α-Β顯示了 PD-I在對(duì)慢性感染有特異性的⑶8 T細(xì)胞中更好的表達(dá)。圖21Α 是一系列流式細(xì)胞計(jì)實(shí)驗(yàn)圖像，顯示了 K3Stein棒狀病毒(EBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、流行性感冒和牛痘病毒-特異性CD8 T細(xì)胞的代表性PD-I染色。并標(biāo)明了在四聚體+細(xì)胞之間 PD-I表達(dá)的熒光強(qiáng)度幾何平均數(shù)(GMFI)。圖21B顯示了來(lái)自健康志愿者(n = 35)中EBV、 CMV、流行性感冒和牛痘病毒-特異性⑶8 T細(xì)胞上PD-I的概括信息。圖22A-C顯示了，抗-PD-Ll阻斷劑能夠增加對(duì)慢性感染有特異性的⑶8 T細(xì)胞體外增殖作用。圖22Α是一系列流式細(xì)胞計(jì)實(shí)驗(yàn)圖像，顯示了用CFSE標(biāo)記淋巴細(xì)胞，然后在指定的情況下培養(yǎng)6天。所述圖像顯示了來(lái)自EBV和CMV陽(yáng)性主體典型的染色。圖22Β是一種棒狀圖，顯示了在用抗-PD-Ll阻斷抗體阻斷之后的EBV、CMV、流行性感冒和牛痘病毒抗原-特異性反應(yīng)。所述棒狀信號(hào)顯示了與單獨(dú)使用肽相比，在肽和抗-PD-Ll阻斷抗體參與的情況下四聚體+細(xì)胞的成倍增加。圖22C顯示了抗PD-Ll抗體阻斷劑之后四聚體+細(xì)胞成倍增加和PD-I表達(dá)(培養(yǎng)之前)之間的關(guān)系。圖2!3B-23C顯示了在患有慢性HCV傳染病的人體內(nèi)，丙型肝炎病毒(HCV)特異性 ⑶8+T細(xì)胞能夠表達(dá)PD-I。圖23A是5個(gè)患有慢性HCV傳染病的病人代表性的制圖，顯示了 HCV特異性⑶8+T細(xì)胞上PD-I的表達(dá)。黑體的數(shù)值表示了在HCV特異性⑶8+T細(xì)胞(Y 軸)上PD-I表達(dá)的出現(xiàn)率(X軸)。圖中斜體的數(shù)字表示了四聚體陽(yáng)性細(xì)胞在總CD8+T細(xì)胞之中的出現(xiàn)率。在Y軸上，1073和1406能夠識(shí)別四聚體HCV抗原決定簇特異性。通過(guò) “Pt”，隨后通過(guò)病人數(shù)目識(shí)別病人。細(xì)胞聚集在⑶8+淋巴細(xì)胞上。繪圖以對(duì)數(shù)刻度來(lái)繪制。圖2 表示了 PD-I在來(lái)自健康供體(⑶8健康的)的⑶8+T細(xì)胞上的表達(dá)、來(lái)自感染 HCV病人(CD8 HCV)的CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)和在CD8+HCV特異性T細(xì)胞(HCV tet+)上表達(dá)的比較。圖23C顯示了，與PD-I在對(duì)HCV具有特異性的⑶8+T細(xì)胞(HCV tet+)上的表達(dá)相比，在來(lái)自HCV感染的供體(HCV+)和健康供體(健康的)中對(duì)流行性感冒病毒具有特異性的⑶8+T細(xì)胞(Flu tet+)上PD-I的表達(dá)。使用未配對(duì)的T檢驗(yàn)法比較同一病人體內(nèi)總 ⑶8+T細(xì)胞相對(duì)于HCV特異性⑶8+T細(xì)胞上PD-I的表達(dá)。圖24A-24D顯示了肝中PD-I表達(dá)⑶8+T細(xì)胞的出現(xiàn)率大于外周血液中的出現(xiàn)率。 圖24A是來(lái)自5位患有慢性HCV傳染病的病人的繪圖，顯示了與來(lái)自肝臟中的總CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)相比，PD-I在來(lái)自外周血液的總CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)。繪圖中黑體的數(shù)字顯示了淋巴細(xì)胞門的總CD8+T細(xì)胞中能夠表達(dá)PD-I的細(xì)胞的出現(xiàn)率。制圖以對(duì)數(shù)比例繪制。圖 24B顯示了 PD-I在來(lái)自外周血液中⑶8+T細(xì)胞上的表達(dá)與在來(lái)自HCV慢性感染患者肝臟中⑶8+T細(xì)胞上的表達(dá)的比較。使用配對(duì)T檢測(cè)法比較PD-I在同一病人體內(nèi)表達(dá)的差異。圖MC比較了與來(lái)自肝臟的⑶8+效應(yīng)因子記憶(TEM)細(xì)胞中PD-I表達(dá)相比，PD-I在來(lái)自外周血液的⑶8+效應(yīng)因子記憶(TEM)細(xì)胞中的表達(dá)。記憶子集可以通過(guò)⑶62L和⑶45RA 的差異表達(dá)來(lái)識(shí)別。在圖上部的黑體數(shù)字表示了細(xì)胞在每個(gè)象限的出現(xiàn)率。細(xì)胞被聚集在 ⑶8+淋巴細(xì)胞上，所述TEM子集被控制(裝箱)且PD-I的表達(dá)顯示在下面的直方圖中。虛線顯示了 PD-I在原態(tài)⑶8+T細(xì)胞(用作陰性群體)上的表達(dá)。直方圖中的數(shù)字代表了表達(dá) PD-I細(xì)胞的出現(xiàn)率。在直方圖的下面，概括了十位患有慢性HCV傳染病的病人體內(nèi)CD8+TEM 細(xì)胞上PD-I表達(dá)出現(xiàn)率的比較。使用配對(duì)T檢驗(yàn)法比較在同一病人體內(nèi)，在來(lái)自周圍血液中的⑶8+TEM上與在來(lái)自肝臟中的⑶8+TEM上PD-I表達(dá)的區(qū)別。圖24D是代表兩位患有慢性HCV傳染病病人的繪圖，顯示了在來(lái)自周圍血液的總CD8+T細(xì)胞中與在來(lái)自肝臟的總 ⑶8+T細(xì)胞中，⑶127表達(dá)的區(qū)別。黑體數(shù)字顯示了總⑶8+T細(xì)胞上⑶127表達(dá)的出現(xiàn)率。 細(xì)胞聚集在⑶8+淋巴細(xì)胞上。繪圖以對(duì)數(shù)比例繪制。⑶127在來(lái)自外周血液中的總⑶8+T 細(xì)胞上的表達(dá)與在來(lái)自肝臟的總CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)的比較概括顯示在下面的FACS圖中。 使用配對(duì)T檢驗(yàn)法用于統(tǒng)計(jì)分析。圖25顯示了肝臟中的HCV特異性⑶8+T細(xì)胞表達(dá)一種耗盡的表型。表現(xiàn)了兩個(gè)患有慢性HCV傳染病的病人的外周血液和肝臟中，HCV特異性CD8+T細(xì)胞上PD-I和CD127 表達(dá)的代表性制圖。第一排圖代表了 HCV四聚體陽(yáng)性群體(方框)。方框上的數(shù)字代表了四聚體陽(yáng)性細(xì)胞在CD3+淋巴細(xì)胞中的出現(xiàn)率。HCV四聚體的抗原決定簇特異性表示在Y軸上(107 。第二和第三排圖顯示了來(lái)自兩位患有慢性HCV傳染病的病人的外周血液和肝臟中的HCV特異性⑶8+T細(xì)胞上PD-I和⑶127的表達(dá)。黑體數(shù)字表示了 HCV特異性⑶8+T 細(xì)胞上PD-I或⑶127表達(dá)的頻率。繪圖以對(duì)數(shù)刻度繪制，并聚集在⑶3+⑶8+淋巴細(xì)胞上。 在FACS繪圖下邊，顯示了在來(lái)自外周血液中的總⑶8+T細(xì)胞和⑶8+HCV特異性T細(xì)胞上， 相對(duì)于來(lái)自肝臟(HCV tet+肝)的HCV特異性⑶8+T細(xì)胞中PD-I表達(dá)(左側(cè))與⑶127 表達(dá)(右側(cè))的比較。在同一病人內(nèi)部，使用配對(duì)T檢測(cè)法比較表達(dá)作用。圖沈顯示了 PD-1/PD-L1途徑阻斷劑能夠增加抗原刺激的HCV-特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增。在有IL-2和抗PD-Ll抗體(上組)或抗PD-I抗體(下組)參與的情況下，使用同源肽抗原刺激來(lái)自兩種分離的人白細(xì)胞抗原(HLA) -A2病人的CFSE標(biāo)記的PBMC 6天。同樣顯示未經(jīng)刺激的參照物。在每個(gè)象限中顯示出增殖的CFSE低-和CFSE高-HCV-特異性人類白細(xì)胞抗原(HLA)-A2+⑶8+T細(xì)胞的百分比。圖27A-27D顯示了在猿免疫缺陷病毒(SIV)特異性CD8 T細(xì)胞上，在SIV239感染之后，提高的PD-I的表達(dá)。圖27A顯示了來(lái)自正常獼猴的總⑶8 T細(xì)胞上PD-I的表達(dá)。 圖27B顯示了 SIV239感染的獼猴體內(nèi)，總⑶8 T細(xì)胞上和SIV gag-特異性⑶8 T細(xì)胞上 PD-I的表達(dá)。在SIV感染12星期后對(duì)PBMC進(jìn)行分析。圖27C提供了正常獼猴和SIV-感染獼猴中總⑶8 T細(xì)胞和SIV-特異性⑶8 T細(xì)胞上PD-I陽(yáng)性細(xì)胞的概括信息。表示了感染12周之后SIV-感染的獼猴的數(shù)據(jù)。圖27D(最后一組)提供了正常獼猴和SIV-感染獼猴中總⑶8 T細(xì)胞和SIV-特異性⑶8 T細(xì)胞上PD-I表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)的概括信肩、ο圖觀々_288分別是圖和圖表，顯示了 PD-I體外阻斷劑能夠提高SIV-特異性⑶8 T 細(xì)胞的擴(kuò)增。來(lái)自Mamu A*01陽(yáng)性獼猴的PBMC感染SHIV89. 6P，用PllC肽(0. 1毫克/毫升)在存在或者不存在抗PD-I阻斷抗體(10毫克/毫升)的情況下幾次該獼猴六天。在刺激三天之后，加入IL_2(50單位/毫升)。在刺激作用快結(jié)束的時(shí)候?qū)?xì)胞表面進(jìn)行CD3、 CD8和feig-CM9四聚體染色。使用未刺激的細(xì)胞(nostim)作為陰性參照。根據(jù)散射作用將細(xì)胞集合在淋巴細(xì)胞上，然后在⑶3上分析⑶8和四聚體的表達(dá)。圖28A是一種代表性的FACS圖。圖上的數(shù)字代表了四聚體陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)于總⑶8 T細(xì)胞的出現(xiàn)率。圖28B提供了來(lái)自6只獼猴的概括性數(shù)據(jù)。使用感染12周之后獲得的細(xì)胞進(jìn)行分析。計(jì)算四聚體陽(yáng)性細(xì)胞在PllC刺激的培養(yǎng)物和未刺激的細(xì)胞中的出現(xiàn)率之比，作為增加倍數(shù)。圖四顯示了 LCMV感染之后，PD-Ll、PD_L2和PD-I在不同的細(xì)胞型上的表達(dá)動(dòng)力學(xué)。用2 IOfiPfu的克隆-13 (CL-13)感染老鼠。在感染后指定的時(shí)間點(diǎn)，PD-L1、PD-L2、和 PD-I在不同細(xì)胞型上的表達(dá)作為一種直方圖被現(xiàn)實(shí)。PD-I在指定的細(xì)胞型上表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)被顯示。圖30a-30c是FACS圖，顯示了慢性SIV感染過(guò)程中體內(nèi)PD-1阻斷劑增加 feig-CM9-特異性CD8 T細(xì)胞并使其在血液和腸道中具有更好的功能性數(shù)量。圖30a是短尾猿RRklO代表性的FACS圖。圖30b和30c是FACS圖，顯示了血液(圖30b)和腸道(大腸黏膜組織)(圖30c)中feig-CM9-四聚體陽(yáng)性⑶8 T細(xì)胞的數(shù)量和表型。代表性的FACS圖顯示在左側(cè)，所有Mamu A*01-陽(yáng)性動(dòng)物的概括顯示在右側(cè)。FACS圖上的數(shù)字代表四聚體陽(yáng)性細(xì)胞占總CD8 T細(xì)胞的百分比。箭頭和垂直線表示了抗-PD-I抗體治療或者參照抗體治療。圖31a_31b顯示了慢性SIV感染過(guò)程中體內(nèi)PD-I阻斷劑增加多功能病毒特異性 ⑶8 T細(xì)胞。圖31a顯示了 kg-特異性細(xì)胞因子-分泌⑶8 T細(xì)胞占總⑶8 T細(xì)胞的百分比。代表性的FACS圖顯示在左側(cè)，該組的概括顯示在右側(cè)。箭頭和垂直線表示了抗-PD-I 抗體治療或者參照抗體治療。線代表抗-PD-I抗體治療的短尾猿，且紅線代表參照-抗體-治療的短尾猿。圖31b顯示了細(xì)胞因子共表達(dá)亞組，表示為總細(xì)胞銀子陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。這里顯示了每組的平均百分?jǐn)?shù)。圖3h_32b顯示了在慢性SIV傳染病期間體內(nèi)PD-I阻斷劑提高SIV-特異性體液免疫。圖32a顯示了在SIV感染之后和體內(nèi)PD-I阻斷劑之前，血液中PD-I記憶 (⑶20+CD27+⑶2Γ)和天然(⑶20+CD27TD21+)B細(xì)胞中的表達(dá)。圖32b顯示了加入阻斷劑之后抗-SIV Env-結(jié)合抗體在血清中的滴定度。圖32c顯示了在加入阻斷劑之后，Ki67在記憶和天然B細(xì)胞中的表達(dá)(增殖作用標(biāo)志)。FACS圖上的數(shù)字代表Ki67-陽(yáng)性細(xì)胞占相對(duì)總細(xì)胞量的百分比。在SIV感染22周之后，同時(shí)使用抗-PD-I抗體和抗病毒性治療劑治療短尾猿fcifll和RJdl 1。圖33a_3;3e顯示了體內(nèi)PD-I阻斷劑降低了血漿病毒血癥并延長(zhǎng)感染SIV的短尾猿的存活時(shí)間。在傳染病早期慢性階段使用抗-PD-I抗體治療短尾猿中的血漿病毒載量 (圖33a)，在感染病晚期慢性階段使用抗-PD-I抗體治療短尾猿(圖33b)，和在SIV傳染病的早期/晚期慢性階段用參照抗體治療短尾猿(圖33c)。型號(hào)代表動(dòng)物死亡。圖33d顯示了第0天到第觀天(早期慢性研究)或第0天到第21天(晚期慢性研究)之間血漿病毒載量降低的倍數(shù)。圖3 顯示了用PD-I阻斷劑治療之后SIV-感染的短尾猴的存活量。序列表在所附序列表上列出的核酸和氨基酸順序使用標(biāo)準(zhǔn)核苷酸堿基標(biāo)準(zhǔn)縮寫字體來(lái)顯示，氨基酸使用37 C.F.R. 1.822.規(guī)定的三個(gè)字母代碼來(lái)表示。核酸序列只顯示了其中一條核酸鏈，其互補(bǔ)鏈作為所顯示鏈相對(duì)應(yīng)的核酸鏈應(yīng)該被理解為也被包括在本發(fā)明中。在所附序列表中SEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQID
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的公開(kāi)涉及PD-I拮抗劑在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)方面的應(yīng)用，所述免疫反應(yīng)例如對(duì)腫瘤或?qū)Τ志眯圆《靖腥镜拿庖叻磻?yīng)。本發(fā)明的公開(kāi)還涉及確定對(duì)治療主體有效的PD-I 拮抗劑劑量的方法。術(shù)語(yǔ)除非另有說(shuō)明，這里使用的技術(shù)術(shù)語(yǔ)是根據(jù)其傳統(tǒng)用法來(lái)使用的。在分子生物學(xué)領(lǐng)域普通術(shù)語(yǔ)的定義可以在在下列文獻(xiàn)中找到由牛津大學(xué)出版社與1994年出版的 Benjamin Lewin所著的“基因V”(國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)圖書編號(hào)0-19-854287-9)；由Blackwell科學(xué)股份有限公司于1994年出版的Kendrew等人(編輯)的“分子生物學(xué)百科全書”(國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)書號(hào)0-632-02182-9)；和由VCH出版股份有限公司于1995年出版的Robert A. Meyers (編輯)的“分子生物學(xué)和生物工藝學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)參考”(國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)書號(hào)1-56081-569-8)。為了幫助這里公開(kāi)的各種各樣的實(shí)施方案的理解，本發(fā)明提供了關(guān)于下列專用名詞的解釋變化與某一參數(shù)的參照值相比，該參數(shù)發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的改變。在一個(gè)實(shí)施例中，“增加”是某一參數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的提升，例如記憶B細(xì)胞與參照相比數(shù)量增加或者發(fā)生增殖作用。合適的統(tǒng)計(jì)分析方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，并且包括但不局限于，T檢驗(yàn)和 ANOVA實(shí)驗(yàn)。在一些實(shí)施例中，具有的ρ值小于等于0.05.在其他的實(shí)施例中，顯著的變化， 例如顯著的增加或者減少，是與兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值或者更大值?！安淮嬖陲@著的變化” 是指使用合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)值的改變沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性。在一些實(shí)施例中，P值大于0.05。在其他的實(shí)施例中，“不存在顯示的變化”是指所得的增加或者減少少于兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值。在一些實(shí)施方案中，“增加”或者“提升”，例如記憶B細(xì)胞的增殖作用的增加，是大約20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%的增加或者是2-倍、 3-倍、4-倍或者5-倍的增加。在一個(gè)實(shí)施例中，“減少”或者“降低”是指某一參數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低，例如，與參照相比，記憶B細(xì)胞的數(shù)量或者增殖作用顯著的降低。合適的統(tǒng)計(jì)分析方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，并且包括但不局限于，T檢驗(yàn)和ANOVA實(shí)驗(yàn)。在一些實(shí)施
NO 1是人PD-I的示范性的氨基酸順序。
NO 2是老鼠PD-I的示范性的氨基酸順序。
NO 3是人PD-Ll的示范性的氨基酸順序。
NO 4是人PD-L2的示范性的氨基酸順序。
NO 5-12是人骨架結(jié)構(gòu)區(qū)的示范性的氨基酸順序。
NOs 13-35是人PD-I的示范性的氨基酸順序。
NOs 36-43是主要的組織適合性肽的示范性的氨基酸順序。
NO 44和SEQ ID NO 45是T細(xì)胞抗原決定簇氨基酸順序。
NO 46是人PD-L2變體的示范性的氨基酸順序。
NOs :47-52是抗原肽的示范性的氨基酸順序。
Nos :53-56是引物的核苷酸序列。方案中，“減少”，例如記憶B細(xì)胞的增殖作用的減少，是大約20%,30%,40%,50%,60%, 70% ,80^^90%的減少或者是2-倍、3-倍、4-倍或者5-倍的減少。反義、正義和反基因DNA具有兩個(gè)逆平行鏈，一個(gè)是5' -3'鏈，該鏈通常被叫做正鏈，另一個(gè)是3' -5'鏈，該鏈被認(rèn)為是負(fù)鏈。由于RNA聚合酶以5' -3'的方向添加核酸，因此負(fù)鏈的DNA在RNA轉(zhuǎn)錄期間作為模板。如此，RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物所具有的序列與負(fù)鏈序列互補(bǔ)，與正鏈序列一致(只有尿嘧啶(U)被胸腺嘧啶(T)取代)。反義分子是能夠與RNA或DNA正鏈特異性雜交或者互補(bǔ)的分子。正義分子是能夠與DNA的負(fù)鏈特異性雜交或者互補(bǔ)的分子。反基因分子是指向DNA靶點(diǎn)的反義分子或者正義分子。反義RNA(asRNA)是一種RNA分子，該分子與正義(編碼的)核酸分子互補(bǔ)。擴(kuò)增當(dāng)被用于涉及核酸時(shí)，擴(kuò)增是指能夠增加樣品或者樣本中核酸分子拷貝數(shù)目的方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是擴(kuò)增技術(shù)的一個(gè)例子。在此反應(yīng)中，從主體中收集生物樣品， 在能夠允許樣品中引物與核酸模板雜交的條件下使收集的生物樣品與一對(duì)低聚核苷酸引物相接觸。在合適的條件下，引物延長(zhǎng)，從模板上分開(kāi)，然后重新退火、延伸、和分離，從而擴(kuò)增核酸的拷貝數(shù)目。體外擴(kuò)增的產(chǎn)物可以通過(guò)電泳、限制性核酸內(nèi)切酶裂解方式、低聚核苷酸雜交或結(jié)扎、和/或核酸測(cè)序，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行定性。體外擴(kuò)增技術(shù)的其他例子包括鏈位移擴(kuò)增(參見(jiàn)美國(guó)專利第5，744，311號(hào))；無(wú)轉(zhuǎn)錄作用等溫?cái)U(kuò)增(參見(jiàn)美國(guó)專利第 6，033，881號(hào))；修補(bǔ)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增(參見(jiàn)WO 90/01069)；連接酶連鎖反應(yīng)擴(kuò)增(參見(jiàn)歐洲專利第EP-A-320 308號(hào))；間隙填充連接酶連鎖反應(yīng)擴(kuò)增(參見(jiàn)美國(guó)專利第5，427，930 號(hào))；偶聯(lián)的連接酶檢測(cè)和聚合酶鏈反應(yīng)(參見(jiàn)美國(guó)專利第6，027，889號(hào))；和NASBA RNA 無(wú)轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(參見(jiàn)美國(guó)專利第6，025，134號(hào))?？贵w抗體是一種多肽配位體，包括至少一種輕鏈或者重鏈免疫球蛋白可變區(qū)，所述可變區(qū)能夠特異性識(shí)別和結(jié)合一種抗原決定簇(例如，一種抗原，例如腫瘤或者病毒抗原，或者他的片段)?？贵w包括完整的免疫球蛋白及其本領(lǐng)域內(nèi)已知的變體和部分，例如 Fab'片段、F(ab)' 2片段、單鏈Fv蛋白(“scFv”)、和二硫化物穩(wěn)定的Fv蛋白質(zhì)(“dsFv”)。 單鏈Fv蛋白("scFv")是一種融合蛋白，該融合蛋白中的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和免疫球蛋白重鏈可變區(qū)通過(guò)一種連接體結(jié)合，而在二硫化物穩(wěn)定的Fv蛋白質(zhì)(“dsFv")中， 通過(guò)引入二硫鍵使鏈發(fā)生突變，從而穩(wěn)定鏈的結(jié)合。本術(shù)語(yǔ)還包括抗體的基因工程形式，例如嵌合抗體(例如，人源化鼠抗體)、雜共軛配對(duì)抗體(例如，雙特異性抗體)。參見(jiàn)，Pierce Catalog and Handbook (Pierce 目錄和手冊(cè))，1994-1995 (Pierce 化學(xué)公司，Rockford，IL)； Kuby, J.等人所著的Immunology (免疫學(xué))，第三版，W. H. Freeman & Co.公司，紐約，1997。—般的，免疫球蛋白具有重鏈和輕鏈。每種重鏈和輕鏈都包含一種恒定區(qū)域和一種可變區(qū)域(這里“區(qū)域”也可以叫做“區(qū)”)。在結(jié)合時(shí)，重鏈和輕鏈可變區(qū)特異性的結(jié)合抗原。輕鏈和重鏈可變區(qū)包括一種骨架結(jié)構(gòu)區(qū)域，該骨架結(jié)構(gòu)區(qū)域由三個(gè)高超變區(qū)所中斷， 所述高超變區(qū)也叫做“互補(bǔ)性-決定區(qū)域”或“⑶Rs”。骨架結(jié)構(gòu)區(qū)域和⑶Rs的范圍已經(jīng)被定義了(參見(jiàn)，Kabat等人的所著的“具有免疫重要性的蛋白質(zhì)序列”，美國(guó)健康和公共事業(yè)部，1991，該文獻(xiàn)通過(guò)引證在此全部并入本文)。Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)是在線維持的。在同一個(gè)物種中，不同輕鏈或重鏈的骨架結(jié)構(gòu)區(qū)域序列是相對(duì)保守的?？贵w的骨架結(jié)構(gòu)區(qū)域是構(gòu)建輕鏈和重鏈的結(jié)合的骨架結(jié)構(gòu)區(qū)域，該骨架結(jié)構(gòu)區(qū)域能夠用來(lái)定位和校準(zhǔn)三維空間上的CDRs。所述⑶R主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的抗原決定簇。每個(gè)鏈的⑶R—般被命名為⑶R1、⑶R2、和⑶R3，從N末端開(kāi)始順序編號(hào)，也可以通過(guò)特定的⑶R所在的鏈一般性的識(shí)別出來(lái)。因此，VHCDR3(⑶R3的重鏈可變區(qū))位于發(fā)現(xiàn)它的抗體的重鏈可變區(qū)上，其中，VL CDRl (CDR1的輕鏈可變區(qū))位于發(fā)現(xiàn)它的抗體的輕鏈可變區(qū)上?！癡H”或者“VH”涉及免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)，其包括Fv、單鏈Fv蛋白 ("scFv" )、二硫化物穩(wěn)定的Fv蛋白質(zhì)(“dsFv")或Fab的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)。 “VL”或者“VL”涉及免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，包括Fv、單鏈Fv蛋白(“scFv" )、二硫化物穩(wěn)定的Fv蛋白質(zhì)(“dsFv")或Fab的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)?！皢慰寺】贵w”是通過(guò)B-淋巴細(xì)胞單個(gè)克隆或者是通過(guò)細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，在所述細(xì)胞中，單個(gè)抗體的輕鏈和重鏈基因已經(jīng)被轉(zhuǎn)染了。單克隆抗體可以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法進(jìn)行制備，所述方法例如使骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞相融合來(lái)制備雜交的抗體形成的細(xì)胞。單克隆抗體包括人源化的單克隆抗體。“人源化的免疫球蛋白"是指一種免疫球蛋白，這種免疫球蛋白包括人免疫球蛋白骨架結(jié)構(gòu)區(qū)域和一種或一種以上非人源免疫球蛋白(例如老鼠的免疫球蛋白、鼠的免疫球蛋白或合成的免疫球蛋白)的CDR的。提供CDR的非人源免疫球蛋白被命名為“供體”， 提供骨架結(jié)構(gòu)的人源免疫球蛋白被命名為“受體”。在一個(gè)實(shí)施方案中，所有的CDR都來(lái)源于人源化免疫球蛋白中的供體免疫球蛋白，恒定區(qū)不是必須的，但如果存在的話，他們必須基本上與人源免疫球蛋白恒定區(qū)一致，那就是說(shuō)，至少有大約85-90%的一致性，例如，至少大約95%或更多的一致性。從此，人源化免疫球蛋白的所有部分，可能除了某些CDR，都與天然的人源免疫球蛋白序列的相應(yīng)部分基本上一致。人源化抗體是一種抗體，這種抗體包括一種人源化的免疫球蛋白輕鏈和一種人源化的免疫球蛋白重鏈。人源化抗體與作為供體抗體提供CDR的抗體結(jié)合相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗體的受體骨架結(jié)構(gòu)具有有限個(gè)取代，所述取代由選自供體骨架結(jié)構(gòu)的氨基酸進(jìn)行。人源化單克隆抗體或其他單克隆抗體還可以具有其他的保守氨基酸取代作用，這些取代作用基本上不影響抗原結(jié)合或免疫球蛋白的其他功能。人源化的免疫球蛋白可以通過(guò)遺傳工程構(gòu)建(例如，參見(jiàn)美國(guó)專利第 5，585，089 號(hào))?！爸泻涂贵w”是能夠干擾多肽，例如PD-I多肽任何一種生物學(xué)活性的抗體。例如， 中和抗體可以干擾PD-I多肽從而降低免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)例如T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在幾個(gè)實(shí)施例中，中和抗體可以減少PD-I多肽的能力從而將免疫反應(yīng)降低大約50%、大約 70%、大約90%或更多?？梢允褂萌我鈽?biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)來(lái)測(cè)定免疫應(yīng)答，包括這里所描述的實(shí)驗(yàn)， 從而確定可能的中和抗體?？乖侵敢环N能夠刺激動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體或者T細(xì)胞反應(yīng)的化合物、組合物、或物質(zhì)，包括能夠注射入動(dòng)物體內(nèi)或者被動(dòng)物體吸收的成分。抗原能夠與特定的體液產(chǎn)生的或者細(xì)胞免疫產(chǎn)品發(fā)生反應(yīng)，所述產(chǎn)品包括由異源免疫原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗原。術(shù)語(yǔ)“抗原”包括所有涉及到的抗原的抗原決定簇?！翱乖瓫Q定簇(Epitope)”或“抗原決定簇(antigenic determinant) ”涉及抗原上的一種位點(diǎn)，在此位點(diǎn)上B細(xì)胞或者T細(xì)胞進(jìn)行應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)抗原決定簇與一種主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子相連接而存在時(shí)，T細(xì)胞對(duì)抗原決定簇作出反應(yīng)?？乖瓫Q定簇可以從鄰接的氨基酸或通過(guò)蛋白質(zhì)的三級(jí)折疊連接的非鄰接氨基酸形成。由鄰接的氨基酸形成的抗原決定簇一般在暴露于變性溶劑之后能夠被保持，而由三級(jí)折疊形成的抗原決定簇在用變性溶劑處理之后會(huì)失去治療作用。一種抗原決定簇一般包括至少3個(gè)氨基酸或者更多，至少5個(gè)氨基酸、大約9個(gè)氨基酸，或者大約 8-10個(gè)氨基酸，這些氨基酸以一種獨(dú)特的空間構(gòu)造存在。決定抗原決定簇空間構(gòu)造的方法包括，例如，X-射線晶體衍射法和2-維核磁共振?？乖梢允且环N組織特異性抗原，或一種疾病特異性抗原。這些術(shù)語(yǔ)并不是專有的，例如，組織特異性抗原還可以是一種疾病特異性抗原。組織特異性抗原可以再有限數(shù)目的組織中可以表達(dá)，例如，單個(gè)組織。具體的，組織特異性抗原的非限制性例子是前列腺特異性抗原、子宮特異性抗原、和/或睪丸特異性抗原。組織特異性抗原可以再一個(gè)以上組織中表達(dá)，例如，但不僅限于，一種抗原可以再超過(guò)一個(gè)生殖腺組織中表達(dá)，例如，在前列腺組織和子宮組織中表達(dá)。疾病特異性抗原在疾病過(guò)程中偶然被表達(dá)。疾病特異性抗原非極限性的實(shí)施例是能夠與腫瘤形成相關(guān)的抗原或者能夠預(yù)言腫瘤形成的抗原。疾病特異性抗原是可以通過(guò)T細(xì)胞或B細(xì)胞識(shí)別的抗原。抗原-呈遞細(xì)胞(APC):是指可以將結(jié)合有主要組織相容性復(fù)合體(MHC) I類分子或II類分子的抗原呈遞到T細(xì)胞的細(xì)胞。抗原-呈遞細(xì)胞(APC)包括，但是不局限于，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)狀細(xì)胞、非胸腺依賴性細(xì)胞(B細(xì)胞)、T細(xì)胞和郎格罕氏細(xì)胞。一種T 細(xì)胞可以將抗原呈遞到其他的T細(xì)胞(包括⑶4+和/或⑶8+Τ細(xì)胞)上，這種T細(xì)胞就是一種抗原呈遞T細(xì)胞(T-APC)。B細(xì)胞淋巴細(xì)胞的亞群，S卩，白血細(xì)胞(白細(xì)胞)。成熟的B細(xì)胞分化成血漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗體和記憶B細(xì)胞?！癇細(xì)胞原始粒子”是能夠發(fā)展成為成熟B細(xì)胞的細(xì)胞。B細(xì)胞原始粒子包括干細(xì)胞、早期前-B細(xì)胞、晚期前-B細(xì)胞、大前體B細(xì)胞、小前體B細(xì)胞、和不成熟B細(xì)胞和過(guò)渡期B細(xì)胞。通常，早期前-B細(xì)胞(早期前B細(xì)胞表達(dá)，例如⑶43或者 Β220)經(jīng)歷免疫球蛋白重鏈重排變成不成熟的B細(xì)胞。不成熟的B細(xì)胞包括Tl和Τ2 B細(xì)胞。例如，在老鼠中，不成熟的B細(xì)胞包括Tl B細(xì)胞，即AA41hira231()細(xì)胞。老鼠不成熟B 細(xì)胞的其他實(shí)施例是T2B細(xì)胞，即AA41hiCD23hi細(xì)胞。在人體中，不成熟B細(xì)胞(例如，不成熟外周過(guò)渡性 B 細(xì)胞)包括 CD38hi, IgD+，CDlO+, CDMhi，CD4410，CD2310 和 CDll0 細(xì)胞。因此， 不成熟B細(xì)胞包括B220(CD45R)表達(dá)細(xì)胞，其中，輕鏈和重鏈免疫球蛋白細(xì)胞基因倍重排。 在一個(gè)實(shí)施方案中，不成熟的B細(xì)胞表達(dá)⑶45R，class II，IgM，⑶19和⑶40。不成熟B細(xì)胞不顯示替代輕鏈表達(dá)，但卻表達(dá)Ig α β和RAG。不成熟B細(xì)胞可以發(fā)展為成熟的B細(xì)胞， 成熟B細(xì)胞可以產(chǎn)生免疫球蛋白(例如，IgA、IgG或者IgM)。成熟B細(xì)胞具有獲得的表面 IgM和IgD，能夠?qū)乖l(fā)生反應(yīng)，并且表達(dá)特征標(biāo)記物，例如⑶21和⑶23 (⑶23htD21hi細(xì)胞)。B細(xì)胞可以被試劑活化，例如，被脂多糖(LPQ或者IL-4和抗IgM的抗體活化。B細(xì)胞和B細(xì)胞原始粒子常見(jiàn)的生物來(lái)源包括骨髓、外周血、脾臟和淋巴結(jié)。最初與抗原相遇的B細(xì)胞叫做“天然"B細(xì)胞。這種細(xì)胞在其細(xì)胞表面具有IgM和 IgD0在一種B細(xì)胞原始粒子(例如，前定向小淋巴細(xì)胞)被抗原激活之后，該B細(xì)胞原始粒子分化成母細(xì)胞，母細(xì)胞分化成不成熟血漿細(xì)胞，不成熟血漿細(xì)胞可分化成成熟血漿細(xì)胞或者記憶B細(xì)胞。作為對(duì)特定抗原的反應(yīng)，成熟血漿細(xì)胞分泌免疫球蛋白。記憶B細(xì)胞是經(jīng)過(guò)細(xì)胞同型轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞超突變的B細(xì)胞，所述體細(xì)胞超突變通常在次級(jí)免疫反應(yīng)(在首次抗原暴露之后的抗原暴露)過(guò)程中發(fā)生，但也可以在初級(jí)抗原反應(yīng)中檢測(cè)到。記憶B細(xì)胞的發(fā)展發(fā)生在淋巴濾泡(lymphoid follicles)的生發(fā)中心(GC)，在淋巴濾泡(lymphoid follicles)的生發(fā)中心(GC)，抗原產(chǎn)生的淋巴細(xì)胞進(jìn)行超突變和親和篩選，前提是在輔助性T細(xì)胞的影響下。記憶B細(xì)胞通常表達(dá)⑶27。一般的，記憶B細(xì)胞還能在其細(xì)胞表面表達(dá)高親和性抗原特異性免疫球蛋白(B細(xì)胞受體)。因此，記憶B細(xì)胞可以是⑶20+⑶27+，并且包括 CD20int/CD2l7CD27+(靜態(tài)記憶)、CD20hi/CD2l7CD27+(活化的記憶)。CD20hi/CD2l7 CD27—細(xì)胞是獨(dú)特的“非常規(guī)或者組織記憶”B細(xì)胞。結(jié)合親和性抗體對(duì)抗原的親和性。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)Frankel et al., Mol. Immunol. ,16 101-106，1979中描述的katchard方法的改良計(jì)算親和性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合親和性通過(guò)抗原/抗體解離速度測(cè)定結(jié)合親和性。在依舊另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性放射免疫試驗(yàn)測(cè)定高結(jié)合親和性。在幾個(gè)實(shí)施例中，高結(jié)合親和性是至少大約1x10_8M。在另一個(gè)實(shí)施方案中，高結(jié)合親和性是至少大約1. &10_8Μ、至少大約2. 0Χ1(Γ8Μ、 至少大約2.切10_8]\1、至少大約3. 0χ10_8Μ、至少大約3.切10_8]\1、至少大約4. 0χ10_8Μ、至少大約4. hl(T8M、或者至少大約5. OxlO—M。結(jié)合或穩(wěn)定的結(jié)合(低聚核苷酸)如果足夠量的低聚核苷酸形成堿基對(duì)或者與其靶分子核酸雜交，該低聚核苷酸就會(huì)結(jié)合或者穩(wěn)定的結(jié)合到靶分子核酸上，從而允許檢測(cè)結(jié)合?？梢酝ㄟ^(guò)靶分子低聚核苷酸復(fù)合物的物理或者功能性質(zhì)檢測(cè)結(jié)合。在靶分子和低聚核苷酸之間的結(jié)合可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法來(lái)檢測(cè)，這些方法包括功能性結(jié)合實(shí)驗(yàn)和物理結(jié)合實(shí)驗(yàn)。例如，可以通過(guò)確定結(jié)合在生物合成過(guò)程中是否具有可探測(cè)到的效果來(lái)從功能角度檢測(cè)結(jié)合，所述生物合成過(guò)程例如基因表達(dá)、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等等。檢測(cè)DNA或RNA的互補(bǔ)鏈結(jié)合的物理方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，包括，例如脫氧核糖核酸酶I (DNase I)或化學(xué)足跡實(shí)驗(yàn)法、凝膠位移和親合裂解試驗(yàn)、RNA分子印跡技術(shù) (Northern blotting)、點(diǎn)印跡技術(shù)和光吸收檢測(cè)方法。例如，一個(gè)方法包括在220納米到 300納米條件下，在溫度緩慢增加時(shí)觀察包含低聚核苷酸(或其類似物)和靶分子核酸的溶液光吸收的變化，由于該方法簡(jiǎn)單可靠，在本領(lǐng)域內(nèi)被廣泛應(yīng)用。如果低聚核苷酸或類似物已經(jīng)與它的靶分子結(jié)合了，在某一特定的溫度下，該溶液的吸光度會(huì)有一個(gè)突增，這是由于低聚核苷酸(或類似物)與他的靶分子分離或熔融而造成的。低聚物及其靶分子核酸之間的結(jié)合通常通過(guò)溫度(Tm)來(lái)定性，在此溫度(Tm)下， 50%的低聚物從其靶分子上熔化。較高的(Tm)相對(duì)于較低的(Tm)來(lái)講，意味著更強(qiáng)或者更穩(wěn)定的復(fù)合物。癌癥或腫瘤是指一種惡性的贅生物，該贅生物已經(jīng)經(jīng)歷了特有的退行性變化同時(shí)伴有分化能力損失、發(fā)育增長(zhǎng)率損失、侵入周圍組織、并能夠轉(zhuǎn)移。生殖性癌癥是指其最初起源在生殖組織中的癌癥，所述生殖組織例如子宮、睪丸、卵巢、前列腺、輸卵管或陰莖。 例如，前列腺癌是一種惡性贅生物，發(fā)生在前列腺組織并從前列腺組織中擴(kuò)散，并且，子宮癌是發(fā)生在子宮組織中或者從子宮組織中擴(kuò)散開(kāi)來(lái)的惡性贅生物，睪丸癌是發(fā)生在睪丸中的惡性贅生物。切緣癌是指在對(duì)患有癌癥的患者進(jìn)行任何能夠減少或消除甲狀腺癌的治療之后仍然殘留在患者體內(nèi)的癌癥。轉(zhuǎn)移癌是指除了原始(最初)癌癥起源位點(diǎn)之外，從該轉(zhuǎn)移性癌起源位點(diǎn)轉(zhuǎn)移出的在患者體內(nèi)一個(gè)或者一個(gè)以上位點(diǎn)的癌癥。⑶觀(分化群28)在T細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞之一，能夠提供共刺激性信號(hào)，共刺激性信號(hào)是T細(xì)胞活化所必須的。⑶觀是87. 1(⑶80)和B7.2(⑶86)的受體。當(dāng)被toll樣受體配位體活化時(shí)，在抗原呈遞細(xì)胞(APCs)中B7. 1的表達(dá)被上調(diào)。在抗原呈遞細(xì)胞(APCs) 中B7. 2的表達(dá)是持續(xù)性的。⑶觀是唯一能夠在天然T細(xì)胞上持續(xù)性表達(dá)的B7受體。
化學(xué)療法；化學(xué)治療劑如這里使用的，化學(xué)療法或化學(xué)治療劑是指任何能夠有效治療以非正常細(xì)胞生長(zhǎng)為特征的疾病的化學(xué)試劑。這些疾病包括腫瘤、贅生物和癌癥，以及以增生性生長(zhǎng)為特征的疾病，例如，牛皮癬。在一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)治療劑是在治療贅生物的過(guò)程中使用的試劑，所述被治療的贅生物例如實(shí)體腫瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)治療劑是一種放射性分子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易的識(shí)別有效的化學(xué)治療劑(例如，參見(jiàn) Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, (Slapak 禾口 Kufe 所著的"癌癥治療原理”)Chapter 86 in Harrison' s Principles of Internal Medicine(內(nèi)科醫(yī)學(xué)的哈里森原理第 86 章)第 14 版；Perry et al.，Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed. , 2000 Churchill Livingstone, 丘吉爾禾U文斯頓有限公司2000年出版的Perry等人編寫的“化學(xué)療法”第2版第17章，阿貝洛夫臨床腫瘤學(xué))；Baltzer L, Berkery R(eds) Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis,Mosby-Year Book，1995 (Mosby 年鑒 1995 年，圣路易斯出版的 Baltzer L,Berkery R 編輯的“腫瘤學(xué)化學(xué)療法口袋指南”第2版)；Fischer DS, Knobf MF, Durivage HJ(eds) The Cancer Chemotherapy Handbook,4th ed. St. Louis,Mosby-Year Book,1993) (Mosby年鑒1993年，圣路易斯出版的Fischer DS,Knobf MF,Durivage HJ編輯的“癌癥化學(xué)療法手冊(cè)”第4版))。這里所公開(kāi)的免疫原多肽可以用于與其他的化學(xué)治療劑相結(jié)合使用。⑶觀細(xì)胞表面抗原還被叫做T90/44抗原或者在T細(xì)胞上表達(dá)的Tp44。⑶觀是在T細(xì)胞上作用的共刺激性蛋白質(zhì)的受體。CD^的天然配位體是大小為44-54kDa的糖蛋白，叫做B7-1或者⑶80。還存在一種相關(guān)分子，B7-2。B7-1在活化的B細(xì)胞和其他抗原呈遞細(xì)胞上表達(dá)。它可以被巨噬細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，T細(xì)胞，B細(xì)胞，外周血樹(shù)突狀細(xì)胞和朗格漢斯細(xì)胞表達(dá)。B7-2可以在血液樹(shù)突狀細(xì)胞和朗格漢斯細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、枯否細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞核和天然致死細(xì)胞克隆株中發(fā)現(xiàn)。B7和CD^在T細(xì)胞上的結(jié)合能夠傳遞一種共刺激信號(hào)，這種共刺激信號(hào)激發(fā)T細(xì)胞增殖作用。參照水平(免疫參數(shù))一種免疫參數(shù)的基線水平。在一些實(shí)施方案中，參照水平是不存在治療劑的情況下，免疫系統(tǒng)某一成分的水平，例如，記憶B細(xì)胞或者增殖性記憶B 細(xì)胞的水平。通過(guò)測(cè)定來(lái)自尚未用所關(guān)心的試劑處理的主體的樣品來(lái)確定參照水平，或者通過(guò)測(cè)定來(lái)自用參照試劑處理過(guò)的主體的樣品來(lái)確定參照水平。所述參照水平還可以是一種標(biāo)準(zhǔn)值，例如，在一段時(shí)間內(nèi)測(cè)定的大量樣品的平均值中確定的值。所述參照水平還可以在來(lái)自經(jīng)過(guò)特定劑量的治療劑處理之后的主體的樣品中測(cè)定，其中，對(duì)于正在進(jìn)行評(píng)價(jià)的主體不能給藥所述劑量。參照可以從進(jìn)行評(píng)價(jià)的主體中獲得，也可以從不同的主體中獲得。參照水平(多肽或者核酸)是指在某一條件下和/或特定的基因背景中，自然存在的正常的分子水平，例如多肽或者核酸的水平。在某些實(shí)施方案中，分子的參照水平可以在沒(méi)有直接或者間接經(jīng)歷過(guò)治療細(xì)胞或者物種中測(cè)定。在某些實(shí)施例中，參照水平可以是在沒(méi)有與試劑接觸的細(xì)胞中的水平，所述試劑例如PD-I拮抗劑。在其他的實(shí)施例中，參照水平可以是在沒(méi)有給藥PD-I拮抗劑的主體中的水平。DNA (脫氧核糖核酸)脫氧核糖核酸(DNA)是一種長(zhǎng)鏈聚合物，該聚合物包括絕大多數(shù)活體生物的遺傳物質(zhì)(一些病毒的基因包括在核糖核酸(RNA)中)。DNA聚合物中的重復(fù)單位是四個(gè)不同的核苷酸，每個(gè)都包括四個(gè)堿基之一，所述堿基包括腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、 胞嘧啶和胸腺嘧啶，這些堿基與脫氧核糖結(jié)合，在此脫氧核糖上附著有磷酸基。三個(gè)一組的核苷酸(被稱為“密碼子”)能夠編碼多肽中的每個(gè)氨基酸，或者停止信號(hào)。術(shù)語(yǔ)“密碼子” 也可以被用來(lái)指mRNA中的三個(gè)核苷酸的相應(yīng)(互補(bǔ))序列，所述mRNA是由該DNA序列轉(zhuǎn)錄得到的。除非另有規(guī)定，所有DNA分子表示的分子都包括該DNA分子的反向互補(bǔ)序列。除非上下文中明確要求是單鏈分子，DNA分子盡管只用單鏈表示，但是其意味著包含雙鏈DNA 分子的兩條鏈。檢測(cè)(detecting)或者測(cè)定(Detection)(細(xì)胞或者生物分子)是指在研究中定性或者定量確定生物分子或者特定的細(xì)胞型的存在，例如，記憶B細(xì)胞的存在。例如， 定性或者定量確定在來(lái)自主體的樣品中存在記憶B細(xì)胞，或者檢測(cè)記憶B細(xì)胞的增殖作用。通常，生物分子的測(cè)定，例如蛋白質(zhì)、核酸的測(cè)定或者檢測(cè)特定的細(xì)胞型或者細(xì)胞增殖作用，需要進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，并不是簡(jiǎn)單的觀察。例如，使用抗體或者核酸探針(都被標(biāo)記過(guò))的實(shí)驗(yàn)可以分別用于檢測(cè)蛋白質(zhì)或者細(xì)胞。使用PD-I拮抗劑治療的功效的診斷 (diagnosing)或者診斷(diagnosis)包括檢測(cè)細(xì)胞或者生物分子中顯著的改變，例如，記憶B細(xì)胞的增殖作用。編碼多核苷酸被認(rèn)為能夠編碼一種多肽，如果在其天然狀態(tài)或者使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行處理之后，該多肽可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，從而產(chǎn)生mRNA和/或多肽或其片段。反義鏈?zhǔn)侵高@種核酸的互補(bǔ)序列，其編碼的序列可以由此推斷。表達(dá)是指一種過(guò)程，在此過(guò)程中，基因編碼的信息被轉(zhuǎn)入構(gòu)建物結(jié)構(gòu)中，此過(guò)程存在于細(xì)胞中并在細(xì)胞中進(jìn)行操作。表達(dá)的基因包括那些被轉(zhuǎn)錄為mRNA并隨后被翻譯成蛋白質(zhì)的基因，還包括那些被轉(zhuǎn)錄為RNA但不被翻譯為蛋白質(zhì)(例如siRNA、轉(zhuǎn)移核糖核酸和核糖體RNA)的基因。因此，靶分子序列，例如基因或基因啟動(dòng)區(qū)的表達(dá)可以導(dǎo)致mRNA、蛋白質(zhì)或者二者的表達(dá)，靶分子序列的表達(dá)可以被抑制或提高(減少或增加)。表達(dá)控制序列是指一種核酸序列，能夠調(diào)節(jié)與其可操作的連接的異源核酸序列的表達(dá)。當(dāng)表達(dá)控制序列控制和調(diào)節(jié)一種核酸序列的轉(zhuǎn)錄以及在合適的情況下控制和調(diào)節(jié)其翻譯過(guò)程時(shí)，表達(dá)控制序列可操作的與該核酸序列相連。因此，表達(dá)控制序列可以包括適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、位于蛋白質(zhì)編碼基因前面的起始密碼子(即，ATG)、拼接信號(hào)、保持正確閱讀基因框架從而保證mRNA被適當(dāng)?shù)姆g的元件、和終止密碼子。術(shù)語(yǔ)“控制序列”至少包括，其存在能夠影響表達(dá)的組分，還可以包括其他組分，這些其他組分的存在是有利的，例如，前導(dǎo)序列和融合配對(duì)序列。表達(dá)控制序列可以包括一種啟動(dòng)子。啟動(dòng)子是足夠指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄作用的最小序列。同時(shí)還包括一些啟動(dòng)子元素，這些啟動(dòng)子元素足夠使依賴于啟動(dòng)子的基因表達(dá)過(guò)程的細(xì)胞型特異性、組織特異性變得可以通過(guò)外部信號(hào)或者試劑控制或者歸納；這些元素可以位于基因的5'或3'區(qū)域?？蓸?gòu)建的和可歸納的啟動(dòng)子都被包括在本發(fā)明范圍內(nèi)(參見(jiàn)例如，Bitter et al. ,Methods in Enzymology 153 :516-544,1987 (Bitter等人在1987年出版的“酶工程方法”第153期516-544頁(yè)公開(kāi)的文獻(xiàn)))。例如，當(dāng)在細(xì)菌系統(tǒng)內(nèi)克隆時(shí)，可歸納的啟動(dòng)子，例如細(xì)菌噬菌體lambda的pL、 plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜交啟動(dòng)子)等等，都可以被使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，可以使用來(lái)源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(例如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或來(lái)源于哺乳動(dòng)物病毒基因組的啟動(dòng)子(例如反向病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列；腺病毒深啟動(dòng)子；牛痘病毒7. 5K啟動(dòng)子)。通過(guò)重組DNA或合成技術(shù)產(chǎn)生的啟動(dòng)子可以被用來(lái)提供核酸序列的轉(zhuǎn)錄作用。異源的是指來(lái)源于分離遺傳來(lái)源或種族的物質(zhì)。通常，特異性結(jié)合所關(guān)心的蛋白質(zhì)的抗體不會(huì)特異性的結(jié)合異源蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞是指在其中載體可以進(jìn)行繁殖并表達(dá)其DNA的細(xì)胞。該細(xì)胞可以是原核的或者是真核的。該細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物的，例如人類的。該術(shù)語(yǔ)還包括任意宿主細(xì)胞的子代。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，由于在復(fù)制期間會(huì)發(fā)生突變，所有的后代可能不會(huì)與其母代細(xì)胞完全一致。然而，當(dāng)使用“宿主細(xì)胞”時(shí)也包括其后代細(xì)胞。免疫反應(yīng)是指細(xì)胞免疫系統(tǒng)對(duì)刺激物的一種反應(yīng)，所述免疫系統(tǒng)例如B細(xì)胞、T 細(xì)胞或者單核細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述反應(yīng)對(duì)一種特定的抗原具有特異性(“抗原特異性反應(yīng)”)。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)是一種T細(xì)胞反應(yīng)，例如CD4+反應(yīng)或CD8+反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述反應(yīng)是B細(xì)胞反應(yīng)，并導(dǎo)致特異性抗體的產(chǎn)生，或者記憶B 細(xì)胞的增殖。B細(xì)胞反應(yīng)可以使記憶B細(xì)胞反應(yīng)或者血漿B細(xì)胞反應(yīng)。血漿B細(xì)胞反應(yīng)的一種實(shí)施例是抗體的產(chǎn)生。記憶B細(xì)胞反應(yīng)的一種實(shí)施例是記憶B細(xì)胞的增殖作用。免疫細(xì)胞的“無(wú)反應(yīng)作用”包括免疫細(xì)胞對(duì)刺激作用的折射系數(shù)，所述刺激作用例如通過(guò)活化受體或細(xì)胞因子的刺激作用?！盁o(wú)反應(yīng)作用”可以由于暴露于免疫抑制劑或者暴露于高劑量的抗抗原而發(fā)生。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)“無(wú)反應(yīng)性”或者“耐受性”包括對(duì)活化受體調(diào)節(jié)的刺激作用的折射系數(shù)。這種折射系數(shù)通常具有抗原特異性，并在停止暴露于耐受化抗原之后還能維持這樣的折射系數(shù)。例如，在T細(xì)胞中的無(wú)反應(yīng)性(與無(wú)反應(yīng)作用相反)的特點(diǎn)在于缺少細(xì)胞因子的產(chǎn)生(例如IL-2)。當(dāng)T細(xì)胞暴露于抗原中并受到第一信號(hào)(一種T細(xì)胞受體或CD-3調(diào)節(jié)的信號(hào))且在沒(méi)有產(chǎn)生第二信號(hào)(一種共刺激信號(hào))時(shí)，T細(xì)胞發(fā)生無(wú)反應(yīng)性。在這種情況下，將所述細(xì)胞再暴露于同一個(gè)抗原(即使暴露發(fā)生在共刺激分子存在的情況下)會(huì)導(dǎo)致不能產(chǎn)生細(xì)胞因子，并因此，不能增值。然而，如果與細(xì)胞因子(例如，IL-幻一起培養(yǎng)的話，無(wú)反應(yīng)性的T細(xì)胞可以與無(wú)關(guān)的抗原起反應(yīng)并因此可以增值。例如，T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性還可以通過(guò)由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2缺失來(lái)觀察，該過(guò)程通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定或通過(guò)含有指示劑的細(xì)胞株進(jìn)行的增殖試驗(yàn)來(lái)調(diào)節(jié)。做為選擇，還可以使用一種報(bào)道基因構(gòu)建物。例如，無(wú)反應(yīng)性的T細(xì)胞不能啟動(dòng)IL-2基因的轉(zhuǎn)錄作用，所述轉(zhuǎn)錄作用是在5' IL-2基因增強(qiáng)因子的控制下通過(guò)異源啟動(dòng)子誘導(dǎo)的IL-2基因的轉(zhuǎn)錄作用，或者是通過(guò)APl序列的多聚體誘導(dǎo)的IL-2基因轉(zhuǎn)錄作用，所述APl序列多聚體可以再增強(qiáng)因子內(nèi)部被發(fā)現(xiàn)(Kang et al. Science 257 1134,1992) 0無(wú)反應(yīng)性的抗原特異性T細(xì)胞相對(duì)于其相應(yīng)的參照抗原特異性T細(xì)胞在細(xì)胞毒素活性上減少了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%、95%、乃至 100%。免疫原性肽是指一種肽，所述肽包括等位基因-特異性基序或其他序列，從而所述肽能夠結(jié)合主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子并且導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞(“CTL”)反應(yīng)或針對(duì)衍生出免疫原性肽的抗原的B細(xì)胞反應(yīng)(例如，產(chǎn)生抗體或者記憶B細(xì)胞增殖作用)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用序列基序或者其他方法來(lái)識(shí)別免疫原性肽，所述方法例如本領(lǐng)域內(nèi)已知的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或多項(xiàng)式判斷法。一般，使用運(yùn)算法則來(lái)確定肽的結(jié)合閾從而通過(guò)分?jǐn)?shù)來(lái)進(jìn)行選擇，所述分?jǐn)?shù)能夠賦予他們高的結(jié)合可能性，同時(shí)具有某一結(jié)合親合力并具有免疫原性。所述運(yùn)算法則或者基于特定氨基酸在特定位置的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)結(jié)合的作用，或者基于特定的氨基酸在特定的位置對(duì)抗體結(jié)合的作用，或者基于包含基序的肽中特定取代作用的結(jié)合的作用。在免疫原性肽的含義中，保存殘基是指肽中的某一特定位點(diǎn)上，以比通過(guò)隨機(jī)分布所預(yù)計(jì)的情況具有顯著增高的頻率出現(xiàn)的殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，保守殘基是一種殘基，在此殘基上主要組織相容性復(fù)合體(MHC)結(jié)構(gòu)能夠與免疫原性肽提供一種接觸點(diǎn)。免疫原性肽還可以通過(guò)測(cè)定其與特異性主要組織相容性復(fù)合體(MHC)蛋白質(zhì)(例如，HLA-A02. 01)的結(jié)合來(lái)識(shí)別，或者在存在于主要組織相容性復(fù)合體(MHC)蛋白質(zhì)中時(shí)， 通過(guò)他們刺激⑶4和/或⑶8的能力來(lái)識(shí)別。免疫原性組合物是指一種組合物，包括一種免疫原性的多肽或編碼免疫原性多肽的核酸，所述免疫原性的多肽能夠?qū)е聦?duì)抗細(xì)胞表達(dá)多肽可測(cè)量的細(xì)胞毒性T細(xì)胞 (“CTL”)反應(yīng)，或者能夠?qū)е聦?duì)抗所述多肽的可測(cè)量的B細(xì)胞反應(yīng)(例如，產(chǎn)生能夠特異性結(jié)合所述多肽的抗體)。為了進(jìn)行體外應(yīng)用，免疫原性組合物可以由隔離的核酸、包括核酸/或免疫原性肽的媒介物組成。為了進(jìn)行體內(nèi)應(yīng)用，所述免疫原性組合物通常包括核酸、 包括核酸的媒介物、和/或在藥學(xué)上可接受的載體中的免疫原性多肽，和/或其他的試劑。 免疫原性組合物可以選擇性地包括一種添加劑、一種PD-I拮抗劑、一種共刺激分子、或一種編碼共刺激分子的核酸。根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)已知的實(shí)驗(yàn)，可以方便的檢測(cè)多肽或編碼該多肽的核酸導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞(“CTL”)反應(yīng)的能力。免疫反應(yīng)條件(體外)包括“足夠形成免疫復(fù)合物的條件”，所述免疫復(fù)合物能夠允許抗體向特定抗原決定簇突起，從而使與該抗原決定簇的結(jié)合相對(duì)于與其他所有抗原決定簇的結(jié)合相比更容易檢測(cè)，和/或更為排斥與其他所有抗原決定簇的結(jié)合。免疫反應(yīng)條件取決于抗體結(jié)合反應(yīng)的方式，并且基本上與免疫方案(例如ELISA或者放射免疫試驗(yàn))、FACS中使用的條件或者體內(nèi)面臨的條件相同。參見(jiàn)Harlow & Lane，Antibodies，A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York(1988),該文描述了免疫試驗(yàn)方式和條件。這里描述的方法中使用的免疫反應(yīng)條件是“生理?xiàng)l件”，生理?xiàng)l件是指活哺乳動(dòng)物或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞中常見(jiàn)的條件(例如，溫度、摩爾滲透壓濃度、PH值)。盡管已經(jīng)認(rèn)識(shí)到某些器官可能存在一些極端的條件，但是生物體內(nèi)部和細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境通常具有的PH值為7 (例如，從pH6. 0到pH8. 0，更為常見(jiàn)的是從pH6. 5到pH7. 5)，以水作為主要溶劑，并且溫度在大于0°C到小于50°C之間。摩爾滲透壓濃度在能夠支持細(xì)胞存活和增殖的范圍內(nèi)。抑制或治療一種疾病抑制一種疾病，例如抑制腫瘤生長(zhǎng)或抑制持續(xù)感染是指抑制一種疾病的全面發(fā)展，或者減輕該疾病過(guò)程的生理學(xué)影響。在幾個(gè)實(shí)施例中，抑制或治療一種疾病是指減輕腫瘤或帶有病原體的傳染病的癥狀。例如，癌癥治療可以防止已知患有癌癥的病人體內(nèi)腫瘤伴隨綜合征的發(fā)展，或者能夠減輕腫瘤的癥狀或者病征。在另一個(gè)實(shí)施方案中，傳染病的治療涉及抑制傳染病的發(fā)展或者減輕所述傳染病的癥狀。“治療，，是指一種治療性介入，該治療性介入能夠改善一種疾病或與此疾病有關(guān)的病理學(xué)情況的癥狀或病征。治療性的接種法涉及對(duì)已經(jīng)感染上一種病原體的主體給藥試劑。所述主體可以是無(wú)任何癥狀的，從而所述治療可以防止所述癥狀的發(fā)生。治療性疫苗還可以減少一種或者一種以上存在的癥狀的嚴(yán)重性，或者減少病原體的感染量。傳染性疾病是指任意由傳染性試劑。傳染性病原體的例子包括，但不僅限于病毒、細(xì)菌、支原體和真菌。在一種特定的實(shí)施例中，傳染性疾病是一種由至少一種傳染性病原體造成的疾病。在另一個(gè)實(shí)施例中，傳染性疾病是一種至少由兩種不同類型的傳染性病原體造成的疾病。傳染性疾病可以作用于任何體系，可以是急性的(短期發(fā)作)或者慢性/ 持續(xù)性(長(zhǎng)期發(fā)作)的，發(fā)作同時(shí)會(huì)引起或者不會(huì)引起發(fā)燒。傳染性疾病可以感染任意年齡階段并且可以相互感染。病毒引起的疾病通常在發(fā)生由已經(jīng)存在于受體中的病毒重新活化產(chǎn)生的免疫抑制之后。持久性病毒感染具體的例子包括但不局限于，巨細(xì)胞病毒(CMV)肺炎、腸炎和視網(wǎng)膜炎；埃-巴二氏病毒(EBV)淋巴組織增生性疾?。凰?皰疹(由水痘帶狀皰疹病毒引起)；HSV-I和HSV-2粘膜炎；HSV-6腦炎、BK-病毒出血性膀胱炎；病毒流行性感冒；呼吸道合胞病毒(RSV)引發(fā)的肺炎；艾滋病(由艾滋病病毒引發(fā)的)；和甲型肝炎、乙型肝炎或者丙型肝炎。其他的傳染性病毒包括逆轉(zhuǎn)錄病毒；小核糧核酸病毒(例如，骨髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒；腸道病毒，人考克塞基病毒、鼻病毒、?？刹《?；Calciviridae (例如，引起腸胃炎的菌株)；披蓋病毒科(Togaviridae)(例如，馬腦脊髓炎病毒、風(fēng)疹病毒)；黃病毒科(Flaviridae)(例如，登革熱病毒、腦炎病毒、黃熱病病毒)；冠狀病毒科 (Coronaviridae)(例如，冠狀病毒)；彈狀病毒科(Rhabdoviridae)(例如，水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒)；纖維病毒科(Filoviridae)H^Un, ebola病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；流行性感冒病毒正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流行性感冒病毒)；布尼亞病毒科(Bungaviridae) (例如，Hantaan 病毒、bunga 病毒、白齡病毒(Phleboviruses)禾口 Nairo 病毒)；Arena 病毒(出血熱病毒)；呼腸孤病毒科(例如，呼吸道腸道病毒、環(huán)狀病毒(Orbiviruses)和輪狀病毒)；雙RNA病毒科(Birnaviridae)；嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；細(xì)小病毒科(parvoviridae)(細(xì)小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳頭狀瘤病毒、多形瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(絕大多數(shù)是腺病毒)；皰疹病毒科 (Herpesviridae)(單純皰疹病毒(HSV) 1和單純皰疹病毒(HSV) _2、水痘帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、皰疹病毒)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如非洲豬瘟病毒)；和未分類的病毒(例如，海綿狀腦病的病原體，delta肝炎的試劑(被認(rèn)為是乙型肝炎病毒的缺陷型附屬物)、非甲型感染的試劑、非乙型肝炎的試劑(1類=內(nèi)部傳輸；2類=不經(jīng)腸道傳輸(即，丙型肝炎)；諾沃克類病毒和與之有關(guān)的病毒、和星形病毒(astroviruses))。真菌傳染病的例子包括但是不局限于曲霉??；口腔白色念珠菌病(由白色念珠菌所引起)；隱球菌病(由隱球酵母屬所引起)；和莢膜組織胞漿菌病。因此，傳染性真菌的例子包括，但是不局限于，新型隱球菌、莢膜組織胞漿菌、厭酷球孢子菌、皮炎芽生菌、沙眼衣原體、白色念珠菌。傳染性細(xì)菌的例子包括幽門螺旋桿菌、伯氏疏螺旋體(Borelia burgdorferi)、 通用型嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophilia)、分支桿菌屬(例如，肺結(jié)核分枝桿菌、小鼠抗鳥(niǎo)結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、M. kansaii.M. gordonae)、金黃色葡萄球菌、淋病奈瑟氏球菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、單核細(xì)胞增多性李氏桿菌、釀膿鏈球菌(A組鏈球菌)、無(wú)乳鏈球菌(B組鏈球菌)、鏈球菌(易變組)、糞鏈球菌、牛鏈球菌、鏈球菌(厭氧菌屬)、肺炎鏈球菌、致病性彎曲桿菌屬、腸道球菌、流感嗜血桿菌、炭疽芽胞桿菌、白喉棒狀桿菌、棒狀桿菌屬、紅斑丹毒絲菌、腸梭狀芽孢桿菌、破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、肺炎克雷白桿菌、多殺巴其J 德氏菌(Pasturella multocida)、畸形菌體、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、 念珠狀鏈桿菌、蒼白密螺旋體、細(xì)弱密螺旋體、鉤端螺旋體屬、和衣氏(以色列)放線菌 (A. israelii)。其他的傳染性有機(jī)體(例如真核原生生物)包括惡性瘧原蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)抗體。“持續(xù)感染”是指一種傳染病，在此傳染病中傳染試劑(例如一種病毒、支原體、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、或真菌)是不確定的或者沒(méi)有從受感染的宿主中排除，即使后來(lái)引發(fā)了免疫反應(yīng)。持續(xù)感染可以是慢性感染、潛伏性感染或慢感染。潛伏性感染的特點(diǎn)在于在復(fù)發(fā)性疾病的亞階之間缺乏可證明的傳染性病毒。慢性感染的特點(diǎn)在于初次感染之后傳染性病毒的持續(xù)性存在，并且慢性感染還可以包括慢性的或者復(fù)發(fā)性疾病。慢感染的特點(diǎn)在于進(jìn)行性疾病之后延長(zhǎng)的潛伏期。與潛伏性感染和慢性感染不同，慢感染可能不會(huì)以急性的病毒復(fù)制階段作為開(kāi)始。與急性傳染相對(duì)短暫(持久幾天到幾星期)并能夠通過(guò)免疫系統(tǒng)從身體中分解不同，持續(xù)感染可以持續(xù)，例如，幾個(gè)月、幾年、乃至一生。這些傳染病還可以在很長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)經(jīng)常復(fù)發(fā)乃至對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)度破壞，所述很長(zhǎng)的時(shí)間包括潛伏階段和有效感染階段，但不會(huì)殺死細(xì)胞。持續(xù)感染經(jīng)常包括潛伏期和有效感染兩個(gè)階段，但不會(huì)快速的殺死宿主細(xì)胞或者對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)度損害。在持續(xù)病毒感染期間，病毒基因組既可以穩(wěn)定的統(tǒng)一到細(xì)胞DNA中或者附加性的被維持。某些病毒會(huì)產(chǎn)生持續(xù)感染，所述病毒例如人T細(xì)胞白血病毒、埃-巴二氏病毒、巨細(xì)胞病毒、皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、家畜囊蟲(chóng)病、乳多空病毒、朊病毒、肝炎病毒、腺病毒、細(xì)小病毒和乳頭狀瘤病毒。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在宿主體內(nèi)(例如受感染個(gè)體的大肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)部)可以發(fā)現(xiàn)引起感染的傳染性試劑，即使已經(jīng)進(jìn)行了免疫反應(yīng)之后。按照任何本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)方法可以診斷哺乳動(dòng)物患有持續(xù)感染，所述方法在例如，美國(guó)專利第6，368，832號(hào)、美國(guó)專利第6，579，854號(hào)和美國(guó)專利第6，808，710號(hào)和美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20040137577、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20030232323、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20030166531、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20030064380、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20030044768、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20030039653、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20020164600、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20020160000、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào) 20020110836、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20020107363、和美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20020106730，這些專利或?qū)＠暾?qǐng)?jiān)诖送ㄟ^(guò)弓I證并入本文。“減輕持續(xù)感染的癥狀”是指改善與持續(xù)感染有關(guān)的任何狀況或癥狀。做為選擇， “減輕持續(xù)感染癥狀”可以包括相對(duì)于未經(jīng)處理的參照中的量相比，減少主體內(nèi)傳染性微生物(例如病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲(chóng))的量。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定，與等量的未經(jīng)處理的對(duì)照物相比較，這種減少或者預(yù)防程度最少是5%、10%、20%、40%、50%、60%、80%、90%、95%、 或100%。理想的是，通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)到持續(xù)感染被完全的清除了，在這種情況下，持續(xù)感染被認(rèn)為已經(jīng)治愈。正在進(jìn)行持續(xù)感染治療的病人是經(jīng)過(guò)專業(yè)醫(yī)生診斷確定患有這種病癥的病人。可以通過(guò)任何合適的方法進(jìn)行診斷。診斷和檢測(cè)可以包括，例如，檢測(cè)生物樣品(例如，組織活體檢查、驗(yàn)血、或尿檢驗(yàn))中微生物的裝載量、檢測(cè)生物樣品中微生物傳染病的替代標(biāo)記物水平、檢測(cè)與持續(xù)感染有關(guān)的癥狀、或檢測(cè)涉及到針對(duì)持續(xù)感染的免疫反應(yīng)的免疫細(xì)胞(例如，檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞，所述抗原特異性T細(xì)胞是無(wú)變應(yīng)性的和/或被功能性的削弱)。對(duì)正在預(yù)防持續(xù)性感染發(fā)展的病人可以或者不可以進(jìn)行這種診斷。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解這些病人已經(jīng)進(jìn)行了如上所述的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試，或者由于存在一種或者一種以上的風(fēng)險(xiǎn)因素(例如家族病史或者接觸傳染試劑)，不經(jīng)過(guò)檢測(cè)就已經(jīng)被識(shí)別具有很高的患病風(fēng)險(xiǎn)。分離的是指一種“分離的”生物學(xué)組分(例如一種核酸或蛋白質(zhì)或細(xì)胞器)基本上被分離或者從天然存在這些生物學(xué)組分的有機(jī)體細(xì)胞中區(qū)別于其他的生物學(xué)組分而純化出來(lái)，也就是說(shuō)，其他的染色體DNA和外染色體DNA和RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器?！胺蛛x的”核酸和蛋白質(zhì)包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸和蛋白質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)還包括通過(guò)在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)而制備的核酸和蛋白質(zhì)以及化學(xué)合成的核酸。一種純化的抗體占蛋白質(zhì)和與其天然相關(guān)的其他天然存在的有機(jī)分子重量的至少60 %。在某些實(shí)施例中，制得按重量計(jì)至少大約75 %、至少大約80 %、至少大約90 %、至少大約95%或至少大約99%的抗體，例如PD-1、PD-L1、或PD-L2特異性抗體。純化的抗體可以通過(guò)例如使用重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或者保守基序肽進(jìn)行的親和層析法，或者其他的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)制備。標(biāo)記物一種直接或者間接與另外一種分子相連從而促進(jìn)所述分子檢測(cè)的可檢測(cè)的化合物或組合物。其中所述另外一種分子例如抗體或者蛋白。具體的，標(biāo)記物的非限制性實(shí)施例包括熒光標(biāo)記物、酶催化連接、和放射性同位素。在一個(gè)實(shí)施例中，“標(biāo)記的抗體” 是指將其他分子整合入抗體中。例如，所述標(biāo)記物是一種可檢測(cè)的標(biāo)志，例如，將放射標(biāo)記的氨基酸或者附著物整合入生物素化的多肽中，生物素化的多肽可以被標(biāo)記的親和素檢測(cè) (例如，包含熒光標(biāo)記的鏈霉親和素或者酶活性可以通過(guò)光學(xué)檢測(cè)或者比色法測(cè)定)。標(biāo)記多肽和糖蛋白的各種方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，可以使用。多肽標(biāo)記物的實(shí)施例包括但不局限于如下物質(zhì)放射性同位素或放射性核苷酸(如或mI)，熒光標(biāo)記物(如異硫氰酸熒光素(FITC)，羅丹明，稀土熒光粉)，酶標(biāo)記物(例如辣根過(guò)氧化物酶，半乳糖苷酶， 熒光素酶，堿性磷酸酶)，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，生物素基團(tuán)，二級(jí)報(bào)道分子識(shí)別的預(yù)先確定的多肽抗原決定簇(如亮氨酸拉鏈對(duì)序列，二級(jí)抗體結(jié)合位點(diǎn)，金屬結(jié)合域，抗原決定簇標(biāo)記)， 或磁劑，如釓螯合物。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記物是由不同長(zhǎng)度的連接間隔子所附著，以減少潛在的空間位阻。淋巴細(xì)胞白血細(xì)胞的一種類型，與身體的免疫防御相關(guān)。淋巴細(xì)胞主要有兩種類型Β細(xì)胞和T細(xì)胞。主要組織相容性復(fù)合體(MHC)是不同種類中描述的組織相容性抗原系統(tǒng)的總稱，包括人類白細(xì)胞抗原(“HLA”)。哺乳動(dòng)物該術(shù)語(yǔ)包括人類和非人類的哺乳動(dòng)物。同樣的，術(shù)語(yǔ)“主體”包括人類主體和動(dòng)物主體。平均熒光強(qiáng)度(流式細(xì)胞儀)流式細(xì)胞儀致力于細(xì)胞或粒子光強(qiáng)度測(cè)量，所述光強(qiáng)度既可以是激光散射光也可以是由熒光染料發(fā)射的熒光。光可以通過(guò)光電倍增管(PMT) 進(jìn)行檢測(cè)，光電倍增管(PMT)通過(guò)一種放大器將光轉(zhuǎn)換為電壓，該電壓與原始熒光強(qiáng)度和光電倍增管上的電壓成正比。這些電壓是連續(xù)分布的，通過(guò)模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器(ADC)將這些連續(xù)分布的電壓轉(zhuǎn)換為離散分布，模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器(ADC)將各個(gè)信號(hào)至于根據(jù)熒光強(qiáng)度的特定的頻道中。ADC的分辨率越大，越能反映連續(xù)分布。
流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)可以通過(guò)線性或?qū)?shù)尺度顯示。在大多數(shù)生物情況下，都使用對(duì)數(shù)尺度顯示，在生物情況下，分布率向右偏斜。在這種情況下，將分布率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化從而獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果-也就是說(shuō)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是Log正常值，所得數(shù)據(jù)已經(jīng)經(jīng)過(guò)log-轉(zhuǎn)化。線性信號(hào)通過(guò)線性放大器，而對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換即可以通過(guò)對(duì)數(shù)放大器實(shí)現(xiàn)也可以由對(duì)照表(LUT)獲取。在分析細(xì)胞計(jì)數(shù)器中，大多數(shù)模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器(ADC)是10位，也就是說(shuō)，他們將數(shù)據(jù)分成加10 或IOM頻道，但是，現(xiàn)在越來(lái)越多趨向于使用12-或14位的ADC以提供更大的數(shù)據(jù)解析。將從單一數(shù)據(jù)頻道獲得的數(shù)據(jù)(散射面或者熒光)顯示在直方圖中，其中X軸被分為IOM個(gè)頻道(對(duì)于10位ADC)。如果該數(shù)據(jù)是線性的，則可以容易地獲得該頻道的頻道數(shù)和線性值。在對(duì)數(shù)尺度中，X軸也被分為IOM個(gè)頻道，但表示為4-log十進(jìn)制(通常使用4-log十進(jìn)制)。為了定量流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)，可以使用多種分布的測(cè)定方法。通常，通過(guò)測(cè)量平均值和中位值來(lái)測(cè)定集中趨勢(shì)。平均值是“平均數(shù)”，既可以是算數(shù)平均數(shù)也可以是幾何平均數(shù)。算數(shù)平均值可以通過(guò)公式SigmaOO/n計(jì)算，幾何平均值通過(guò)公式η root(al χ a2 χ a3…an)計(jì)算。通常，對(duì)對(duì)數(shù)放大的數(shù)據(jù)使用幾何平均數(shù)，從而計(jì)算加權(quán)數(shù)據(jù)的分布，對(duì)線性數(shù)據(jù)或者線性刻度上顯示的數(shù)據(jù)使用算數(shù)平均數(shù)。中位值是中位數(shù)值，即第50個(gè)百分?jǐn)?shù)， 其中，有一半的數(shù)值在此之上，一半的數(shù)值在此之下。具有“高”表達(dá)和“低”表達(dá)的細(xì)胞可以分別根據(jù)整個(gè)群落的熒光度確定；這些參數(shù)可以方便地從流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)圖上讀出。贅生物是指一種非正常細(xì)胞增殖作用產(chǎn)物，包括良性腫瘤和惡性腫瘤，以及其他的增殖性疾病。低聚核苷酸一種長(zhǎng)度高達(dá)大約100個(gè)核苷酸堿基的直線型多聚核苷酸序列。開(kāi)放閱讀框(ORF)用于編碼氨基酸的三個(gè)一組的一系列核苷酸(密碼子)，期間沒(méi)有任何內(nèi)部終止密碼子。該序列通?？杀环g成一種肽?？刹僮鞯倪B接當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄信c第二核酸序列處于一種功能相關(guān)的關(guān)系時(shí)，第一核酸序列與第二核酸序列可操作的連接。例如，如果一種啟動(dòng)子影響一種編碼序列的轉(zhuǎn)錄作用或者表達(dá)時(shí)，該啟動(dòng)子與該編碼序列可操作的連接。通常，可操作的連接的DNA序列是相鄰序列，且位于同一個(gè)需要加入兩個(gè)蛋白-編碼區(qū)域的閱讀框中。藥學(xué)上可接受的載體所述藥學(xué)上可接受的載體的應(yīng)用是非常常見(jiàn)的。 E. W. Martin等人編寫的由Mack出版公司，Easton，PA出版的“雷明頓(Remington' s)藥物科學(xué)”第15版描述了適用于這里所公開(kāi)的融合蛋白質(zhì)藥物傳遞的組合物和制劑。通常，載體的天然性質(zhì)取決于所使用的具體的給藥方式。例如，腸胃外制劑通常包含作為媒介物的可注射的液體，所述可注射的液體包括藥學(xué)上可接受的液體和生理學(xué)上可接受的液體，例如，水、生理鹽水、鹽類緩沖溶液、葡萄糖水溶液、甘油等等。對(duì)于固體組合物 (例如粉末、藥丸、藥片或膠囊劑形式)，慣用的無(wú)毒性固體載體可以包括，例如，藥用級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸鎂。除了生物學(xué)中性的載體之外，被給藥的藥物組合物還可以包括少量的無(wú)毒性輔助劑物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑或者乳化劑、防腐劑、和PH緩沖劑等等，例如醋酸鈉或單月桂酸山梨醇酐酯?！爸委熡行Я俊笔侵改軌蛟谥委熤黧w后實(shí)現(xiàn)理想的治療效果的組合物或者細(xì)胞的量。例如，其可以包括導(dǎo)致免疫反應(yīng)所必需的PD-I拮抗劑的量、導(dǎo)致抑制腫瘤生長(zhǎng)或顯著改變腫瘤或持續(xù)感染外在癥狀的PD-I拮抗劑的量。當(dāng)對(duì)一主體給藥時(shí)，通常使用能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)組織濃度的劑量(例如，在淋巴細(xì)胞中的濃度)，該劑量已經(jīng)顯示出完成了體外作用。在特定的實(shí)施例中，治療有效量是指能夠有效誘導(dǎo)記憶B細(xì)胞增殖作用的試劑的量，例如，PD-I拮抗劑的量。在另一個(gè)特定的實(shí)施例中，治療有效量是指能改改變主體所患有的疾病的表現(xiàn)和癥狀的PD-I拮抗劑的量，所述疾病例如，能夠通過(guò)增加記憶B細(xì)胞反應(yīng)和/或T細(xì)胞反應(yīng)而改善的疾病。在治療過(guò)程中，試劑的有效劑量，例如，PD-I拮抗劑的有效劑量可以以單一劑量的形式給藥，也可以以多劑量的形式給藥，例如，每日給藥。但是，PD-I拮抗劑的有效劑量還取決于被治療的主體、需要治療的疾病的嚴(yán)重程度和類型、以及給藥方式。這里描述的方法以相同的方式對(duì)人類和動(dòng)物給藥。因此，通用術(shù)語(yǔ)“被治療的主體”應(yīng)該被理解為包括所有需要增加理想的生物學(xué)效果的生物(例如，人、猩猩、狗、貓、馬和牛)，所述生物學(xué)效果例如增加的免疫反應(yīng)。多聚核苷酸術(shù)語(yǔ)多聚核苷酸或核酸序列是指聚合物形式的核苷酸，具有至少10 個(gè)堿基。一種重組多聚核苷酸包括一種多聚核苷酸，這種多聚核苷酸沒(méi)有直接與兩個(gè)編碼序列相連，而在作為其衍生母體的有機(jī)體天然存在的基因組中，這種多聚核苷酸直接與所述編碼序列相連(一個(gè)在5'末端相連，一個(gè)在3'末端相連)。因此所述術(shù)語(yǔ)包括，例如， 一種并入媒介物中的重組DNA ；—種并入自發(fā)復(fù)制的質(zhì)?；蛘卟《局械闹亟MDNA ；或并入原核生物或真核生物基因組DNA中的重組DNA、或并入作為一種獨(dú)立于其他序列的分離的分子(例如，一種互補(bǔ)DNA)而存在的基因組DNA的重組DNA。所述核苷酸可以是核糖核苷酸、 脫氧核糖核苷酸、或者這兩種核苷酸的改良型。該術(shù)語(yǔ)包括單鏈形式的DNA或者雙鏈形式的 DNA。多肽是指任意的氨基酸鏈，無(wú)論其長(zhǎng)度或者翻譯后修飾(例如，糖基化作用或磷酸化作用)。一種多肽的長(zhǎng)度可以在3到30個(gè)氨基酸之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的長(zhǎng)度在大約7到大約25個(gè)氨基酸之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的長(zhǎng)度大約在8到大約10 個(gè)氨基酸之間。在依舊另一個(gè)實(shí)施方案中，肽的長(zhǎng)度大約為9個(gè)氨基酸。關(guān)于多肽，“包括” 是指其他的氨基酸順序或其他的分子可以被包括在所述分子中。“基本上由…組成”是指其他的氨基酸順序不能被包括在所述分子中，但是其他的試劑(例如標(biāo)記物或者化合物)可以被包括，且“由…組成”是指其他的氨基酸順序和其他的試劑都不能包括在所述分子中。增殖作用是指細(xì)胞分化產(chǎn)生子代，增殖作用可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的多種方法測(cè)定。這些方法包括，但不局限于，計(jì)算細(xì)胞總量的實(shí)驗(yàn)、計(jì)算特定細(xì)胞型數(shù)量的實(shí)驗(yàn)、 KI-67實(shí)驗(yàn)、胸腺嘧啶整合、和溴代脫氧尿苷實(shí)驗(yàn)。程序性死亡(PD)-I —種能夠與PD-Ll或者PD-L2蛋白質(zhì)形成一種復(fù)合物的蛋白質(zhì)，其涉及一種免疫反應(yīng)，例如，T細(xì)胞的共刺激作用。通常，PD-I蛋白質(zhì)基本上與天然存在的(野生型)PD-I相同(參見(jiàn)，例如，Ishida et a 1. EMBO J. 11 :3887-3895,1992, Shinohara et al. Genomics 23 =704-706,1994 ；和美國(guó)專利第5，698，520號(hào)，所有文獻(xiàn)通過(guò)引證在此全部并入本文)。在一些實(shí)施例中，PD-I信號(hào)能夠通過(guò)減少T細(xì)胞增殖作用、產(chǎn)生細(xì)胞因子、 或者清除病毒來(lái)減少，例如CD8+T細(xì)胞細(xì)胞毒性。因此，通過(guò)任意標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定可知，與參照水平相比，PD-I多肽能夠?qū)ⅱ?+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性減少至少5 %、10 %、20 %、30 %、40 %、 50%、60%、70%、80%、90%、或者多達(dá) 100%。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)“活性”涉及PD-I多肽或蛋白質(zhì)包括任意天然存在的PD-I蛋白質(zhì)具有的活性，例如，能夠通過(guò)，例如使用位于抗原呈遞細(xì)胞上的天然配位體來(lái)調(diào)整活化的免疫細(xì)胞中的抑制性信號(hào)。這種調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞中的抑制性信號(hào)的作用能夠?qū)е旅庖呒?xì)胞和/或免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的增殖和/或存活率的調(diào)節(jié)。PD-I蛋白質(zhì)還可以通過(guò)與一種結(jié)合B7分子的共刺激受體競(jìng)爭(zhēng)來(lái)調(diào)整共刺激信號(hào)。因此，術(shù)語(yǔ)“PD-1活性”包括PD-I 多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合其天然配位體的能力，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞共刺激或者禁止性信號(hào)的能力，以及調(diào)節(jié)所述免疫反應(yīng)的能力?！皽p少PD-I表達(dá)或活性”是指相對(duì)于參照物中PD-I蛋白質(zhì)的水平或者生物活性， PD-I蛋白質(zhì)的水平或者生物活性下降，所述參照物例如，未經(jīng)處理的主體或樣品。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，相對(duì)于未經(jīng)處理的參照物，所述水平或者活性減少了至少10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，乃至大于 100%。例如，如果 PD-1 蛋白質(zhì)與 PD-L1、PD-12或者二者的結(jié)合減少了，會(huì)導(dǎo)致PD-I蛋白質(zhì)生物活性的減少，從而導(dǎo)致PD-I 信號(hào)的減少，并因此導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞細(xì)胞毒性的增加。"PD-1基因”是一種編碼PD-I蛋白質(zhì)的核酸。PD-I融合基因是一種與一種第二異源核酸序列可操作的連接的PD-I編碼區(qū)域。PD-I融合基因包括PD-I啟動(dòng)子、或可以包括異源啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，第二異源核酸序列是一種報(bào)道基因，那就是說(shuō)，其表達(dá)可以被檢驗(yàn)的基因；報(bào)道基因包括，但不僅限于，編碼葡糖醛酸酶(GUQ的基因、編碼熒光素酶的基因、編碼氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶(CAT)的基因、編碼綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)的基因、編碼堿性磷酸酶的基因、和編碼半乳糖苷酶的基因。樣品(生物學(xué)樣品)包括生物學(xué)樣品，生物學(xué)樣品包括液體、組織、細(xì)胞、及其亞組成部分，例如DNA、RNA和蛋白質(zhì)。例如，在本申請(qǐng)中，常用的樣品包括骨髓、脾臟、淋巴結(jié)、 血液等等，外周血液(還可以包括可以分離出B細(xì)胞或者B細(xì)胞原始粒子的其他來(lái)源，包括尿液，唾液，組織活檢，手術(shù)切除標(biāo)本，細(xì)針穿刺材料，尸檢材料等等)。特異性結(jié)合試劑是指一種基本上只與設(shè)定的靶分子結(jié)合的試劑。因此，PD-I特異性結(jié)合試劑是一種基本上結(jié)合PD-I多肽而不是無(wú)關(guān)多肽的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述特異性結(jié)合試劑是一種能夠特異性的結(jié)合PD-1、PD-Ll或PD-L2多肽的單克隆抗體或多克隆抗體。關(guān)于抗原，例如PD-1，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”是指抗體或者其他的配位體優(yōu)選的與一種含有這種抗原的細(xì)胞或組織完全的或者部分結(jié)合，而不與缺少這種抗原的細(xì)胞或者組織結(jié)合。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，非特異性相互作用的某一程度可能存在于分子或非靶細(xì)胞或組織之間。然而，特異性結(jié)合可以被區(qū)別出來(lái)，由于其是通過(guò)抗原的特異性識(shí)別作用來(lái)調(diào)節(jié)的。雖然有選擇反應(yīng)性的抗體能夠結(jié)合抗原，但是他們的結(jié)合親合力比較低。特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致抗體(或其他的配位體)和含有這種抗原的細(xì)胞之間的結(jié)合作用比抗體(或其他的配位體)和不含有所述抗原的配位體之間的結(jié)合更強(qiáng)壯。與不含有PD-I多肽的細(xì)胞或者組織相比，特異性結(jié)合一般會(huì)導(dǎo)致含有PD-I多肽的細(xì)胞或組織上結(jié)合抗體或其他配位體(每單位時(shí)間)的量增加2倍、例如，增加5倍、增加10倍、或者增加100倍以上。在這種情況下特異性結(jié)合需要一種抗體，這種抗體由于其對(duì)一種特定蛋白質(zhì)的專一性而被選擇出來(lái)。多種免疫試驗(yàn)方式適用于選擇對(duì)特定的蛋白質(zhì)具有特異性免疫活性的抗體或者其他配位體。例如，固-相酶聯(lián)免疫吸附免疫測(cè)定試驗(yàn)(ELISA)是常用的用于選擇對(duì)一種蛋白質(zhì)具有特異性免疫活性的單克隆抗體。參見(jiàn)Harlow & Lane，Antibodies，A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Publications,New York(1988) (Harlow & Lane 等人編寫的 Cold Spring Harbor出版公司，紐約，于1988年出版的“抗體，一種實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”)中的關(guān)于用于確定具體的免疫反應(yīng)性的免疫測(cè)定技術(shù)形式和條件的描述。T細(xì)胞是一種對(duì)免疫反應(yīng)至關(guān)重要的白血細(xì)胞。T細(xì)胞包括，但是不局限于， ⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞。⑶4+T淋巴細(xì)胞是一種免疫細(xì)胞，該免疫細(xì)胞能夠在其表面上攜帶一種標(biāo)記物，所述表面被叫做分化4簇(CD4)。這些細(xì)胞又名輔助性T細(xì)胞，能幫助安排免疫反應(yīng)，包括抗體應(yīng)答以及殺傷性T細(xì)胞反應(yīng)。⑶8+T細(xì)胞攜帶“分化8簇”(⑶8)標(biāo)記物。在一個(gè)實(shí)施方案中，CD8+T細(xì)胞是一種細(xì)胞毒性T細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，CD8+細(xì)胞是一種抑制性T細(xì)胞。當(dāng)T細(xì)胞對(duì)呈遞到抗原呈遞細(xì)胞上的重要的特異性抗原作出反應(yīng)時(shí)，T細(xì)胞被活化。轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞是一種細(xì)胞，在此細(xì)胞中已經(jīng)通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)引入了一種核酸分子。如這里所使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)導(dǎo)”包括所有能夠?qū)⒑怂岱肿右脒@種細(xì)胞的技術(shù)，包括用病毒媒介物轉(zhuǎn)染、與質(zhì)粒媒介物轉(zhuǎn)化、和通過(guò)電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法和加速粒子槍等技術(shù)引入無(wú)保護(hù)的DNA。媒介物是指一種核酸分子通過(guò)被引入宿主細(xì)胞中來(lái)產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)換的宿主細(xì)胞。 媒介物可能包括任意核酸序列，這種核酸序列能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制，例如，作為復(fù)制的起源。媒介物可以包括一種或一種以上編碼可選擇的標(biāo)記物及本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他遺傳因子的核酸。媒介物包括質(zhì)粒媒介物，包括用于表達(dá)革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)粒。實(shí)例性的媒介物包括能夠在大腸桿菌和沙門氏菌中表達(dá)的媒介物，所述媒介物還包括病毒媒介物，例如，但是不局限于，反向病毒、原痘、鳥(niǎo)痘病毒、傳染性上皮瘤病毒、羊痘病毒、suipox、腺病毒、皰疹病毒、α病毒、桿狀病毒、辛德畢斯病毒、牛痘病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒媒介物。除非另有解釋，這里使用的所有科學(xué)技術(shù)術(shù)語(yǔ)都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常的理解具有相同的含義。單數(shù)術(shù)語(yǔ)“一個(gè)(a)”、“一種(an)”也包括復(fù)數(shù)的意思，除非上下文另有清楚的說(shuō)明。同樣，術(shù)語(yǔ)“或者(or)”包括“和0 and”的意思，除非上下文另有清楚的說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員更應(yīng)該理解的是所有的給定的核酸或者多肽的堿基尺寸或氨基酸尺寸，以及分子量或者分子質(zhì)量是近似值，并且只起到描述的作用。盡管與本發(fā)明已經(jīng)描述過(guò)的相似或者相同的方法和材料可以被用于實(shí)現(xiàn)或者檢測(cè)這里所公開(kāi)的發(fā)明，但是下面描述的是適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧稀Ｐg(shù)語(yǔ)“含有(comprise)”是指“包括(include)”。這里提到的所有的出版物、專利申請(qǐng)、專利及其他參考文獻(xiàn)通過(guò)引證在此全部并入本文。如果有沖突的話，以本發(fā)明說(shuō)明書，包括術(shù)語(yǔ)的解釋為準(zhǔn)。另外，所述材料、方法和實(shí)施例只起到說(shuō)明性作用，并不作為一種限制。相關(guān)申請(qǐng)這里公開(kāi)的主題內(nèi)容與2007年12月沈日遞交的PCT申請(qǐng)第PCT/US2007/088851 號(hào)、2005年6月8號(hào)遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/688,872號(hào)、2006年6月8日遞交的美國(guó)實(shí)用新型申請(qǐng)第11/449,919號(hào)和2006年6月8日遞交的PCT申請(qǐng)PCT/USZOOe/^MZS的主題內(nèi)容相關(guān)。該申請(qǐng)還與2006年12月27日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/877，518號(hào)有關(guān)。 前述所用申請(qǐng)通過(guò)弓I證在此全部并入本文。PD-I 拮抗劑
這里公開(kāi)的方法包括PD-I途徑抑制劑(PD-1拮抗劑)的使用。PD-1分子是免疫球蛋白基因總科的成員。人PD-I具有包含免疫球蛋白總科域的細(xì)胞外區(qū)域、橫跨膜域和包括免疫受體酪氨酸基禁止基序(ITIM)的胞內(nèi)區(qū)域((Ishida et al.，EMBO J. 11 =3887,1992 ； Shinohara et al. ,Genomics 23 :704，1994 ；美國(guó)專利第 5，698，520 號(hào))。這些特點(diǎn)也定義了一種分子大族，叫做免疫抑制受體，所述免疫抑制受體還包括gp49B、PIR-B、和殺傷抑制受體(KIRs) (Vivier and Daeron(1997) Immunol. Today 18:286)。不局限于任何理論，人們相信這些受體的酪氨酰磷酸化的ITIM基序能夠與包含磷酸酶Sl 12-區(qū)域相互作用，這會(huì)導(dǎo)致抑制信號(hào)。這些免疫抑制受體的子集與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子相結(jié)合，例如，殺傷抑制受體(KIRs)和CTLA4與B7-1和B7-2結(jié)合。在人體中，PD-I是一種50_55kDa的I型橫跨膜受體，最初在經(jīng)過(guò)活化作用導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的T細(xì)胞株中識(shí)別。PD-I在T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達(dá)。PD-I的配位體是 B7族成員PD-配位體1 (PD-L1，又名B7-H1)和PD-L2 (又名B7-DC)。在活體內(nèi)，PD-I在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞上表達(dá)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明PD-I 與它的配位體在中樞免疫反應(yīng)和外周免疫反應(yīng)的下游調(diào)節(jié)作用下發(fā)生相互作用。特別是在野生型T細(xì)胞而不是在PD-I缺乏型T細(xì)胞中的增值在在有PD-Ll參與的情況下被抑制。另外，PD-I-缺陷型老鼠表現(xiàn)出一種自身免疫表型。人PD-I的示范性的氨基酸順序如下所述(還是參見(jiàn)Ishida et al.，EMBO J. 11 3887，1992 ；Shinohara et al.，Genomics 23 :704，1994 ；美國(guó)專利第 5，698，520 號(hào))
0160]mqipqapwpv vwavlqlgwr ρgwfldspdrpwnpptffpa0161]llvvtegdna tftcsfsnts esfvlnwyrmspsnqtdkla0162]afpedrsqpg qdcrfrvtql pngrdfhmsvvrarrndsgt0163]ylcgaislap kaqikeslra elrvterraevptahpspsp0164]rpagqfqtlv vgvvggllgs lvllvwvlavicsraargti0165]garrtgqplk edpsavpvfs vdygeldfqwrektpeppvp0166]cvpeqteyat ivfpsgmgts sparrgsadgprsaqplrpe0167]dghcswpl(SEQ ID NO :1)0168]老鼠PD-I的示范性的氨基酸順序如下所述0169]mwvrqvpwsf twavlqlswq sgwllevpngpwrsltfypa0170]wltvsegana tftcslsnws edlmlnwnrlspsnqtekqa0171]afcnglsqpv qdarfqiiql pnrhdfhmnildtrrndsgi0172]ylcgaislhp kakieespga elvvteriletstrypspsp0173]kpegrfqgmv igimsalvgi pvllllawalavfcstsmse0174]argagskddt lkeepsaapv psvayeeldfqgrektpelp0175]tacvhteyat ivfteglgas amgrrgsadglqgprpprhe0176]dghcswpl(SEQ ID NO :2)0177]其他氨基酸序列公幵在美國(guó)專利第6，808，710號(hào)和美國(guó)專利申請(qǐng)公幵號(hào)
2004/0137577、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0232323、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0166531、 美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0064380、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0044768、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0039653、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2002/0164600、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2002/0160000、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2002/0110836、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2002/0107363、 和美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2002/0106730中，這些專利或?qū)＠暾?qǐng)?jiān)诖送ㄟ^(guò)引證并入本文。 PD-I是免疫球蛋白(Ig)總科的成員，在它的細(xì)胞外區(qū)域包含單個(gè)Ig V樣區(qū)域。PD-I的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域包含兩個(gè)酪氨酸，其中與細(xì)胞膜最接近的酪氨酸(在老鼠PD-I中是VAYEEL(參見(jiàn) SEQ ID NO :2的氨基酸223-228))位于ITIM(免疫受體酪氨酸基抑制基序)內(nèi)部。PD-I上免疫受體酪氨酸基抑制基序(ITIM)的存在表明該分子具有通過(guò)補(bǔ)充細(xì)胞質(zhì)磷酸酶減弱抗原受體信號(hào)的功能。人和鼠PD-I蛋白質(zhì)具有大概60%的氨基酸一致性，帶有四個(gè)潛在的 N-糖基化作用地點(diǎn)的保守區(qū)域和定義Ig-V區(qū)域的殘基。在人和老鼠的進(jìn)化同源基因之間， 細(xì)胞質(zhì)區(qū)域中的免疫受體酪氨酸基抑制基序(ITIM)和在羧基末端酪氨酸(在人和老鼠中分別為TEYATI (參見(jiàn)SEQ ID NO :2中的氨基酸166-181))周圍的免疫受體酪氨酸基抑制基序(ITIM)樣基序具有保守性。根據(jù)其結(jié)合PD-I的能力，PD-I是分子族的成員。在活體內(nèi)，類 CTLA4、PD-1作為抗-CD3的響應(yīng)快速的生成在T細(xì)胞表面上(Agata et al. Int. Immunol. 8 765，1996)。然而，與CTLA4相反，PD-I還產(chǎn)生在B細(xì)胞的表面上(作為對(duì)抗_免疫球蛋白M的應(yīng)答)。PD-I還表達(dá)在胸腺細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的子集上(Agata et al. (1996) supra； Nishimura et al. (1996)Int. Immunol. 8 :773)。T細(xì)胞的無(wú)反應(yīng)性伴隨有PD-I表達(dá)的相互影響。這里公開(kāi)了 T細(xì)胞的細(xì)胞毒性可以通過(guò)將T細(xì)胞與一種能夠減少PD-I表達(dá)或者活性的試劑相接觸來(lái)增加。更準(zhǔn)確的說(shuō)，這里公開(kāi)了能夠用于減少PD-I表達(dá)或者活性的試劑可以用于增加免疫反應(yīng)，使之達(dá)到一種病毒抗原或腫瘤抗原的程度。不局限于任何理論，PD-I表達(dá)或活性的減少會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性的增加， 并同事會(huì)增加其對(duì)傳染性試劑的特異性免疫應(yīng)答。為了使T細(xì)胞對(duì)外源蛋白做出反應(yīng)，必須通過(guò)抗原-呈遞細(xì)胞(APC)提供兩種信號(hào)從而支撐T淋巴細(xì)胞。第一種信號(hào)賦予免疫反應(yīng)特異性，在識(shí)別出存在于主要組織相容性復(fù)合體(MHC)中的外源抗原肽之后，該信號(hào)通過(guò)T細(xì)胞受體(TCR)被轉(zhuǎn)導(dǎo)。第二種信號(hào)叫做共刺激作用，導(dǎo)致T細(xì)胞增殖并具有功能性。 共刺激作用既不具有抗原特異性又不具有主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制，可以通過(guò)一種或一種以上抗原-呈遞細(xì)胞(APC)表達(dá)的不同的細(xì)胞表面多肽來(lái)提供。如果T細(xì)胞只通過(guò)T細(xì)胞受體被刺激且沒(méi)有收到其他的共刺激信號(hào)的話，他們會(huì)變得無(wú)反應(yīng)、無(wú)活動(dòng)力或死亡，從而導(dǎo)致免疫反應(yīng)下調(diào)。在抗原-呈遞細(xì)胞(APC)上表達(dá)的⑶80(B7-1)和⑶86 ￠7- 蛋白質(zhì)是至關(guān)重要的共刺激性多肽。盡管B7-2在最初的免疫響應(yīng)期間起到了突出的作用，B7-1在免疫反應(yīng)后期被上調(diào)從而延長(zhǎng)最初的T細(xì)胞響應(yīng)或者共刺激次要的T細(xì)胞響應(yīng)。B7多肽能夠向免疫細(xì)胞提供共刺激信號(hào)或抑制性信號(hào)，從而促進(jìn)或抑制免疫細(xì)胞響應(yīng)。例如，當(dāng)與共刺激受體結(jié)合時(shí)，PD-Ll (B7-4)當(dāng)以可溶形式存在時(shí)會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞的共刺激作用或抑制免疫細(xì)胞共刺激作用。當(dāng)與一種抑制性受體結(jié)合時(shí)，PD-Ll分子可以向免疫細(xì)胞傳播一種抑制性信號(hào)。示范性的B7族成員包括B7-1、B7-2、B7-3 (通過(guò)抗體BB-I識(shí)別)、B7h (PD-Ll)、和 B7-4及其可溶解的片段或者衍生物。B7族成員在免疫細(xì)胞上結(jié)合一種或一種以上受體，例如CTLA4、⑶觀、I COS, PD-I和/或其他的受體，并且，根據(jù)不同的受體，B7族成員具有向免疫細(xì)胞傳播抑制性信號(hào)或共刺激信號(hào)的能力。
⑶觀是一種受體，可以在休眠T細(xì)胞上組成性表達(dá)。在信號(hào)通過(guò)T細(xì)胞受體之后， ⑶觀的連接和共刺激信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致IL-2的增殖和分泌。CTLA4 (⑶15 是與⑶觀相同的受體，在休眠T細(xì)胞中CTLA4是缺失的，但是在T細(xì)胞活化之后會(huì)導(dǎo)致他的表達(dá)。CTLA4 在T細(xì)胞響應(yīng)負(fù)調(diào)節(jié)中起到重要作用。ICOS是一種與⑶觀和CTLA4有關(guān)系的多肽，其包含在IL-10的生產(chǎn)過(guò)程中。PD-I是能夠結(jié)合PD-Ll和PD-L2的受體，他能夠快速地在T細(xì)胞表面上誘導(dǎo)。PD-I還可以在B細(xì)胞的表面上被表達(dá)(作為抗免疫球蛋白M的響應(yīng))并且能夠在胸腺細(xì)胞子集和骨髓細(xì)胞上被表達(dá)。PD-I的接合(例如通過(guò)交聯(lián)或通過(guò)聚集作用)會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞中抑制信號(hào)的傳輸，從而導(dǎo)致免疫響應(yīng)的減少同時(shí)伴隨免疫細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性的增加。PD-I族成員在抗原呈遞細(xì)胞上結(jié)合一種或一種以上受體，例如PD-Ll和PD-L2。PD-Ll和PD-L2都是人PD-I配位體多肽，是B7族多肽的成員(參見(jiàn)上面)。每個(gè)PD-I配位體都包含一種信號(hào)序列、一種IgV 區(qū)域、一種IgC區(qū)域、一種橫跨膜區(qū)域和一種短細(xì)胞質(zhì)尾部。在活體內(nèi)，這些配位體已經(jīng)被證明能夠在胎盤、脾、淋巴結(jié)、胸腺和心臟中表達(dá)。PD-L2還可以在胰腺、肺和肝中被表達(dá)，而 PD-Ll可以在胎兒的肝、活化的T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。PD-I的兩個(gè)配位體再活化的單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞中被表達(dá)。PD-Ll示范性的氨基酸序列(2000年10月4號(hào)生效的GENBANK基因銀行登記號(hào) AAG18508)在下面進(jìn)行了闡述
0185]mrifavfifm tywhllnaft vtvpkdlyvv eygsnmtiec
0186]kfpvekqldl aalivyweme dkniiqfvhg eedlkvqhss
0187]yrqrarllkd qlslgnaalq itdvklqdag vyrcmisygg
0188]adykritvkv napynkinqr ilvvdpvtse heltcqaegy
0189]pkaeviwtss dhqvlsgktt ttnskreekl fnvtstlrin
0190]tttneifyct frrldpeenh taelvipelp lahppnerth
0191]lvilgaillc lgvaltfifr lrkgrmmdvk kcgiqdtnsk
0192]kqsdthleet(SEQ ID NO :3)
0193]一種示范性PD-L2前體氨基酸序列(2002年4月8號(hào)生效的GENBANK基因銀行登記號(hào)AAK15370)在下面進(jìn)行了闡述
0194]mifIllmlsl elqlhqiaal ftvtvpkely iiehgsnvtl
0195]ecnfdtgshv nlgaitaslq kvendtsphr eratlleeql
0196]plgkasfhip qvqvrdegqy qciiiygvaw dykyltlkvk
0197]asyrkinthi lkvpetdeve ltcqatgypl aevswpnvsv
0198]pantshsrtp eglyqvtsvl rlkpppgrnf scvfwnthvr
0199]eltlasidlq sqmeprthpt wllhifipse iiafifiatv
0200]ialrkqlcqk lysskdttkr pvtttkrevn sai(SEQ ID NO 4)
0201]一種示范性PD-L2前體氨基酸序列(2006年12月12號(hào)生效的GENBANK基因銀行登記號(hào)Q9BQ51)在下面進(jìn)行了闡述
0202]mifIllmlsl elqlhqiaal ftvtvpkely iiehgsnvtl
0203]ecnfdtgshv nlgaitaslq kvendtsphr eratlleeql
0204]plgkasfhip qvqvrdegqy qciiiygvaw dykyltlkvk
asyrkinthi lkvpetdeve ltcqatgypl aevswpnvsvpantshsrtp eglyqvtsvl rlkpppgrnf scvfwnthvreltlasidlq sqmeprthpt wllhifipfc iiafifiatvialrkqlcqk lysskdttkr pvtttkrevn sai(SEQ ID NO :46)PD-I拮抗劑包括能夠減少PD配位體1 (PD-Ll)或者PD配位體2 (PD-L2)表達(dá)或者活性的試劑或者能夠減少PD-I和PD-Ll之間相互作用或減少PD-I和PD-L2之間相互作用的試劑。示范性化合物包括抗體(例如一種抗PD-I抗體、一種抗-PD-Ll抗體和一種抗-PD-L2抗體)、RNAi分子(例如抗PD-I RNAi分子、抗PD-LlRNAi、和抗PD_L2RNAi)、反義分子(例如抗PD-I反義RNA、抗PD-Ll反義RNA、和抗PD-L2反義RNA)、顯性負(fù)蛋白質(zhì)(例如一種顯性負(fù)PD-I蛋白質(zhì)、一種顯性負(fù)PD-Ll蛋白質(zhì)、和一種顯性負(fù)PD-L2蛋白質(zhì))、和小分子抑制劑。PD-I拮抗劑是指任意能夠減少細(xì)胞中PD-I表達(dá)或者活性的試劑。與參照物中的表達(dá)及活性相比，PD-I表達(dá)或者活性被減少了大約10%,20%,30%,40%,50%,60%, 70%、80%、90%、或100%?；钚苑矫媸痉缎缘臏p少了至少大約50%、至少大約60%、至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、至少大約95%、或完全沒(méi)有可檢測(cè)到的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，所述對(duì)照物是沒(méi)有被PD-I拮抗劑處理的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述對(duì)照物是一種標(biāo)準(zhǔn)值，或者用一種已知不會(huì)影響PD-I活性的試劑，例如載體，處理后的細(xì)胞。 PD-I的表達(dá)或活性可以通過(guò)任何本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法來(lái)確定，包括這里所描述的方法。任選的，PD-I拮抗劑抑制或減少PD-I與PD-L1、PD-L2或二者的結(jié)合。A.抗體這里公開(kāi)的方法中使用了能夠特異性結(jié)合PD-1、PD_L1或PD_L2(或其聯(lián)合)的抗體?？贵w包括單克隆抗體、人源化抗體去免疫抗體、和免疫球蛋白(Ig)融合蛋白。多克隆的抗-PD-I、抗PDLl或PD-L2抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法來(lái)制備，例如，通過(guò)用PD-I配位體或者PD-I免疫原免疫適當(dāng)?shù)闹黧w(例如，動(dòng)物主體)、抗-PD-1、抗-PD-Ll或抗-PD-L2 抗體在免疫主體中的滴定值可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，例如使PD-I配位體或PD-I 多肽固定進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，特異性結(jié)合PD-I、PD-Ll或者PD-L2 (或其結(jié)合)的抗體分子可以從哺乳動(dòng)物(例如，從血清中)分離出來(lái)，并使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行純化，例如，抗體可以通過(guò)使用蛋白質(zhì)A色層分離法進(jìn)行純化從而產(chǎn)生分離的免疫球蛋白 G(IgG)抗體。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可以從主體處獲得，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)制備單克隆抗體(參 JAL Kohler and Milstein Nature 256 495 49,1995 ；Brown et al. , J. Immunol. ( ^1 學(xué))127 :539 46,1981 ；Cole et al. , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (單克隆抗體和癌癥治療)，Alan R. Liss, Inc.，pp. 77 96，1985 ；Gefter, Μ. L. et al. (1977) Somatic Cell Genet.3 :231 36 ；Kenneth, R. H. in Monoclonal Antibodies :A New Dimension In Biological Analyses (在單克隆抗體中一種生物學(xué)分析的新尺度).Plenum Publishing Corp. , New York, N. Y. (1980) ；Kozbor et al. Immunol. Today 4 :72,1983 ；Lerner, Ε. Α. (1981) Yale J. Biol. Med. 54 :387 402 ；Yeh et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. 76 :2927 31,1976).在一個(gè)實(shí)施例中，將永生的細(xì)胞株(一般是骨髓瘤細(xì)胞株)融合到淋巴細(xì)胞(通常是脾細(xì)胞)中，所述淋巴細(xì)胞是從用PD-1、PD-L1或PD-L2免疫的哺乳動(dòng)物中獲得的，且，所得雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液被篩選來(lái)識(shí)別能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合所關(guān)心多肽的單克隆抗體的雜交瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了產(chǎn)生雜交瘤，從獲得淋巴細(xì)胞的相同的哺乳動(dòng)物種中獲得永生的細(xì)胞株(例如骨髓瘤細(xì)胞株)。例如，可以通過(guò)將用PD-1、PD-L1或PD-L2肽免疫的老鼠中的淋巴細(xì)胞與一種永生的老鼠細(xì)胞株相融合來(lái)制備鼠科雜交瘤。在一個(gè)實(shí)施例中，使用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株對(duì)包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基(“HAT培養(yǎng)基")敏感。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，任意大量的骨髓瘤細(xì)胞系都可以用作融合配體，包括，例如， P3-NSl/l-Ag4-l、P3-x63-Ag8. 653或Sp2/0_Agl4骨髓瘤細(xì)胞系，這些細(xì)胞系可以從位于 R0Ckville，Md的美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC)處獲得。HAT-敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞可以使用聚乙二醇(“PEG”)被融合到老鼠脾細(xì)胞中。融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞隨后使用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，HAT培養(yǎng)基能夠殺死未融合的(已經(jīng)非生產(chǎn)性融合的)骨髓瘤細(xì)胞。產(chǎn)生所關(guān)心的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可以通過(guò)，例如，篩選雜交瘤培養(yǎng)物上清液來(lái)檢測(cè)，從而通過(guò)使用免疫試驗(yàn)(例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試驗(yàn)(ELISA)或放射免疫測(cè)定法(RIA)測(cè)定能夠結(jié)合PD-1、PD-L 1或PD-L2分子的抗體的生成。作為可以替換的方法，為了制備隱藏單克隆抗體的雜交瘤，通過(guò)用PD-1、PD-Ll或 PD-L2篩選重組組合的免疫球蛋白文庫(kù)(例如一種抗體噬菌體展示文庫(kù))從而分離免疫球蛋白文庫(kù)中能夠忒一些結(jié)合所述多肽的成員，來(lái)識(shí)別和分離能夠特異性結(jié)合PD-1、PD-Ll 或PD-L2的單克隆抗體。用于產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫(kù)的試劑盒是可以商業(yè)購(gòu)得的(例如，但不僅限于，Pharmacia公司和Mratagene公司)。尤其可以有效的用于生產(chǎn)和篩選抗體展示文庫(kù)的方法和試劑的實(shí)施例可以在例如，美國(guó)專利第5，223，409號(hào)；PCT公開(kāi)號(hào)WO 90/(^809 ;PCT
發(fā)明者G·弗里曼, K·蒂坦吉, R·阿梅德, R·阿瑪拉, V·韋露 申請(qǐng)人:埃默里大學(xué), 達(dá)納-法伯癌癥研究院有限公司